QUANTA Lite TM RNA Pol III Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata

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1 QUANTA Lite TM RNA Pol III Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata Finalità d uso Il test QUANTA Lite TM RNA Pol III ELISA è un dosaggio di immunoassorbimento enzimatico semiquantitativo per la determinazione di anticorpi IgG anti-rna polimerasi III nel siero dei pazienti. La presenza di questi anticorpi, quando valutata in associazione ad altri risultati clinici e di laboratorio, costituisce un ausilio nella diagnosi di sclerosi sistemica (sclerodermia) con un incidenza aumentata di coinvolgimento cutaneo e crisi renale. Riassunto e Spiegazione del test Autoanticorpi all antigene RNA Pol III vengono riscontrati nell 11% - 23% dei pazienti con sclerosi sistemica. 1-8 I pazienti positivi agli anticorpi anti-rna Pol III non presentano nessuno degli altri anticorpi tipicamente osservati nei pazienti con sclerosi sistemica come gli anticorpi anti-centromero, anti-scl-70 o anti-pm/scl, 6 pertanto costituiscono un gruppo sierologico distinto. Numerosi studi hanno mostrato che questi pazienti hanno un rischio aumentato di manifestare la forma cutanea diffusa di sclerodermia, con un elevata probabilità di coinvolgimento cutaneo e nefropatia ipertensiva. 1-8 Anticorpi a diversi tipi di RNA polimerasi vengono osservati nei pazienti con sclerosi sistemica. 4,5 L epitopo immunodominante sull RNA Pol III è stato identificato e clonato. 3 L epitopo immunodominante ricombinante dell RNA Pol III può essere usato in ELISA con un elevata specificità per rilevare anticorpi anti-rna Pol III nei pazienti con la forma cutanea diffusa della sclerosi sistemica, con un elevata incidenza di coinvolgimento cutaneo. 1 Principio della Metodica Il frammento immunodominante ricombinante purificato di antigene RNA Pol III è legato ai pozzetti di una piastra a micropozzetti in polistirene. I controlli pre-diluiti ed i sieri diluiti dei pazienti vengono distribuiti nei pozzetti corrispondenti, consentendo agli anticorpi anti-rna Pol III della classe IgG eventualmente presenti di legarsi all antigene adsorbito. L eccesso di campione non legato viene allontanato mediante il lavaggio e successivamente si aggiunge a ciascun pozzetto un anticorpo anti-igg umane marcato con un enzima. Una seconda incubazione consente agli anticorpi anti-igg umane marcati con l enzima di legarsi agli anticorpi del paziente che si sono eventualmente legati alla parete dei pozzetti. Dopo ulteriore lavaggio per allontanare l eccesso di anticorpi anti-igg umane marcati con l enzima, l attività dell enzima rimasto viene misurata aggiungendo un substrato cromogenico e misurando l intensità del colore che si sviluppa. Il test può essere letto mediante uno spettrofotometro ed interpretato confrontando l intensità del colore che si sviluppa nei pozzetti dei campioni con quella dei pozzetti dei controlli. Reagenti 1. Piastra ELISA di micropozzetti di polistirene rivestita con peptidi di RNA Pol III antigene (12-1 x 8 pozzetti), con supporto, in busta chiusa contenente materiale essicante 2. Controllo ELISA Negativo, 1 flacone di tampone contenente conservante e siero umano senza anticorpi umani RNA Pol III, prediluito, (pronta all uso), 1,2mL 3. Controllo ELISA fortemente positivo per RNA Pol III, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi umani RNA Pol III, prediluito, (pronta all uso), 1,2mL 4. Controllo ELISA debolmente positivo per RNA Pol III, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi umani RNA Pol III, prediluito, (pronta all uso), 1,2mL 5. Diluente per campioni HRP, 1 flacone di colore rosa contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris, Tween 20, stabilizzatori delle proteine e conservante, 50mL 6. Soluzione di lavaggio HRP Concentrata, 1 flacone di soluzione concentrata 40x di colore rosso contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris e Tween 20, 25mL. Vedi la Sezione Metodi per le istruzioni sulla diluizione. 7. Coniugato HRP IgG, (montone), anti-igg umane, 1 flacone di colore blu contenente tampone, stabilizzatori delle proteine e conservante, 10mL 8. Cromogeno TMB, 1 flacone contenente stabilizzatori, 10mL 9. Soluzione di arresto HRP, Acido solforico 0,344M, 1 flacone incolore, 10mL Avvertenze 1. ATTENZIONE: Questo prodotto contiene un composto chimico (cloramfenicolo allo 0,02%) nel diluente per i campioni, nei controlli e nel coniugato, noto allo Stato della California come causa di tumori. 2. Tutte le fonti umane di materiali usati nella preparazione dei controlli per questo prodotto sono state testate e sono risultate negative per la presenza di anticorpi anti-hiv, per HBsAg e per anticorpi anti- HCV mediante metodi approvati dall FDA. Tuttavia nessun test offre le certezza completa dell assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i Controlli ELISA fortemente positivo, ELISA debolmente positivo ed ELISA Negativo devono essere maneggiati come materiali potenzialmente infettivi La sodio azide è usata come conservante. La sodio azide è un veleno e può essere tossica se ingerita o assorbita attraverso la cute o gli occhi. La sodio azide può reagire con le tubature di piombo o rame formando azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lasciar scorrere grandi quantità di acqua, se si usa un lavandino per eliminare i reagenti, per prevenire la formazione di azidi. 1

2 4. Il Coniugato HRP contiene un composto chimico velenoso/corrosivo, che può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. 5. Il Cromogeno TMB contiene un irritante, che può essere dannoso se inalato, ingerito o assorbito attraverso la cute. Per prevenire lesioni, evitare l inalazione, l ingestione o il contatto con la cute e con gli occhi. 6. La Soluzione di arresto HRP è costituita da una soluzione di acido solforico diluito. Evitare l esposizione a basi, metalli o altri composti che possono reagire con gli acidi. L acido solforico è velenoso e corrosivo e può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. 7. Usare appropriati indumenti personali protettivi mentre si lavora con i reagenti forniti. 8. I reagenti eventualemente rovesciati devono essere rimossi immediatamente. Seguire tutte le normative vigenti in materia di eliminazione dei residui di natura chimica. Precauzioni 1. Questo prodotto è stato messo a punto per l uso diagnostico In Vitro. 2. La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel kit può causare risultati non attendibili. 3. Un lavaggio incompleto o non efficiente e l insufficiente aspirazione del liquido dai pozzetti ELISA può causare una scarsa precisione e/o un elevato background. 4. L adattamento di questo test all uso con apparecchiature automatiche e altri dispositivi per trattamento dei campioni liquidi, in toto o in parte, può causare differenze nei risultati rispetto a quelli ottenuti mediante la procedura manuale. E responsabilità di ciascun Laboratorio confermare che le procedure automatizzate utilizzate diano risultati entro limiti di accettabilità. 5. Una serie di fattori influenza le prestazioni del test. Essi comprendono l iniziale temperatura dei reagenti, la temperatura dell ambiente, l accuratezza e la riproducibilità della tecnica di pipettamento, la scrupolosità delle operazioni di lavaggio e di aspirazione del liquido dai pozzetti delle ELISA, il tipo di spettrofotometro usato per leggere i risultati e la lunghezza dei tempi di incubazione durante l esecuzione del test. Bisogna prestare molta attenzione alla costanza per ottenere risultati accurati e riproducibili. 6. Si raccomanda di attenersi scrupolosamente alle istruzioni fornite. 7. Una chiusura incompleta della busta richiudibile contenente le strisce di pozzetti ed il materiale essicante causa la degradazione dell antigene ed una scarsa precisione nei risultati. 8. Valori di assorbanza inaccettabilmente bassi possono essere osservati dopo aver usato due o più volte lo stesso flacone di coniugato HRP per un certo periodo di tempo. E importante seguire attentamente le istruzioni fornite per il trattamento del coniugato HRP per evitare tale inconveniente. 9. Un eventuale contaminazione chimica del coniugato HRP può essere conseguenza di una impropria pulizia o risciacquo di apparecchi o di strumenti. Residui di comuni reagenti chimici di laboratorio quali formalina, candeggina, etanolo o detergenti causano la degradazione nel tempo del coniugato HRP. Risciacquare molto accuratamente tutti gli apparecchi e gli strumenti dopo l uso di detergenti chimici. Condizioni di conservazione 1. Conservare tutti i reagenti del kit a 2-8 C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza se conservati e trattati seguendo le istruzioni fornite. 2. Le strisce di pozzetti non utilizzate devono essere rimesse immediatamente nella busta richiudibile contenente il materiale essicante e conservate nella busta ben chiusa a 2-8 C. 3. Il tampone di lavaggio diluito è stabile per 1 settimana a 2-8 C. Raccolta dei campioni Questa tecnica deve essere usata con un campione di siero. L aggiunta al campione di sodio azide o di altri conservanti può influenzare in modo negativo i risultati. Campioni con segni di contaminazione microbica, trattati con calore o contenenti particelle visibili non dovrebbero essere usati. Si dovrebbe evitare anche l uso di sieri fortemente emolizzati o lipemici. Dopo il prelievo, il siero dovrebbe essere separato dal coagulo. Il Documento H18-A3 dell CLSI (NCCLS) raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) conservare i campioni a temperatura ambiente per non più di 8 ore; 2) se il test non può essere eseguito entro 8 ore, conservare i campioni in frigorifero a 2-8 C; 3) se il test non può essere eseguito entro 48 ore, oppure per la spedizione dei campioni, congelare a -20 C. I campioni congelati devono essere mescolati bene dopo lo scongelamento e prima di essere testati. 10 Procedura Materiali forniti 1 Piastra microtiter ELISA RNA Pol III (12-1 x 8 pozzetti), con supporto 1 1,2mL Controllo ELISA Negativo, prediluito, (pronta all uso) 1 1,2mL Controllo ELISA debolmente positivo RNA Pol III, prediluito, (pronta all uso) 1 1,2mL Controllo ELISA fortemente positivo, RNA Pol III, prediluito, (pronta all uso) 1 50mL Diluente per campioni HRP 1 25mL Soluzione di lavaggio HRP concentrata, 40x concentrata 1 10mL Coniugato HRP IgG, (montone), anti-igg umane 1 10mL Cromogeno TMB 1 10mL Soluzione di arresto HRP, 0,344M Acido solforico 2

3 Materiali richiesti ma non forniti Micropipette in grado di erogare volume di 5, 100, e 500µL Puntali monouso per micropipette Provette per la diluizione dei sieri, volume 4mL Acqua distillata o deionizzata Beuta da 1L per diluire la Soluzione di lavaggio HRP concentrata Lettore per piastre ELISA in grado di leggere a 450nm (e 620nm per le letture a doppia lunghezza d onda) Metodica Prima di incominciare 1. Portare tutti i reagenti ed i campioni a temperatura ambiente (20-26 o C) e mescolarli bene. 2. Diluire la Soluzione di lavaggio HRP concentrata 1:40 aggiungendo il contenuto del flacone fornito con il kit a 975mL di acqua distillata o deionizzata. Se non si usa l intera piastra in una sola volta, si può preparare una minore quantità di soluzione di lavaggio aggiungendo 2,0mL di concentrato a 78mL di acqua distillata o deionizzata ogni 16 pozzetti utilizzati. La soluzione di lavaggio diluita è stabile per 1 settimana a 2-8 o C. 3. Preparare una diluizione 1:101 di ciascun campione da testare aggiungendo 5µL di siero a 500µL di Diluente per campioni HRP. I campioni diluiti devono essere testati entro 8 ore dalla preparazione. NON DILUIRE i Controllo ELISA debolmente positivo RNA Pol III, ELISA fortemente positivo RNA Pol III ed ELISA Negativo. 4. La determinazione della presenza o dell assenza di anti-rna Pol III usando unità arbitrarie richiede due pozzetti per ciascuno dei tre controlli ed uno o due pozzetti per ciascun campione clinico. Si raccomanda di testare i campioni in duplicato. Esecuzione del test 1. TUTTI I REAGENTI DEVONO ESSERE PORTATI A TEMPERATURA AMBIENTE (20-26 C) PRIMA DI INIZIARE IL TEST. Posizionare i pozzetti/le strisce necessarie nel supporto. Rimettere immediatamente le strisce inutilizzate nella busta contenente il materiale essicante e sigillarla bene per minimizzare l esposizione all umidità ambientale. 2. Distribuire 100µL dei Controllo ELISA debolmente positivo RNA Pol III, ELISA fortemente positivo RNA Pol III ed ELISA Negativo prediluiti e dei sieri diluiti nei rispettivi pozzetti. Coprire i pozzetti ed incubare per 30 minuti a temperatura ambiente su una superficie piana. Il tempo di incubazione inizia dopo l aggiunta dell ultimo campione. 3. Lavaggio: Aspirare completamente il contenuto di ciascun pozzetto. Distribuire µL di soluzione di lavaggio HRP diluita in tutti i pozzetti e quindi aspirarla. Ripetere questa operazione per altre due volte, per un totale di tre lavaggi. Dopo l ultimo lavaggio capovolgere la piastra e scuoterla fermamente su tovaglioli di carta assorbente per rimuovere eventuali residui di liquido. E importante vuotare completamente ciascun pozzetto dopo ciascun lavaggio. Per l aspirazione mantenere la stessa sequenza usata per l aggiunta dei campioni. 4. Distribuire 100μL di Coniugato HRP IgG in ciascun pozzetto. Il coniugato dovrebbe essere prelevato dal flacone mediante tecniche sterili. Prelevare dal flacone solo la quantità di coniugato necessaria per l esecuzione del test. PER EVITARE POSSIBILI CONTAMINAZIONI MICROBICHE E/O CHIMICHE, NON RIMETTERE MAI IL CONIUGATO INUTILIZZATO NEL FLACONE. Incubare i pozzetti per 30 minuti come descritto al punto Lavaggio: Ripetere la procedura descritta la punto Distribuire 100µL di Cromogeno TMB in ciascun pozzetto ed incubare al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. 7. Distribuire 100µL di Soluzione di arresto HRP in ogni pozzetto. Per l aggiunta della Soluzione di arresto HRP mantenere la stessa sequenza e gli stessi tempi utilizzati per l aggiunta del Cromogeno TMB. Agitare gentilmente la piastra con le dita per mescolare completamente i reagenti nei pozzetti. 8. Leggere l assorbanza (OD) di ciascun pozzetto a 450nm entro 1 ora dall aggiunta della soluzione di arresto. Se si preferisce una lettura a doppia lunghezza d onda, si può usare la lunghezza d onda di 620nm come riferimento. Controllo di qualità 1. I Controlli ELISA debolmente positivo RNA Pol III, ELISA fortemente positivo RNA Pol III ed ELISA Negativo devono essere inclusi ogni volta che si esegue il test per assicurare che tutti i reagenti ed il test funzionino in modo corretto. 2. Si deve notare che poichè i Controlli ELISA debolmente positivo RNA Pol III, ELISA fortemente positivo RNA Pol III ed ELISA Negativo sono prediluiti, essi non rappresentano un controllo procedurale per le tecniche di diluizione utilizzate per i campioni. 3. Ulteriori controlli possono essere inclusi in base alle indicazioni o alle richieste delle vigenti regolamentazioni o delle organizzazioni di accreditamento. Ulteriori sieri di controllo possono essere preparati raccogliendo in un pool dei sieri umani, aliquotandolo e conservandolo a < -20 C. 4. Perchè i risultati del test siano considerati validi, tutti i seguenti criteri devono essere soddisfatti. Se anche uno solo non rientra nei valori specificati, i risultati non dovrebbero essere considerati validi ed il test dovrebbe essere ripetuto. a. L assorbanza del Controllo ELISA fortemente positivo RNA Pol III prediluito deve essere maggiore di quella del Controllo ELISA debolmente positivo RNA Pol III prediluito che a sua volta deve essere maggiore di quella del Controllo ELISA Negativo prediluito. b. Il Controllo ELISA fortemente positivo RNA Pol III prediluito deve avere un assorbanza maggiore di 1,0 mentre l assorbanza del Controllo ELISA Negativo prediluito non deve essere 3

4 maggiore di 0,2. c. L assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo RNA Pol III deve essere maggiore di due volte rispetto a quella del Controllo ELISA Negativo oppure >0,25 ma non superiore a 0,6. d. Il Controllo ELISA Negativo ed il Controllo ELISA fortemente positivo RNA Pol III servono per controllare un eventuale malfunzionamento dei reagenti. Il Controllo ELISA fortemente positivo RNA Pol III non assicura la precisione in corrispondenza del valore soglia del test. e. L utente del test dovrebbe fare riferimento al Documento C24-A3 dell CLSI (NCCLS) per ulteriori informazioni su appropriate tecniche di Controllo di Qualità. 11 Calcolo dei risultati Si deve determinare innanzitutto il valore medio di assorbanza per ciascun set di duplicati. La reattività di ciascun campione viene quindi calcolata dividendo il valore medio di assorbanza del campione per il valore medio di assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo RNA Pol III e moltiplicando il risultato per il numero di unità assegnate al Controllo ELISA debolmente positivo RNA Pol III, che è stampato sull etichetta del flacone. Assorbanza campione Valore del campione = x Valore Controllo ELISA debolmente positivo RNA Pol III (unità) (unità) Assorbanza Controllo ELISA debolmente positivo RNA Pol III La reattività è collegata in modo non lineare alla quantità di anticorpi presente. Mentre gli aumenti e le diminuzioni delle concentrazioni degli anticorpi vengono evidenziate da un corrispondente aumento o diminuzione della reattività, il cambiamento non è proporzionale (ad es., un raddoppio della concentrazione di anticorpi non raddoppia necessariamente la reattività). Se si desidera una più accurata quantificazione del contenuto di anticorpi, si possono allestire e testare diluizioni seriate del campione. L ultima diluizione che risulta positiva nel test dovrebbe essere refertata come il titolo anticorpale del paziente. Interpretazione dei risultati Il metodo ELISA è molto sensibile alla procedura ed è in grado di individuare anche piccole differenze nella popolazione dei pazienti. I valori riportati qui di seguito sono solo valori suggeriti. Ciascun Laboratorio dovrebbe stabilire il proprio range di normalità basato sulla procedura da esso utilizzata, sui controlli, sull apparecchiatura e sulla popolazione di pazienti secondo le proprie metodiche standard. Il campione può essere quindi classificato come negativo, debolmente positivo, moderatamente o fortemente positivo in base alla seguente tabella. Unità Negativo <20 Debolmente Positivo Moderatamente Positivo Fortemente Positivo >80 1. Un risultato positivo indica la presenza di anticorpi anti-rna Pol III e suggerisce la possibilità di sclerosi sistemica. 1. Un risultato negativo indica l assenza di anticorpi RNA Pol III oppure la loro presenza a livelli inferiori al limite di sensibilità del metodo. Limitazioni del test 1. La presenza di complessi immunitari o altri aggregati immunoglobulinici nel campione dei pazienti può causare un livello aumentato di legame aspecifico e produrre falsi positivi in questo test. 2. Tutti i pazienti con sclerosi sistemica sono positivi all RNA Pol III. Gli studi di immunoprecipitazione ed ELISA hanno dimostrato che solo l 11% - 23% dei pazienti con sclerosi sistemica hanno anticorpi anti-rna Pol III. 2. I risultati di questo test devono essere valutati dal medico curante alla luce del quadro clinico del paziente e del risultato degli altri test sierologici. 3. Le prestazioni caratteristiche del test non sono state valutate per campioni diversi dal siero. Valori attesi La capacità del test QUANTA Lite RNA Pol III ELISA di individuare anticorpi anti-rna Pol III è stata valutata eseguendo numerosi studi su pazienti clinicamente definiti e anche mediante un confronto con il disponibile in commercio RNA Polymerase III ELISA. Per un confronto dei risultati tratti dalla letteratura e il test QUANTA Lite RNA Pol III ELISA vedere la tabella seguente. 4

5 Tabella 1. Prevalenza degli anticorpi anti-rna Pol III in varie patologie Letteratura 1,2,5-8 INOVA RNA Pol III ELISA # anti-rna # anti-rna Malattia # Totale Pol III Pos % Pos # Totale Pol III Pos % Pos Alle SSc 1,2, % % SLE 1, % % MCTD % ND PM/DM % ND RA % % Primary SSc % ND UCTD 2, % ND NBD 1,2, % ,4% Nucleolar % ND ID ND % Tutti controllos % % Abbreviazioni: Pos=Positivo; SSc=sclerosi sistemica; SLE=lupus eritematoso sistemico; MCTD=malattia del tessuto connettivo misto; PM/DM=polimiosite/dermatomiosite; RA=artrite reumatoide; UCTD=malattia del tessuto connettivo non specificata; NBD=sangue di donatore normale; Nucleolar=modello immunofluorescente nucleolare; ID=malattia infettiva. Riferimenti 1 e 5 hanno utilizzato il test ELISA, 2 ha utilizzato il test Western blot e i riferimenti 6, 7 e 8 hanno utilizzato la radioimmuno-precipitazione. Tabella 2. La comparsa di sintomi nei pazienti positivi all anti-rna Pol III # anti-rna # Cutaneo % # Limitato o % # Crisi % Pol III Pos diffuso sovrapposto renale % 55 17% 86 27% Dai riferimenti 1,2,5-8. Range normale Cinquecentoventisette donatori di sangue casuali residenti negli USA sono stati sottoposti a test per rilevare la presenza di anticorpi anti-rna Pol III. Solo 2 campioni (0,4%) sono risultati al di sopra del valore soglia di 20 unità con valori pari a 27 e 39 unità. Il valore medio dei 527 campioni era di 3,4 unità. La deviazione standard dei campioni era di 2,6 unità. Il valore medio è di 6,4 deviazioni standard al di sotto del valore soglia di 20 unità. Caratteristiche specifiche delle prestazioni Confronto con i predicate device Un totale di cinquantuno campioni sono stati testati in due laboratori clinici con i test ELISA INOVA QUANTA Lite TM RNA Pol III e disponibile in commercio RNA Polymerase III. Questi risultati sono descritti di seguito. N= 51 Disponibile in Commercio Anti-RNA Polymerase III ELISA INOVA QUANTA Lite Pos Neg RNA Pol III Pos 32 0 Neg 2 17 Percentuale di accordo positivi: 32/34 (94%; 95 Intervallo di confidenza Cl = 80-99%) Percentuale di accordo negativi: 17/17 (100%; 95 Intervallo di confidenza Cl = %) Accordo generale: 49/51 (96%) Estudios clínicos Sono stati eseguiti due tipi di studi clinici. In uno studio, 1319 pazienti con sclerosi sistemica e 37 donatori di sangue normale che erano stati sottoposti a test per l anti-rna Pol III mediante radioimmuno-precipitazione (RIP) sono stati testate con il test QUANTA Lite RNA Pol III ELISA. Il test ELISA ha una positive percentuali accordo del 96% e una negative percentuali accordo del 98% rispetto al test di radioimmunoprecipitazione. La concordanza delle percentuali positive e negative del test ELISA RNA Pol III era pari al RIP Tutti i campioni N=1,356 RNA Pol III da RIP Positivo % Accordo (95% CI) Negativo % Accordo (95% CI) Accordo = 97,5% + - RNA Pol III by * 96% (93-98%) ELISA - 14** 1,002 98% (97-99%) * Per questi 20 è stata formulate la diagnosi di SSc ** Per questi 14 è stata formulate la diagnosi di SSc Altri 418 pazienti con sclerosi sistemica e 629 donatori di sangue o soggetti con malattie infettive o autoimmuni sono soltanto sottoposti al test QUANTA Lite RNA Pol III ELISA per fornire i dati per calcolare la sensibilità e la specificità cliniche. Sensibilità e specificità clinica del QUANTA Lite Anti-RNA Pol III ELISA 5

6 N=2,403 RNA Pol III da ELISA Clinica specificità (95% CI) Clinica Sensibilità + - Tutti Controls N = % (98,5-99,8%) Tutti SSc N= % (20,7-24,7%) La specificità clinica per il test RNA Pol III ELISA è superiore al 99%. La sensibilità clinica è pari al 23% e concorda con la letteratura pubblicata. Reazioni crociate Per valutare i problemi potenziali di reattività crociata con altri autoanticorpi, sono stati analizzati diversi campioni positivi di autoanticorpi di titolo elevato con il kit QUANTA Lite TM RNA Pol III ELISA. Le specificità comprendevano SS-A, SS-B, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, Chromatin, Ribo-P, CCP e varie malattie infettive. Non c era evidenza di reattività crociata. Precisione e riproducibilità Le prestazioni del kit QUANTA Lite TM RNA Pol III sono state valutate fra i test analizzando ciascuno dei nove campioni per nove volte su 2 lotti dei corredi. I risultati rappresentativi sono riportati qui di seguito. Prestazioni intra-test del test ELISA QUANTA Lite TM RNA Pol III ELISA P2 P3 P4 P5 MP773 int 148 Unità Medie 22 U 31 U 26 U 90 U 58 U 2 U Deviazione standard 0,7 1,3 0,6 1,5 1,5 0,1 Coefficiente di variazione % 3% 4% 2% 2% 3% 5% La variazione inter-dosaggio è stata valutata analizzando almeno 12 campioni su ciascuno di 2 lotti dei corredi sopra almeno di 5 sedute diverse. Irisultati rappresentativi sono riportati qui di seguito. Prestazioni inter-test del test ELISA QUANTA Lite TM RNA Pol III ELISA P2 P3 P4 P5 MP773 int 148 Unità Medie 23 U 32 U 27 U 91 U 62 U 3 U Deviazione standard 0,5 1,6 1,2 3,5 1,4 0,2 Coefficiente di variazione % 2% 5% 4% 4% 2% 5% 6

7 Bibliografia 1. Kuwana M, et al.: Enzyme-linked immunosorbent assay for detection of anti-rna polymerase III antibody: analytical accuracy and clinical associations in systemic sclerosis. Arthritis Rheum 52: , Okano Y, Steen VD, Medsger Jr.TA: Autoantibody reactive with RNA polymerase III in systemic sclerosis. Ann Intern Med 119: , Kuwana M, Kimura K, Kawakami Y.: Identification of an immunodominant epitope on RNA polymerase III recognized by systemic sclerosis sera: application to enzyme-linked immunosorbent assay. Arthritis Rheum 46: , Steen VD and Medsger TA:. Long term outcomes of scleroderma renal crisis. Ann Intern Med 133: , Chang M, et al.: Analysis of autoantibodies against RNA polymerases using immunoaffinitypurifed RNA polymerase I, II, and III antigen in an enzyme-linked immunosorbent assay. Clin Immunol Immunopathol. 19: 71-78, Bunn CC, et al.: Anti-RNA polymerases and other autoantibody specificities in systemic sclerosis. Br J Rheumatol. 37: 15-20, Harvey GR, et al.: Clinical and serological associations with anti-rna polymerase antibodies in systemic sclerosis. Clin Exp Immunol 117: , Meyer OC, et al.: Disease subsets, antinuclear antibody profile, and clinical features in 127 French and 247 US adult patients with systemic sclerosis. J Rheumatol 34: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control and Prevention/National Institutes of Health, 2007 Fifth Edition. 10. CLSI (NCCLS). Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guidline-Third Edition. CLSI Document H18-A3, Vol 24 (38), CLSI (NCCLS). Statistical Quality Control for Quantitative Measurement Procedures: Principles and Definitions; Approved Guideline- 3 rd edition NCCLS Document C24-A3, Vol. 26 (25), 2006 Fornitore: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Rappresentante Autorizzato: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service June 2007 Revision ITA0 7