QUANTA Lite TM F-Actin IgA ELISA Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata

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1 QUANTA Lite TM F-Actin IgA ELISA Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata Finalità d uso QUANTA Lite TM F-Actin IgA è un dosaggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) per la determinazione semiquantitativa degli anticorpi IgA al componente F-Actina della muscolatura liscia nel siero umano. Nei pazienti con risultati clinici coerenti con la malattia celiaca, la presenza di anticorpi IgA anti-f- Actina può essere utile per stimare la probabilità di atrofia villosa intestinale significativa. Riassunto e Spiegazione del test Gli anticorpi anti-f-actina sono il componente principale di quelli che sono stati definiti anticorpi anti muscolo liscio (ASMA). Questi anticorpi mostrano una specificità verso il componente F-Actina del citoscheletro e vengono tradizionalmente rilevati mediante immunofluorescenza indiretta utilizzando sezioni sottili di fegato, rene o stomaco di roditore come substrato. 1-3 Gli anticorpi anti muscolo liscio sono diretti contro vari componenti, il più importante dei quali è l'f-actina, ma l'immunofluorescenza può rilevare anche anticorpi alla tubulina e ai filamenti intermedi. 4,5 Nei pazienti con epatite autoimmune (AIH), la reattività anti muscolo liscio riflette principalmente anticorpi anti-f-actina, mentre nelle infezioni virali come la mononucleosi infettiva, l'epatite virale, il morbillo e la parotite, la reattività anti muscolo liscio è dovuta a reattività ad antigeni citoplasmatici non-f-actina. 4-8 Anticorpi IgG anti-f-actina sono stati riferiti nel 52-85% dei pazienti con epatite autoimmune (AIH) e nel 22% dei pazienti con cirrosi biliare primitiva (PBC). 7-9,12-16 Anticorpi IgG anti-f-actina (di solito con titoli bassi), sono stati riferiti nel 3-18% dei sieri prelevati dalla popolazione generale sana. 17 Contrariamente agli anticorpi IgG anti-f-actina che sono caratteristici dei pazienti con epatite autoimmune, gli anticorpi anti-f-actina sono clinicamente rilevanti per i pazienti con malattia celiaca. Studi recenti hanno dimostrato che gli anticorpi IgA alla F-Actina sono caratterizzati da una marcata correlazione con il grado di atrofia dei villi intestinali presente nella malattia celiaca di questi pazienti Clemente et al, utilizzando un test di immunofluorescenza (IFA) per il rilevamento di anticorpi IgA anti-f-actina su eritrociti trattati in maniera speciale, hanno osservato che il 98,2% dei pazienti celiaci con una mucosa piatta, l 89% dei pazienti con atrofia villosa subtotale, il 30% dei pazienti con atrofia villosa parziale e lo 0% dei controlli endomisio e trasglutaminasi tissutale negativi erano positivi agli anticorpi IgA anti-f-actina. 25 Pedreira, S. et al. hanno riferito che il 95% dei pazienti con malattia celiaca non trattati presentavano valori aumentati di anticorpi IgA anti-f-actina rispetto ai controlli normali. 23 Questo gruppo ha inoltre rilevato che titoli più alti di anticorpi anti-f-actina erano correlati a un danno intestinale più grave. Gli anticorpi anti-f-actina diminuiscono dopo l instaurazione di una dieta priva di glutine e questo indica che una misurazione di questi anticorpi può essere utile per monitorare il rispetto della dieta prescritta. 22 Le procedure che si avvalgono dell'immunofluorescenza per rilevare anticorpi anti-f-actina o muscolo liscio sono soggettive e le prestazioni dei test dipendono dal tipo di tessuto usato, dalla specificità dei coniugati, dalla potenza del microscopio usato per leggere il risultato e dall esperienza tecnica dell osservatore. I metodi ELISA per l'individuazione di anticorpi anti-f-actina, presentati inizialmente tra la metà degli anni '80 e l inizio degli anni 90 4,5,7,8, sono in grado di fornire di prestazioni più standardizzate, tecnicamente meno impegnative e automatizzabili. 7,9-12 Principio della Metodica L antigene purificato F-Actin è adsorbito sulla parete dei pozzetti di una piastra microtiter di polistirene in condizioni adatte a conservare l antigene nel suo stato nativo. I controlli pre-diluiti ed i sieri diluiti dei pazienti vengono distribuiti nei pozzetti corrispondenti, consentendo alle IgA anti-f-actin eventualmente presenti di legarsi all antigene adsorbito. L eccesso di campione non legato viene allontanato mediante il lavaggio e successivamente si aggiunge a ciascun pozzetto un anticorpo anti-iga umane marcato con un enzima. Una seconda incubazione consente agli anticorpi anti-iga umane marcati con l enzima di legarsi agli anticorpi del paziente che si sono eventualmente legati alla parete dei pozzetti. Dopo ulteriore lavaggio per allontanare l eccesso di anticorpi anti-iga umane marcati con l enzima, l attività dell enzima rimasto viene misurata aggiungendo un substrato cromogenico e misurando l intensità del colore che si sviluppa. Il test può essere letto mediante uno spettrofotometro ed interpretato confrontando l intensità del colore che si sviluppa nei pozzetti dei campioni con quella dei pozzetti dei controlli. Reagenti 1. Piastra microtiter ELISA in polistirene adsorbita con antigene F-Actin purificato (12-1 x 8 pozzetti), con supporto, in busta chiusa contenente materiale essicante 2. Controllo ELISA Negativo, 1 flacone di tampone contenente conservante e siero umano senza anticorpi umani della classe IgA F-Actin, prediluito, 1,2mL 3. Controllo ELISA fortemente positivo per IgA F-Actin, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi umani della classe IgA F-Actin, prediluito, 1,2mL 4. Controllo ELISA debolmente positivo per IgA F-Actin, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi umani della classe IgA F-Actin, prediluito, 1,2mL 5. Diluente per campioni HRP, 1 flacone di colore rosa contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris, Tween 20, stabilizzatori delle proteine e conservante, 50mL 6. Soluzione di lavaggio HRP Concentrata, 1 flacone di soluzione concentrata 40x di colore rosso contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris e Tween 20, 25mL. Vedi la Sezione Metodi per 1

2 le istruzioni sulla diluizione. 7. Coniugato HRP IgA, (montone), anti-iga umane, 1 flacone di colore giallo contenente tampone, stabilizzatori delle proteine e conservante, 10mL 8. Cromogeno TMB, 1 flacone contenente stabilizzatori, 10mL 9. Soluzione di arresto HRP, Acido solforico 0,344M, 1 flacone incolore, 10mL Avvertenze 1. ATTENZIONE: Questo prodotto contiene un composto chimico (cloramfenicolo allo 0,02%) nel diluente per i campioni, nei controlli e nel coniugato, noto allo Stato della California come causa di tumori. 2. Tutte le fonti umane di materiali usati nella preparazione dei controlli per questo prodotto sono state testate e sono risultate negative per la presenza di anticorpi anti-hiv, per HBsAg e per anticorpi anti- HCV mediante metodi approvati dall FDA. Tuttavia nessun test offre la certezza completa dell assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i Controlli ELISA fortemente positivo per IgA F-Actin, ELISA debolmente positivo per IgA F-Actin ed ELISA Negativo devono essere maneggiati come materiali potenzialmente infettivi La sodio azide è usata come conservante. La sodio azide è un veleno e può essere tossica se ingerita o assorbita attraverso la cute o gli occhi. La sodio azide può reagire con le tubature di piombo o rame formando azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lasciar scorrere grandi quantità di acqua, se si usa un lavandino per eliminare i reagenti, per prevenire la formazione di azidi. 4. Il Coniugato HRP contiene un composto chimico velenoso/corrosivo, che può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. 5. Il Cromogeno TMB contiene un irritante, che può essere dannoso se inalato, ingerito o assorbito attraverso la cute. Per prevenire lesioni, evitare l inalazione, l ingestione o il contatto con la cute e con gli occhi. 6. La Soluzione di arresto HRP è costituita da una soluzione di acido solforico diluito. Evitare l esposizione a basi, metalli o altri composti che possono reagire con gli acidi. L acido solforico è velenoso e corrosivo e può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. 7. Usare appropriati indumenti personali protettivi mentre si lavora con i reagenti forniti. 8. I reagenti eventualmente rovesciati devono essere rimossi immediatamente. Seguire tutte le normative vigenti in materia di eliminazione dei residui di natura chimica. Precauzioni 1. Questo prodotto è stato messo a punto per l uso diagnostico In Vitro. 2. La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel kit può causare risultati non attendibili. 3. Un lavaggio incompleto o non accurato e l insufficiente aspirazione del liquido dai pozzetti ELISA può causare una scarsa precisione e/o un elevato background. 4. L adattamento di questo test all uso con apparecchiature automatiche e altri dispositivi per trattamento dei campioni liquidi, in toto o in parte, può causare differenze nei risultati rispetto a quelli ottenuti mediante la procedura manuale. E responsabilità di ciascun Laboratorio confermare che le procedure automatizzate utilizzate diano risultati entro limiti di accettabilità. 5. Una serie di fattori influenza le prestazioni del test. Essi comprendono l iniziale temperatura dei reagenti, la temperatura dell ambiente, l accuratezza e la riproducibilità della tecnica di pipettamento, la scrupolosità delle operazioni di lavaggio e di aspirazione del liquido dai pozzetti delle piastre ELISA, il tipo di spettrofotometro usato per leggere i risultati e la lunghezza dei tempi di incubazione durante l esecuzione del test. Bisogna prestare molta attenzione alla costanza per ottenere risultati accurati e riproducibili. 6. Si raccomanda di attenersi scrupolosamente alle istruzioni fornite. 7. Una chiusura incompleta della busta richiudibile contenente le strisce di pozzetti ed il materiale essicante causa la degradazione dell antigene ed una scarsa precisione nei risultati. 8. Valori di assorbanza inaccettabilmente bassi possono essere osservati dopo aver usato due o più volte lo stesso flacone di coniugato HRP per un certo periodo di tempo. E importante seguire attentamente le istruzioni fornite per il trattamento del coniugato HRP per evitare tale inconveniente. 9. Un eventuale contaminazione chimica del coniugato HRP può essere conseguenza di una impropria pulizia o risciacquo di apparecchi o di strumenti. Residui di comuni reagenti chimici di laboratorio quali formalina, candeggina, etanolo o detergenti causano la degradazione nel tempo del coniugato HRP. Risciacquare molto accuratamente tutti gli apparecchi e gli strumenti dopo l uso di detergenti chimici. Condizioni di conservazione 1. Conservare tutti i reagenti del kit a 2-8 C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza se conservati e trattati seguendo le istruzioni fornite. 2. Le strisce di pozzetti non utilizzate devono essere rimesse immediatamente nella busta richiudibile contenente il materiale essicante e conservate nella busta ben chiusa a 2-8 C. 3. Il tampone di lavaggio diluito è stabile per 1 settimana a 2-8 C. Raccolta dei campioni Questa tecnica deve essere usata con un campione di siero. L aggiunta al campione di sodio azide o di altri conservanti può influenzare in modo negativo i risultati. Campioni con segni di contaminazione microbica, trattati con calore o contenenti particelle visibili non dovrebbero essere usati. Si dovrebbe evitare anche l uso di sieri fortemente emolizzati o lipemici. 2

3 Dopo il prelievo, il siero dovrebbe essere separato dal coagulo. Il Documento H18-A3 dell NCCLS raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) Conservare i campioni a temperatura ambiente per non più di 8 ore. 2) Se il test non può essere eseguito entro 8 ore, conservare i campioni in frigorifero a 2-8 C. 3) Se il test non può essere eseguito entro 48 ore, oppure per la spedizione dei campioni, congelare a -20 C. I campioni congelati devono essere mescolati bene dopo lo scongelamento e prima di essere testati. 29 Procedura Materiali forniti 1 Piastra microtiter ELISA F-Actin (12-1 x 8 pozzetti), con supporto 1 1,2mL Controllo ELISA Negativo, prediluito 1 1,2mL Controllo ELISA debolmente positivo per IgA F-Actin, prediluito 1 1,2mL Controllo ELISA fortemente positivo per IgA F-Actin, prediluito 1 50mL Diluente per campioni HRP 1 25mL Soluzione di lavaggio HRP concentrata, 40x concentrata 1 10mL Coniugato HRP IgA, (montone), anti-iga umane 1 10mL Cromogeno TMB 1 10mL Soluzione di arresto HRP, 0,344M Acido solforico Materiali richiesti ma non forniti Micropipette in grado di erogare volume di 5, 100, e 500µL Puntali monouso per micropipette Provette per la diluizione dei sieri, volume 4mL Acqua distillata o deionizzata Beuta da 1L per diluite la Soluzione di lavaggio HRP concentrata Lettore per piastre ELISA in grado di leggere a 450nm (e 620nm per le letture a doppia lunghezza d onda) Metodica Prima di incominciare 1. Portare tutti i reagenti ed i campioni a temperatura ambiente (20-26 o C) e mescolarli bene. 2. Diluire la Soluzione di lavaggio HRP concentrata 1:40 aggiungendo il contenuto del flacone fornito con il kit a 975mL di acqua distillata o deionizzata. Se non si usa l intera piastra in una sola volta, si può preparare una minore quantità di soluzione di lavaggio aggiungendo 2,0mL di concentrato a 78mL di acqua distillata o deionizzata ogni 16 pozzetti utilizzati. La soluzione di lavaggio diluita è stabile per 1 settimana a 2-8 o C. 3. Preparare una diluizione 1:101 di ciascun campione da testare aggiungendo 5µL di siero a 500µL di Diluente per campioni HRP. I campioni diluiti devono essere testati entro 8 ore dalla preparazione. NON DILUIRE i Controlli ELISA debolmente positivo per IgA F-Actin, ELISA fortemente positivo per IgA F-Actin ed ELISA Negativo. 4. La determinazione della presenza o dell assenza di IgA F-Actin usando unità arbitrarie richiede due pozzetti per ciascuno dei tre controlli ed uno o due pozzetti per ciascun campione clinico. Si raccomanda di testare i campioni in duplicato. Esecuzione del test 1. TUTTI I REAGENTI DEVONO ESSERE PORTATI A TEMPERATURA AMBIENTE (20-26 C) PRIMA DI INIZIARE IL TEST. Posizionare i pozzetti/le strisce necessarie nel supporto. Rimettere immediatamente la strisce inutilizzate nella busta contenente il materiale essicante e sigillarla bene per minimizzare l esposizione all umidità ambientale. 2. Distribuire 100µL dei Controlli ELISA debolmente positivo per IgA F-Actin, ELISA fortemente positivo per IgA F-Actin ed ELISA Negativo prediluiti e dei sieri diluiti nei rispettivi pozzetti. Coprire i pozzetti ed incubare per 30 minuti a temperatura ambiente su una superficie piana. Il tempo di incubazione inizia dopo l aggiunta dell ultimo campione. 3. Lavaggio: Aspirare completamente il contenuto di ciascun pozzetto. Distribuire µL di soluzione di lavaggio HRP diluita in tutti i pozzetti e quindi aspirarla. Ripetere questa operazione per altre due volte, per un totale di tre lavaggi. Dopo l ultimo lavaggio capovolgere la piastra e scuoterla fermamente su tovaglioli di carta assorbente per rimuovere eventuali residui di liquido. E importante vuotare completamente ciascun pozzetto dopo ciascun lavaggio. Per l aspirazione mantenere la stessa sequenza usata per l aggiunta dei campioni. 4. Distribuire 100μL di Coniugato HRP IgA in ciascun pozzetto. Il coniugato dovrebbe essere prelevato dal flacone mediante tecniche sterili. Prelevare dal flacone solo la quantità di coniugato necessaria per l esecuzione del test. PER EVITARE POSSIBILI CONTAMINAZIONI MICROBICHE E/O CHIMICHE, NON RIMETTERE MAI IL CONIUGATO INUTILIZZATO NEL FLACONE. Incubare i pozzetti per 30 minuti come descritto al punto Lavaggio: Ripetere la procedura descritta al punto Distribuire 100µL di Cromogeno TMB in ciascun pozzetto ed incubare al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. 7. Distribuire 100µL di Soluzione di arresto HRP in ogni pozzetto. Per l aggiunta della Soluzione di arresto HRP mantenere la stessa sequenza e gli stessi tempi utilizzati per l aggiunta del Cromogeno TMB. Agitare gentilmente la piastra con le dita per mescolare completamente i reagenti nei pozzetti. 8. Leggere l assorbanza (OD) di ciascun pozzetto a 450nm entro 1 ora dall aggiunta della soluzione di arresto. Se si preferisce una lettura a doppia lunghezza d onda, si può usare la lunghezza d onda di 3

4 620nm come riferimento. Controllo di qualità 1. I Controlli ELISA debolmente positivo per IgA F-Actin, ELISA fortemente positivo per IgA F-Actin ed ELISA Negativo devono essere inclusi ogni volta che si esegue il test per assicurare che tutti i reagenti ed il test funzionino in modo corretto. 2. Si deve notare che, poichè i Controlli ELISA debolmente positivo per IgA F-Actin, ELISA fortemente positivo per IgA F-Actin ed ELISA Negativo sono prediluiti, essi non rappresentano un controllo procedurale per le tecniche di diluizione utilizzate per i campioni. 3. Ulteriori controlli possono essere inclusi in base alle indicazioni o alle richieste delle vigenti regolamentazioni o delle organizzazioni di accreditamento. Ulteriori sieri di controllo possono essere preparati raccogliendo un pool dei sieri umani, aliquotandolo e conservandolo a < -20 C. 4. Perchè i risultati del test siano considerati validi, tutti i seguenti criteri devono essere soddisfatti. Se anche uno solo non rientra nei valori specificati, i risultati non dovrebbero essere considerati validi ed il test dovrebbe essere ripetuto. a. L assorbanza del Controllo ELISA fortemente positivo per IgA F-Actin prediluito deve essere maggiore di quella del Controllo ELISA debolmente positivo per IgA F-Actin prediluito che a sua volta deve essere maggiore di quella del Controllo ELISA Negativo prediluito. b. Il Controllo ELISA fortemente positivo per IgA F-Actin prediluito deve avere un assorbanza maggiore di 1,0 mentre l assorbanza del Controllo ELISA Negativo prediluito non deve essere maggiore di 0,2. c. L assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo per IgA F-Actin deve essere maggiore di due volte rispetto a quella del Controllo ELISA Negativo oppure >0,25. d. Il Controllo ELISA Negativo e quello ELISA fortemente positivo per IgA F-Actin G servono per controllare un eventuale malfunzionamento dei reagenti. Il Controllo ELISA fortemente positivo per IgA F-Actin non assicura la precisione in corrispondenza del valore soglia del test. e. L utente del test dovrebbe fare riferimento al Documento C24-A3 dell NCCLS per ulteriori informazioni su appropriate tecniche di Controllo di Qualità. 30 Calcolo dei risultati Si deve determinare innanzitutto il valore medio di assorbanza per ciascun set di duplicati. La reattività di ciascun campione viene quindi calcolata dividendo il valore medio di assorbanza del campione per il valore medio di assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo per IgA F-Actin e moltiplicando il risultato per il numero di unità assegnate al Controllo ELISA debolmente positivo per IgA F-Actin, che è stampato sull etichetta del flacone. Assorbanza campione Valore del campione = x Valore Controllo ELISA debolmente positivo per IgA F-Actin (unità) (unità) Assorbanza Controllo ELISA debolmente positivo per IgA F-Actin La reattività è collegata in modo non lineare alla quantità di anticorpi presente. Mentre gli aumenti e le diminuzioni delle concentrazioni degli anticorpi vengono evidenziate da un corrispondente aumento o diminuzione della reattività, il cambiamento non è proporzionale (ad es., un raddoppio della concentrazione di anticorpi non raddoppia necessariamente la reattività). Se si desidera una più accurata quantificazione del contenuto di anticorpi, si possono allestire e testare diluizioni seriate del campione. L ultima diluizione che risulta positiva nel test dovrebbe essere refertata come il titolo anticorpale del paziente. Interpretazione dei risultati Il metodo ELISA è molto sensibile alla procedura ed è in grado di individuare anche piccole differenze nella popolazione dei pazienti. I valori riportati qui di seguito sono solo valori suggeriti. Ciascun Laboratorio dovrebbe stabilire il proprio range di normalità basato sulla procedura da esso utilizzata, sui controlli, sull apparecchiatura e sulla popolazione di pazienti secondo le proprie metodiche standard. I campioni vengono interpretati come negativi, equivoci o positivi in base alla seguente tabella: Unità Negativo < 20 Equivico 20,1 24,9 Positivo > Un risultato IgA anti-f-actina positivo in pazienti con malattia celiaca indica una maggiore probabilità di grave atrofia dei villi intestinali. 2. Un risultato negativo indica l assenza di IgA dirette contro F-Actin oppure la loro presenza a livelli inferiori al limite di sensibilità del metodo. 3. Sul referto si dovrebbe riportare la seguente frase: I seguenti risultati sono stati ottenuti mediante il test QUANTA Lite TM F-Actin IgA ELISA della INOVA. I valori di IgA F-Actin ottenuti con test prodotti da altre Ditte possono non essere utilizzabili in modo intercambiabile. Il livello di IgA determinato con questo metodo non può essere correlato ad un titolo endpoint. Limitazioni del test 1. La presenza nel campione di complessi immuni o di altri aggregati di immunoglobuline può causare un aumento del livello di reazioni a specifiche con conseguenti risultati falsi positivi con questo test. 4

5 2. Non tutti i pazienti celiaci sono positivi agli anticorpi IgA anti -F-Actina. 3. Non tutti i campioni positivi per il muscolo liscio presentano anticorpi IgA anti-f-actina. 4. L individuazione di anticorpi IgA anti-f-actina nei pazienti con malattia epatica deve essere interpretata con cautela dato che la presenza di anticorpi IgG anti-f-actina in questo gruppo di malattie è spesso accompagnata da anticorpi IgA anti-f-actina che può non essere correlata a una patologia intestinale. Gli anticorpi IgA anti-f-actina devono essere misurati solo nei pazienti con malattia celiaca quale ausilio alla valutazione del danno intestinale. 5. I risultati di questo test devono essere valutati dal medico curante alla luce del quadro clinico del paziente e del risultato degli altri test sierologici. 6. Le prestazioni caratteristiche del test non sono state valutate per campioni diversi dal siero. Dati sulle prestazioni Valori attesi Range normale Un gruppo di 500 campioni raccolti da individui apparentemente sani (250 maschi e 250 femmine) sono stati sottoposti a test mediante kit QUANTA Lite TM F-Actin IgA ELISA. L'età dei soggetti era compresa tra 18 e 80 anni (valore mediano 41). La specificità del test era pari a 92,2% (461/500). Tre dei 39 campioni erano positivi agli anticorpi IgA anti-ttg e pertanto possibili pazienti celiaci non diagnosticati. Uno di questi tre campioni era anche endomisio positivo e di conseguenza un celiaco vero praticamente certo. La prevalenza della malattia celiaca nella popolazione USA normale è stata stimata pari a 1:133 e quindi l'individuazione di pazienti celiaci non diagnosticati nella coorte normale non è un evento inatteso. 26 Sensibilità e Specificità Clínica Dato che l uso previsto del test QUANTA Lite TM F-Actin IgA è valutare la probabilità di danno intestinale nei pazienti con malattia celiaca, la sensibilità e la specificità sono state calcolate sulla base di 445 campioni con risultati bioptici. Dei 445 campioni, 157 presentavano una patologia con classe di Marsh 3 e 288 una patologia con classe di Marsh 0, 1 o N =445 Marsh Segno F-Actin IgA Unità M3a/b/c M0,M1,M2 Totale Pos (>24,9 unità) Neg (<24,9 unità) Totale I risultati equivoci sono stati conteggiati come negativi (vale a dire non positivi) Sensibilità Clínica: 48,4% (76/157) (95% CI, 40,4% to 56,5%) Specificità Clínica: 95,1% (274/288) (92,0 97,3%) Positivo Predittivo valore: 84,4% Negativo Predittivo valore: 88,4% Efficienza: 78,7% Se i calcoli vengono eseguiti utilizzando solo M3c (atrofia villosa totale) come indice di riferimento, la sensibilità e la specificità sono rispettivamente pari al 59,4% e al 91,3% come mostrato di seguito. N =445 Marsh Segno F-Actin IgA Unità M3c Non-M3c Totale Pos (>24,9 unità) Neg (<24,9 unità) Totale I risultati equivoci sono stati conteggiati come negativi (vale a dire non positivi) Sensibilità Clínica: 59,4% (60/101) (95% CI, 49,2% to 69,1%) Specificità Clínica: 91,3% (314/344) (87,7 94,0%) Positivo Predittivo valore: 66,7% Negativo Predittivo valore: 88,5 Efficienza: 78,7% Confronto con un predicate device Il test QUANTA Lite TM F-Actin IgA ELISA è stato confrontato con un dispositivo autorizzato dall FDA per il rilevamento di anticorpi IgA al marker della malattia celiaca transglutaminasi tissutale (ttg). La concordanza delle percentuali positive è risultata pari a 74/128 = 57,8% mentre la concordanza delle percentuali negative è risultata pari a 27/29 = 93,1% quando i pazienti celiaci con classificazione di Marsh 3a 3b, o 3c sono stati sottoposti a test con i due dispositivi. Quando sono stati testati solo gli individui con patologia Marsh 3c (atrofia villosa totale), la concordanza delle percentuali positive è risultata pari a 60/98 = 61,2% e la concordanza delle percentuali negativi pari a 3/3 = 100%. Mentre la maggior parte dei campioni F-Actina IgA positivi sono anche ttg positivi, solo i pazienti celiaci con grave danno intestinale sono F-Actina IgA positivi. Reazioni crociate I sieri di 36 pazienti con anticorpi a malattie autoimmuni/infettive oppure i sieri con uno stato patologico specifico tra cui cellule parietali gastriche, RNP, SS-A,SS-B, Scl-70, Jo-1, membrana basale glomerulare, LKM-1, antigene epatico solubile, centromero, cromatina, epatite autoimmune, cirrosi biliare primitiva, virus 5

6 dell'epatite B, virus dell'epatite C, colangite sclerosante primitiva, sono stati sottosposti a reattività incrociata con il test QUANTA Lite TM F-Actin IgA ELISA. Numerosi campioni con malattia epatica erano positivi agli anticorpi anti-f-actina. L individuazione di anticorpi IgA anti-f-actina nei pazienti con malattia epatica deve essere interpretata con cautela dato che la presenza di anticorpi IgG anti-f-actina in questo gruppo di malattie è spesso accompagnata da anticorpi IgA anti-f-actina e questi possono non essere correlati a una patologia intestinale. Precisione e riproducibilità Le prestazioni intra-test sono state valutate analizzando 6 campioni per un totale di 7 volte ciascuno. Tabella 1: Prestazioni intra-test del ELISA QUANTA Lite TM F-Actin IgA ELISA Spec. 1 Spec. 2 Spec. 3 Spec. 4 Spec. 5 Spec. 6 Unità medie 104, , ,4 Deviazione standard 2,4 7 0,3 1,5 0,4 0,4 Coefficiente di variazione % 2,3 4,6 0,9 3,8 3,0 2,6 Le prestazioni fra i saggi sono state valutate esaminando in doppio 6 campioni, il controllo positivo alto (HPC) ed il controllo negativo (NC) del kit due volte al giorno (una al mattino ed una alla sera) per 3 giorni. Tabella 2: Prestazioni inter-test del ELISA QUANTA Lite TM F-Actin IgA ELISA HPC Spec. 1 Spec. 2 Spec. 3 Spec. 4 Spec. 5 Spec. 6 NC Unità medie 78,3 104,8 156,8 41,5 41,1 14,8 17,0 1,0 Deviazione standard 4,7 6,6 5,8 1,7 2,6 0,7 0,8 0,1 Coefficiente di variazione % 6,0 6,3 3,7 4,2 6,4 5,0 4,7 10,5 Bibliografia 1. Gabbiani, G. et al. Human smooth muscle autoantibody. Its identification as antiactin antibody and a study of its binding to "nonmuscular" cells. Am J Pathol 72, (1973). 2. Anderson, P. Studies on the specificity of smooth-muscle antibodies. Clin Exp Immunol 26, (1976). 3. Bottazzo, G. F. et al. Classification of smooth muscle autoantibodies detected by immunofluorescence. J Clin Pathol 29, (1976). 4. Toh, B. H. Smooth muscle autoantibodies and autoantigens. Clin Exp Immunol 38, (1979). 5. Toh, B. H. et al. Viral infections and IgM autoantibodies to cytoplasmic intermediate filaments. Clin Exp Immunol 37, (1979). 6. Andersen, P., Small, J. V., Andersen, H. K. & Sobieszek, A. Reactivity of smooth-muscle antibodies with F- and G-actin. Immunology 37, (1979). 7. Bretherton, L. et al. ELISA assay for IgG autoantibody to G-actin: comparison of chronic active hepatitis and acute viral hepatitis. Clin Exp Immunol 51, (1983). 8. Kurki, P. Determination of anti-actin antibodies by a solid-phase immunoenzymatic assay and by indirect immunofluorescence technique. Clin Immunol Immunopathol 11, (1978). 9. Dighiero, G., Lymberi, P., Monot, C. & Abuaf, N. Sera with high levels of anti-smooth muscle and anti-mitochondrial antibodies frequently bind to cytoskeleton proteins. Clin Exp Immunol 82, 52-6 (1990). 10. De Scheerder, I. et al. Post-cardiac injury syndrome and an increased humoral immune response against the major contractile proteins (actin and myosin). Am J Cardiol 56, (1985). 11. Leibovitch, L., George, J., Levi, Y., Bakimer, R. & Shoenfeld, Y. Anti-actin antibodies in sera from patients with autoimmune liver diseases and patients with carcinomas by ELISA. Immunol Lett 48, (1995). 12. Frenzel, C. et al. Evaluation of F-Actin ELISA for the diagnosis of autoimmune hepatitis. Am J Gastroenterol 101, (2006). 13. Czaja, A. J., Cassani, F., Cataleta, M., Valentini, P. & Bianchi, F. B. Frequency and significance of antibodies to actin in type 1 autoimmune hepatitis. Hepatology 24, (1996). 14. Kurki, P. et al. Different types of smooth muscle antibodies in chronic active hepatitis and primary biliary cirrhosis: their diagnostic and prognostic significance. Gut 21, (1980). 15. Granito, A. et al. Antibodies to filamentous actin (F-Actin) in type 1 autoimmune hepatitis. J Clin Pathol 59, (2006). 16. Liaskos, C., Bogdanos, D. P., Davies, E. T. & Dalekos, G. N. Diagnostic relevance of anti-filamentous actin antibodies in autoimmune hepatitis. J Clin Pathol 60, (2007). 17. Fagraeus, A. & Norberg, R. Anti-actin antibodies. Curr Top Microbiol Immunol 82, 1-13 (1978). 18. Carroccio, A. et al. IgA anti-actin antibodies ELISA in coeliac disease: A multicentre study. Dig Liver Dis 39, (2007). 19. Carroccio, A. et al. Anti-actin antibodies in celiac disease: correlation with intestinal mucosa damage and comparison of ELISA with the immunofluorescence assay. Clin Chem 51, (2005). 20. Clemente, M. G. et al. Immune reaction against the cytoskeleton in coeliac disease. Gut 47,520-6 (2000). 21. Clemente, M. G. et al. Detection of Autoantibodies against Enterocyte Actin Filaments as Serological Predictive Test for Intestinal Villous Atrophy in Celiac Disease: Results of a Polycentric Study. Gastroenterology 124, A-660 (2003). 22. Granito, A. et al. Anti-actin IgA antibodies in severe coeliac disease. Clin Exp Immunol 137, (2004). 6

7 23. Pedreira, S. et al. Significance of smooth muscle/anti-actin autoantibodies in celiac disease. Acta Gastroenterol Latinoam 35, (2005). 24. Norman, G. L. et al. in Association of Medical Laboratory Immunologists (Chicago, Ill, 2007). 25. Clemente, M. G. et al. Enterocyte actin autoantibody detection: a new diagnostic tool in celiac disease diagnosis: results of a multicenter study. Am J Gastroenterol 99, (2004). 26. Fasano, A. et al. Prevalence of celiac disease in at-risk and not-at-risk groups in the United States: a large multicenter study. Arch Intern Med 163, (2003). 27. Antonioli, D. A. Celiac disease: a progress report. Mod Pathol 16, (2003). 28. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institutes of Health, 2007, Fifth Edition. 29. CLSI (NCCLS). Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guideline-Third Edition. CLSI Document H18-A3, Vol 24(38): CLSI (NCCLS). Feb Statistical quality control: Principles and definitions: Approved Guideline Third Edition. CLSI Document C24-A3, Vol 26(25):1999 Fornitore: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Rappresentante Autorizzato: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service ITA April 2008 Revision 0 7