QUANTA Lite TM Celiac DGP Screen Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata

Transcript

1 QUANTA Lite TM Celiac DGP Screen Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata Finalità d uso Il test QUANTA Lite TM Celiac DGP Screen per lo screening della celiachia è un test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) per la determinazione semiquantitativa degli anticorpi IgA e IgG contro peptidi sintetici deamidati derivati dalla gliadina nel siero umano. La presenza di questi anticorpi deamidati può essere usata unitamente ai risultati clinici e ad altri test di laboratorio per agevolare la diagnosi della celiachia con o senza deficit di IgA nonché della dermatite herpetiforme. Riassunto e Spiegazione del test La malattia celiaca o enteropatia sensibile al glutine è una condizione cronica i cui sintomi principali comprendono infiammazione ed un caratteristico appiattimento istologico della mucosa intestinale con conseguente sindrome da malassorbimento. L eziologia esatta di questa malattia rimane sconosciuta ma la gliadina, o la frazione solubile in alcool del glutine di grano rappresenta chiaramente l agente tossico. 1 Originariamente, per diagnosticare la celiachia e le patologie correlate venivano eseguite una serie di biopsie intestinali multiple. Negli ultimi anni è stato consigliato di utilizzare dei test sierologici per lo screening dei pazienti con sospetta enteropatia sensibile al glutine come pure per controllare la corretta osservanza delle regole dietetica. 2-5 La European Society of Pediatric Gastroenterology and Nutrition (ESPGAN) ha raccomandato l uso di marker sierologici come la presenza di anticorpi anti-gliadina come pure anti-reticolina ed anti-endomisio per ridurre il numero di biopsie intestinali necessarie per la diagnosi. 6 Recenti studi hanno rilevato che gli anticorpi reattivi alla gliadina di pazienti celiaci si legano ad un numero molto limitato di epitopi specifici sulla molecola di gliadina. 7,8 Questi stessi studi rilevano inoltre che la deamidazione selettiva della gliadina da parte dell'enzima celiaco associato, la transglutaminasi tissutale, implica un legame rafforzato da parte degli anticorpi antigliadina. Sulla base di queste osservazioni, i test in cui vengono utilizzati peptidi deamidati e definiti hanno dimostrato una accuratezza diagnostica superiore per la celiachia rispetto ai test antigliadina e ttg standard. 9,10,11 Nel siero dei pazienti affetti da enteropatia sensibile al glutine vengono rilevati anticorpi anti-gliadina sia della classe IgA sia della classe IgG. 2,3 Una sensibile strategia di screening della popolazione a rischio comprende test sia per le IgG sia per le IgA poichè una porzione significativa della popolazione di pazienti con malattia celiaca non produce IgA. 12 Gli anticorpi anti-gliadina della classe IgA sono interessanti per seguire nel tempo l andamento della malattia e per monitorare l osservanza della dieta priva di glutine. 5 La dermatite herpetiforme (DH) è una malattia della pelle che, come la celiachia, è causata dall ingestione di glutine di grano. La maggior parte dei pazienti con DH presenta atrofia dei villi del digiuno identica a quella riscontrata nella celiachia e una dieta rigida priva di glutine determina un miglioramento delle lesioni sia intestinali sia cutanee. 13, 14 Gli attuali metodi sierologici come i test EMA e ttg evidenziano prestazioni deludenti quando usati per la DH, con sensibilità che variano dal 60 al 75% 15,16 rispetto alle sensibilità pari al 95% e superiori riferite per la celiachia. Il test QUANTA Lite TM Celiac DGP Screen è un test con prestazioni migliori per la determinazione simultanea degli anticorpi IgA e IgG contro un peptide sintetico selettivamente deamidato derivato dalla gliadina del glutine del grano e come tale consente la determinazione della celiachia persino con coesistente deficit di IgA. Principio della Metodica I peptidi di gliadina purificata sintetico si legano nei pozzetti di una piastra di micropozzetti di polistirene in condizioni che consentono la conservazione dell antigene al suo stato nativo. I controlli pre-diluiti ed i sieri diluiti dei pazienti vengono distribuiti nei pozzetti corrispondenti, consentendo agli anticorpi anti-gliadina della classe peptide IgA o IgG eventualmente presenti di legarsi all antigene adsorbito. L eccesso di campione non legato viene allontanato mediante il lavaggio e successivamente si aggiunge a ciascun pozzetto un anticorpo anti-iga e IgG umane marcato con un enzima. Una seconda incubazione consente agli anticorpi anti-iga e/o IgG umane marcati con l enzima di legarsi agli anticorpi del paziente che si sono eventualmente legati alla parete dei pozzetti. Dopo ulteriore lavaggio per allontanare l eccesso di anticorpi anti-iga e/o IgG umane marcati con l enzima, l attività dell enzima rimasto viene misurata aggiungendo un substrato cromogenico e misurando l intensità del colore che si sviluppa. Il test può essere letto mediante uno spettrofotometro ed interpretato confrontando l intensità del colore che si sviluppa nei pozzetti dei campioni con quella dei pozzetti dei controlli. Reagenti 1. Piastra ELISA di micropozzetti di polistirene rivestita con peptidi di gliadina purificata (12-1 x 8 pozzetti), con supporto, in busta chiusa contenente materiale essicante 2. Controllo ELISA Negativo, 1 flacone di tampone contenente conservante e siero umano senza anticorpi umani anti-gliadina peptidi della classe IgA o IgG, prediluito, 1,2mL 3. Controllo ELISA fortemente positivo per Celiac DGP Screen 1 fiala di tampone contenente conservante e anticorpi IgA e IgG del siero umano contro peptidi della gliadina, prediluito, 1,2mL 4. Controllo ELISA debolmente positivo per Celiac DGP Screen, 1 fiala di tampone contenente conservante e anticorpi IgA e IgG del siero umano contro peptidi della gliadina, prediluito, 1,2mL 5. Diluente per campioni HRP, 1 flacone di colore rosa contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris, Tween 20, stabilizzatori delle proteine e conservante, 50mL 6. Soluzione di lavaggio HRP Concentrata, 1 flacone di soluzione concentrata 40x di colore rosso contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris e Tween 20, 25mL. Vedi la Sezione Metodi per le istruzioni sulla diluizione. 1

2 7. Coniugato HRP Ig G/A, (montone), anti-igg e IgA umane, 1 flacone incolore contenente tampone, stabilizzatori delle proteine e conservante, 10mL 8. Cromogeno TMB, 1 flacone contenente stabilizzatori, 10mL 9. Soluzione di arresto HRP, Acido solforico 0,344M, 1 flacone incolore, 10mL Avvertenze 1. ATTENZIONE: Questo prodotto contiene un composto chimico (cloramfenicolo allo 0,02%) nel diluente per i campioni, nei controlli e nel coniugato, noto allo Stato della California come causa di tumori. 2. Tutte le fonti umane di materiali usati nella preparazione dei controlli per questo prodotto sono state testate e sono risultate negative per la presenza di anticorpi anti-hiv, per HBsAg e per anticorpi anti- HCV mediante metodi approvati dall FDA. Tuttavia nessun test offre le certezza completa dell assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i Controlli ELISA fortemente positivo, ELISA debolmente positivo ed ELISA Negativo devono essere maneggiati come materiali potenzialmente infettivi La sodio azide è usata come conservante. La sodio azide è un veleno e può essere tossica se ingerita o assorbita attraverso la cute o gli occhi. La sodio azide può reagire con le tubature di piombo o rame formando azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lasciar scorrere grandi quantità di acqua, se si usa un lavandino per eliminare i reagenti, per prevenire la formazione di azidi. 4. Il Coniugato HRP contiene un composto chimico velenoso/corrosivo, che può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. 5. Il Cromogeno TMB contiene un irritante, che può essere dannoso se inalato, ingerito o assorbito attraverso la cute. Per prevenire lesioni, evitare l inalazione, l ingestione o il contatto con la cute e con gli occhi. 6. La Soluzione di arresto HRP è costituita da una soluzione di acido solforico diluito. Evitare l esposizione a basi, metalli o altri composti che possono reagire con gli acidi. L acido solforico è velenoso e corrosivo e può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. 7. Usare appropriati indumenti personali protettivi mentre si lavora con i reagenti forniti. 8. I reagenti eventualemente rovesciati devono essere rimossi immediatamente. Seguire tutte le normative vigenti in materia di eliminazione dei residui di natura chimica. Precauzioni 1. Questo prodotto è stato messo a punto per l uso diagnostico In Vitro. 2. La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel kit può causare risultati non attendibili. 3. Un lavaggio incompleto o non efficiente e l insufficiente aspirazione del liquido dai pozzetti ELISA può causare una scarsa precisione e/o un elevato background. 4. L adattamento di questo test all uso con apparecchiature automatiche e altri dispositivi per trattamento dei campioni liquidi, in toto o in parte, può causare differenze nei risultati rispetto a quelli ottenuti mediante la procedura manuale. E responsabilità di ciascun Laboratorio confermare che le procedure automatizzate utilizzate diano risultati entro limiti di accettabilità. 5. Una serie di fattori influenza le prestazioni del test. Essi comprendono l iniziale temperatura dei reagenti, la temperatura dell ambiente, l accuratezza e la riproducibilità della tecnica di pipettamento, la scrupolosità delle operazioni di lavaggio e di aspirazione del liquido dai pozzetti delle ELISA, il tipo di spettrofotometro usato per leggere i risultati e la lunghezza dei tempi di incubazione durante l esecuzione del test. Bisogna prestare molta attenzione alla costanza per ottenere risultati accurati e riproducibili. 6. Si raccomanda di attenersi scrupolosamente alle istruzioni fornite. 7. Una chiusura incompleta della busta richiudibile contenente le strisce di pozzetti ed il materiale essicante causa la degradazione dell antigene ed una scarsa precisione nei risultati. 8. Valori di assorbanza inaccettabilmente bassi possono essere osservati dopo aver usato due o più volte lo stesso flacone di coniugato HRP per un certo periodo di tempo. E importante seguire attentamente le istruzioni fornite per il trattamento del coniugato HRP per evitare tale inconveniente. 9. Un eventuale contaminazione chimica del coniugato HRP può essere conseguenza di una impropria pulizia o risciacquo di apparecchi o di strumenti. Residui di comuni reagenti chimici di laboratorio quali formalina, candeggina, etanolo o detergenti causano la degradazione nel tempo del coniugato HRP. Risciacquare molto accuratamente tutti gli apparecchi e gli strumenti dopo l uso di detergenti chimici. Condizioni di conservazione 1. Conservare tutti i reagenti del kit a 2-8 C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza se conservati e trattati seguendo le istruzioni fornite. 2. Le strisce di pozzetti non utilizzate devono essere rimesse immediatamente nella busta richiudibile contenente il materiale essicante e conservate nella busta ben chiusa a 2-8 C. 3. Il tampone di lavaggio diluito è stabile per 1 settimana a 2-8 C. Raccolta dei campioni Questa tecnica deve essere usata con un campione di siero. L aggiunta al campione di sodio azide o di altri conservanti può influenzare in modo negativo i risultati. Campioni con segni di contaminazione microbica, trattati con calore o contenenti particelle visibili non dovrebbero essere usati. Si dovrebbe evitare anche l uso di sieri fortemente emolizzati o lipemici. Dopo il prelievo, il siero dovrebbe essere separato dal coagulo. Il Documento H18-A3 dell CLSI (NCCLS) raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) conservare i campioni a temperatura 2

3 ambiente per non più di 8 ore; 2) se il test non può essere eseguito entro 8 ore, conservare i campioni in frigorifero a 2-8 C; 3) se il test non può essere eseguito entro 48 ore, oppure per la spedizione dei campioni, congelare a -20 C. I campioni congelati devono essere mescolati bene dopo lo scongelamento e prima di essere testati. 18 Procedura Materiali forniti 1 Piastra microtiter ELISA Celiac DGP Screen (12-1 x 8 pozzetti), con supporto 1 1,2mL Controllo ELISA Negativo prediluito 1 1,2mL Controllo ELISA debolmente positivo Celiac DGP Screen prediluito 1 1,2mL Controllo ELISA fortemente positivo Celiac DGP Screen prediluito 1 50mL Diluente per campioni HRP 1 25mL Soluzione di lavaggio HRP concentrata, 40x concentrata 1 10mL Coniugato HRP Ig G/A, (montone), anti-igg e IgA umane 1 10mL Cromogeno TMB 1 10mL Soluzione di arresto HRP, 0,344M Acido solforico Materiali richiesti ma non forniti Micropipette in grado di erogare volume di 5, 100, e 500µL Puntali monouso per micropipette Provette per la diluizione dei sieri, volume 4mL Acqua distillata o deionizzata Beuta da 1L per diluire la Soluzione di lavaggio HRP concentrata Lettore per piastre ELISA in grado di leggere a 450nm (e 620nm per le letture a doppia lunghezza d onda) Metodica Prima di incominciare 1. Portare tutti i reagenti ed i campioni a temperatura ambiente ( o C) e mescolarli bene. 2. Diluire la Soluzione di lavaggio HRP concentrata 1:40 aggiungendo il contenuto del flacone fornito con il kit a 975mL di acqua distillata o deionizzata. Se non si usa l intera piastra in una sola volta, si può preparare una minore quantità di soluzione di lavaggio aggiungendo 2,0mL di concentrato a 78mL di acqua distillata o deionizzata ogni 16 pozzetti utilizzati. La soluzione di lavaggio diluita è stabile per 1 settimana a 2-8 o C. 3. Preparare una diluizione 1:101 di ciascun campione da testare aggiungendo 5µL di siero a 500µL di Diluente per campioni HRP. I campioni diluiti devono essere testati entro 8 ore dalla preparazione. NON DILUIRE i Controllo ELISA debolmente positivo Celiac DGP Screen, ELISA fortemente positivo Celiac DGP Screen ed ELISA Negativo. 4. La determinazione della presenza o dell assenza di anticorpi anti-gliadina della classe IgG e/o IgA usando unità arbitrarie richiede due pozzetti per ciascuno dei tre controlli ed uno o due pozzetti per ciascun campione clinico. Si raccomanda di testare i campioni in duplicato. Esecuzione del test 1. TUTTI I REAGENTI DEVONO ESSERE PORTATI A TEMPERATURA AMBIENTE (20-26 C) PRIMA DI INIZIARE IL TEST. Posizionare i pozzetti/le strisce necessarie nel supporto. Rimettere immediatamente le strisce inutilizzate nella busta contenente il materiale essicante e sigillarla bene per minimizzare l esposizione all umidità ambientale. 2. Distribuire 100µL dei Controllo ELISA debolmente positivo Celiac DGP Screen, ELISA fortemente positivo Celiac DGP Screen ed ELISA Negativo prediluiti e dei sieri diluiti nei rispettivi pozzetti. Coprire i pozzetti ed incubare per 30 minuti a temperatura ambiente su una superficie piana. Il tempo di incubazione inizia dopo l aggiunta dell ultimo campione. 3. Lavaggio: Aspirare completamente il contenuto di ciascun pozzetto. Distribuire µL di soluzione di lavaggio HRP diluita in tutti i pozzetti e quindi aspirarla. Ripetere questa operazione per altre due volte, per un totale di tre lavaggi. Dopo l ultimo lavaggio capovolgere la piastra e scuoterla fermamente su tovaglioli di carta assorbente per rimuovere eventuali residui di liquido. E importante vuotare completamente ciascun pozzetto dopo ciascun lavaggio. Per l aspirazione mantenere la stessa sequenza usata per l aggiunta dei campioni. 4. Distribuire 100μL di Coniugato HRP Ig G/A in ciascun pozzetto. Il coniugato dovrebbe essere prelevato dal flacone mediante tecniche sterili. Prelevare dal flacone solo la quantità di coniugato necessaria per l esecuzione del test. PER EVITARE POSSIBILI CONTAMINAZIONI MICROBICHE E/O CHIMICHE, NON RIMETTERE MAI IL CONIUGATO INUTILIZZATO NEL FLACONE. Incubare i pozzetti per 30 minuti come descritto al punto Lavaggio: Ripetere la procedura descritta la punto Distribuire 100µL di Cromogeno TMB in ciascun pozzetto ed incubare al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. 7. Distribuire 100µL di Soluzione di arresto HRP in ogni pozzetto. Per l aggiunta della Soluzione di arresto HRP mantenere la stessa sequenza e gli stessi tempi utilizzati per l aggiunta del Cromogeno TMB. Agitare gentilmente la piastra con le dita per mescolare completamente i reagenti nei pozzetti. 8. Leggere l assorbanza (OD) di ciascun pozzetto a 450nm entro 1 ora dall aggiunta della soluzione di arresto. Se si preferisce una lettura a doppia lunghezza d onda, si può usare la lunghezza d onda di 620nm come riferimento. Controllo di qualità 1. I Controlli ELISA debolmente positivo Celiac DGP Screen, ELISA fortemente positivo Celiac DGP 3

4 Screen ed ELISA Negativo devono essere inclusi ogni volta che si esegue il test per assicurare che tutti i reagenti ed il test funzionino in modo corretto. 2. Si deve notare che poichè i Controlli ELISA debolmente positivo Celiac DGP Screen, ELISA fortemente positivo Celiac DGP Screen II ed ELISA Negativo sono prediluiti, essi non rappresentano un controllo procedurale per le tecniche di diluizione utilizzate per i campioni. 3. Ulteriori controlli possono essere inclusi in base alle indicazioni o alle richieste delle vigenti regolamentazioni o delle organizzazioni di accreditamento. Ulteriori sieri di controllo possono essere preparati raccogliendo in un pool dei sieri umani, aliquotandolo e conservandolo a < -20 C. 4. Perchè i risultati del test siano considerati validi, tutti i seguenti criteri devono essere soddisfatti. Se anche uno solo non rientra nei valori specificati, i risultati non dovrebbero essere considerati validi ed il test dovrebbe essere ripetuto. a. L assorbanza del Controllo ELISA fortemente positivo Celiac DGP Screen prediluito deve essere maggiore di quella del Controllo ELISA debolmente positivo Celiac DGP Screen prediluito che a sua volta deve essere maggiore di quella del Controllo ELISA Negativo prediluito. b. Il Controllo ELISA fortemente positivo Celiac DGP Screen prediluito deve avere un assorbanza maggiore di 1,0 mentre l assorbanza del Controllo ELISA Negativo prediluito non deve essere maggiore di 0,2. c. L assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo Celiac DGP Screen deve essere maggiore di due volte rispetto a quella del Controllo ELISA Negativo oppure > 0,25. d. Il Controllo ELISA Negativo ed il Controllo ELISA fortemente positivo Celiac DGP Screen servono per controllare un eventuale malfunzionamento dei reagenti. Il Controllo ELISA fortemente positivo Celiac DGP Screen non assicura la precisione in corrispondenza del valore soglia del test. e. L utente del test dovrebbe fare riferimento al Documento C24-A2 dell CSLI (NCCLS) per ulteriori informazioni su appropriate tecniche di Controllo di Qualità. 19 Calcolo dei risultati Si deve determinare innanzitutto il valore medio di assorbanza per ciascun set di duplicati. La reattività di ciascun campione viene quindi calcolata dividendo il valore medio di assorbanza del campione per il valore medio di assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo Celiac DGP Screen e moltiplicando il risultato per il numero di unità assegnate al Controllo ELISA debolmente positivo Celiac DGP Screen, che è stampato sull etichetta del flacone. Assorbanza campione Valore del campione = x Valore Controllo ELISA debolmente positivo (unità) Assorbanza Controllo ELISA debolmente positivo Celiac DGP Screen Celiac DGP Screen (unità) La reattività è collegata in modo non lineare alla quantità di anticorpi presente. Mentre gli aumenti e le diminuzioni delle concentrazioni degli anticorpi vengono evidenziate da un corrispondente aumento o diminuzione della reattività, il cambiamento non è proporzionale (ad es., un raddoppio della concentrazione di anticorpi non raddoppia necessariamente la reattività). Se si desidera una più accurata quantificazione del contenuto di anticorpi, si possono allestire e testare diluizioni seriate del campione. Interpretazione dei risultati Il metodo ELISA è molto sensibile alla procedura ed è in grado di individuare anche piccole differenze nella popolazione dei pazienti. I valori riportati qui di seguito sono solo valori suggeriti. Ciascun Laboratorio dovrebbe stabilire il proprio range di normalità basato sulla procedura da esso utilizzata, sui controlli, sull apparecchiatura e sulla popolazione di pazienti secondo le proprie metodiche standard. Il campione può essere quindi classificato come negativo, debolmente positivo, moderatamente o fortemente positivo in base alla seguente tabella. Unità Negativo <20 Debolmente Positivo Moderatamente Positivo Fortemente Positivo >30 1. Un risultato positivo indica la presenza di anticorpi anti-gliadina della classe IgA e/o IgG e suggerisce la possibilità della presenza di certe enteropatie sensibili al glutine quali la malattia celiaca e la dermatite erpetiforme. 2. Un risultato negativo indica l assenza di anticorpi anti-gliadina della classe IgA o IgG anticorpi oppure la loro presenza a livelli inferiori al limite di sensibilità del metodo. 3. Sul referto si dovrebbe riportare la seguente frase: I seguenti risultati sono stati ottenuti mediante il test QUANTA Lite TM Celiac DGP Screen ELISA della INOVA. I valori Gliadin IgA e/o IgG ottenuti con test prodotti da altre Ditte possono non essere utilizzabili in modo intercambiabile. Il livello di anticorpi determinato con questo metodo non può essere correlato ad un titolo end-point. Limitazioni del test 1. Un risultato negativo in un paziente non trattato non esclude totalmente l enteropatia glutinesensibile. I campioni negativi possono essere sottoposti ad altri test per altri anticorpi correlati alla celiachia come gli anticorpi anti-endomisio (EMA) o la transglutaminasi tissutale (ttg). 2. Nei pazienti trattati che sono in grado di produrre anticorpi della classe IgA, i livelli di IgA anti-gliadina rappresentano un indicatore più attendibile dell osservanza delle regole dietetiche rispetto alle concentrazioni di IgG anti-gliadina Sono possibili falsi positivi (livelli di anticorpi elevati senza riscontri istologici caratteristici). 4

5 Raramente altri disturbi gastrointestinali e campioni normali possono avere anticorpi che reagiscono all antigene DGP. 4. L associazione tra dermatite erpetiforme ed enteropatia sensibile al glutine è così forte che è stato suggerito che entrambe le malattie abbiano la stessa eziologia; in questi pazienti, la determinazione della presenza di DGP anticorpi anti-gliadina è utilie per individuare una malattia celiaca asintomatica e per valutare la gravità dell interessamento gastrointestinale. 13,14 5. Questo test determina simultaneamente gli anticorpi IgA e IgG. Se si preferisce la determinazione singola di anticorpi IgA o IgG specifici, INOVA offre a questo scopo kit ELISA separati per IgA e IgG (QUANTA Lite TM Gliadin IgA II e QUANTA Lite TM Gliadin IgG II). 6. I risultati di questo test devono essere valutati dal medico curante alla luce del quadro clinico del paziente e del risultato degli altri test sierologici. 7. Le prestazioni caratteristiche del test non sono state valutate per campioni diversi dal siero. Valori attesi La capacità di QUANTA Lite TM Celiac DGP Screen di rilevare la presenza di anticorpi IgG e IgA antigliadina è stata valutata mediante un confronto con metodiche ELISA QUANTA Lite TM Gliadin IgA II e QUANTA Lite TM Gliadin IgG II. Range normale Quattrocentonovantasette soggetti sani e asintomatici casuali e residenti negli USA sono stati sottoposti a test per determinare la presenza di anticorpi anti-dgp. Di questi, trecento donatori avevano un età compresa fra i 14 ed i 78 anni con una eguale distribuzione fra maschi e femmine. Quattro campioni (0,8%) erano al di sopra del valore soglia di 20 unità. Due erano positivi deboli con valori pari a 20,1 e 20,2 unità e uno era un positivo moderato con un valore pari a 46,6 unità. Il quarto positivo, con 25,4 unità, viene considerato un vero celiaco dato che il campione è risultato fortemente positivo anche per gli anticorpi IgA antitransglutaminasi tissutale (57 unità). Il valore medio dei 497 campioni era di 3,17 unità. La deviazione standard dei campioni era di 3,0 unità. Il valore medio è di sei deviazioni standard al di sotto del valore soglia di 20 unità. Caratteristiche specifiche delle prestazioni Confronto con i predicate device Centouno campioni provenienti da tre laboratori di riferimento per la celiachia sono stati testati internamente sui test ELISA QUANTA Lite TM Celiac DGP Screen, QUANTA Lite TM Gliadin IgA II e QUANTA Lite TM Gliadin IgG II. I risultati, assieme ai 497 campioni normali, sono illustrati di seguito. N= 598 Gliadin IgG II e/o Gliadin IgA II Positivi Negativi Celiac DGP Screen Positivi 39 3* Negativi 11** 545 Percentuale di accordo positivi: 39/50 (78,0%) Percentuale di accordo negativi: 545/548 (99,4%) Accordo generale: 548/598 (91,6%) *Dei 3 campioni risultati positivi al test Celiac DGP Screen ma negativi a entrambi i kit Gliadin II, 2 erano pazienti celiaci che seguivano una dieta priva di glutine con 28,7 e 20,9 unità. Il terzo paziente era un parente di primo grado di un paziente celiaco con 20,2 unità. **Degli undici campioni risultati negativi al kit Celiac DGP Screen ma positivi a un kit Gliadin II kit, 9 provenivano dallo studio normale. I due restanti erano entrambi pazienti celiaci che seguivano una dieta priva di glutine. Uno ha dato 20,1 unità al test Gliadin IgG II e l altro 25,3 unità al test Gliadin IgA II. Klinischen Studien I campioni clinicamente definiti come pazienti celiaci, pazienti celiaci con deficit di IgA, pazienti celiaci che seguivano una dieta priva di glutine, parenti di primo grado di un paziente celiaco, pazienti con dermatite herpetiforme, controlli con deficit di IgA oppure pazienti non celiaci sono stati sottoposti a test in studi clinici sia interni che esterni utilizzando il test QUANTA Lite TM Celiac DGP Screen. Di seguito sono riepilogati i campioni definiti clinicamente e 517 dei suddetti campioni compresi nell intervallo di normalità. Gruppo pazienti # Posotivi Celiac DGP Screen % Celiaco ,3% Con mancanza della IgA celiaca % Celiaco su dieta priva di glutine % Parenti di 1 grado 18 2* 11% La dermatite herpetiforme pazientis 65 59** 91% Con mancanza della IgA controllo % Non-celiaco malattia pazientis ,2% Normali 517 4*** 0,8% *Uno dei parenti ha dato un risultato di 41,3 unità ed era positivo sia per h-ttg che per EMA. Il secondo ha dato un risultato di 20,2 unità ed era negativo sia per h-ttg che per EMA. **In questo stesso gruppo di pazienti, solo 54 o l 83% erano h-ttg positivi e 6 di questi 65 individui non presentavano coinvolgimento intestinale (biopsia Marsh 0). 5

6 ***Di questi 4 campioni, 1 presentava 20,1 unità e un altro 20,2 unità. Il valore soglia è 20 unità. Un altro dei 4 presentava 25,4 unità ed era fortemente positivo all h-ttg ed è possibile che sia celiaco. Prestazioni del test ELISA Celiac DGP Screen con diagnosi di celiachia: QUANTA LITE DGP Screen Sensibilità: 97% (131/135) Specificità: 99,2% (629/634) Diagnosi Positivi Negativi (Malattia Controlo e Sano Controlo) Totale Positivi Negativi Totale Sensibilità: La sensibilità complessiva per la celiachia viene calcolata raggruppando i risultati per gli 85 celiaci e i 50 celiaci con deficit di IgA. Il numero totale di celiaci è 135 di cui 131 o il 97% sono positivi. Specificità: La specificità può essere calcolata raggruppando i 517 normali (compreso il campione h-ttg positivo), gli 81 controlli non celiaci e i 36 controlli con deficit di IgA. Questo gruppo comprende 634 campioni. Di questi, solo 5 campioni erano positivi con una specificità pari al 99,2%. Reazioni crociate Per valutare i problemi potenziali di reattività crociata con altri autoanticorpi, sono stati analizzati diversi campioni positivi di autoanticorpi di titolo elevato con il kit QUANTA Lite TM Celiac DGP Screen. In totale sono stati analizzati 86 campioni. Molti dei campioni erano controlli altamente positivi di altri kit di test sugli autoanticorpi INOVA QUANTA Lite TM. Le specificità includevano Centromere (4), Actin (4), Sm (9), SS-A (12), RNP (9), Jo-1 (9), SS-B (8), Scl-70 (8), GBM (4), MPO (6), RF (5), Ribo P (4) e M2 (4). Il valore medio di questi 86 campioni era di 2,40 unità. Tutti i campioni erano negativi al test QUANTA Lite TM Celiac DGP Screen. Il valore medio è di otto deviazioni standard al di sotto del valore soglia di 20 unità. Precisione e riproducibilità Le prestazioni del kit QUANTA Lite TM Celiac DGP Screen sono state valutate fra i test analizzando ciascuno dei tredici campioni per cinque volte. I risultati sono indicato nella riportata di seguito. Prestazioni intra-test del test ELISA QUANTA Lite TM Celiac DGP Screen Unità medie 57,5 51,8 102,0 27,5 121,0 162,0 7,9 4,6 5,3 17,7 25,0 17,4 23,4 Deviazione standard 0,3 1,4 0,9 0,4 1,3 2,8 0,4 0,2 0,1 0,4 0,7 0,4 0,7 Coefficiente di variazione% 0,5 2,7 0,9 1,6 1,1 1,7 4,7 4,1 2,6 2,2 2,8 2,2 2,8 Le variazioni fra i test sono state valutate analizzando, in doppio un panel di otto campioni ed il controllo alto positivo (HPC) del kit per due volte al giorno (al mattino e al pomeriggio) per tre giorni. Di seguito viene presentato un riepilogo dei risultati dello studio. Prestazioni inter-test del test ELISA QUANTA Lite TM Celiac DGP Screen HPC A B C D E F G H Unità medie 110,4 54,6 48,5 27,5 157,9 9,8 16,4 22,2 18,8 Deviazione standard 3,4 1, ,0 3,8 0,6 0,1 0,7 0,6 Coefficiente di variazione % 3,0 2,5 3,8 3,6 2,4 5,8 4,7 3,2 3,4 6

7 Bibliografia 1. Trier JS: Celiac Sprue. New England Journal of Medicine 325: , Troncone R and Ferguson A: Antigliadin antibodies. J Pediatr Gastroenterol Nutr 12: , McMillan SA, Haughton DJ, et al.: Predictive value for coeliac disease of antibodies to gliadin, endomysium and jejunum in patients attending for jejunal biopsy. BMJ 303: , Lindh E, Ljunghall S, et al.: Screening for antibodies against gliadin in patients with osteoporosis. Journal of Internal Medicine 241: , Burgin-Wolff A, Gaze H, et al.: Antigliadin and antiendomysium antibody determination for coeliac disease. Arch Dis Child 66: , Working Group of European Society of Paediatric Gastroenterology and Nutrition. Revised criteria for diagnosis of coeliac disease. Arch Dis Child 65: , Osman AA, et al.: B-Cell epitopes of gliadin. Clin Exp Immunol 121: , Aleanzi M, et al.: Celiac disease: Antibody recognition against native and selectively deamidaion gliadin peptides. Clinical Chemistry 47: , Schwertz E, et al.: Serologic assay based on gliadin-related nonapeptides as a highly sensitive and specific diagnostic aid in celiac disease. Clinical Chemistry 50: , Prince HE: Evaluations of the INOVA Diagnostics Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Kits for Measuring Serum Immunoglobulins G (IgG) and IgA to Deamidated Glidin Peptides. Clinical and Vaccine Immunology 13: , Sugai E, et al.: Accuracy of Testing Antibodies to Synthetic Gliadin-Related Peptides in Celiac Disease. Clinical Gastroenterology and Hepatology 4: , Collin P, et al.: Selective IgA deficiency and coeliac disease. Scand Journal Gastroenterology 27: , Stober W: Gluten-sensitive enterophy: A nonallergic immune hypersensitivity of the gastrointestinal tract. J. Allergy Clin. Immunol. July , Smecuol E, et al.: Permeability, Zonulin Production, and Enteropathy in Dermatitis Herpetiformis. Clinical Gastroenterlogy and Hepatology 3: , Beutner EH, et al.: Sensitivity and Specificity of IgA-class antiendomysial antibodies for dermatitus herpetiformis and findings relevant to their pathogenic significance. Journal of the American Academy of Dermatology 15: , Porter WM, et al.: Tissue Transglutaminase Antibodies in Dermatitis Herpetiformis Correspondence. Gastroenterology 117: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control and Prevention/National Institutes of Health, Fifth Edition, CLSI (NCCLS). Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guidline-Third Edition. CLSI Document H18-A3, Vol 24(38), CLSI (NCCLS). Statistical quality control: Principles and definitions; Approved Guideline- 2 nd edition NCCLS Document C24-A2, Vol. 19(5), Fornitore: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Rappresentante Autorizzato: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service ITA October 2008 Revision 2 7