QUANTA Lite β 2 GPI IgG ELISA Per uso diagnostico in vitro Complessità CLIA: elevata

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1 QUANTA Lite β 2 GPI IgG ELISA Per uso diagnostico in vitro Complessità CLIA: elevata Finalità d uso QUANTA Lite β 2 GPI IgG è un test immunoenzimatico semi-quantitativo per la ricerca delle IgG dirette contro la β 2 glicoproteina I (β 2 GPI). Gli anticorpi anti β 2 GPI rappresentano un aiuto nella diagnosi di alcuni disordini trombotici autoimmuni, come quelli secondari al lupus eritematoso sistemico (LES) o altri disordini simili al lupus. Riassunto e Spiegazione del test Gli anticorpi anti-cardiolipina (ACA) sono fortemente associati a trombosi venosa ed arteriosa. 1-5 Questi dati sono stati osservati per la prima volta nel corso di studi sul lupus eritematoso sistemico, una malattia che tra i sintomi comprende la trombosi. 6,7 Studi più recenti 8-12 hanno dimostrato che gli anticorpi anti-cardiolipina, prodotti dai pazienti affetti da LES, hanno bisogno di un cofattore sierico di 50kD per legarsi alla cardiolipina adsorbita sulla parete dei pozzetti. Il cofattore è stato identificato nella β 2 -glicoproteina I detta anche apolipoproteina H. 8,12,13,14 Mentre la β 2 GPI era nota come un inibitore in vitro della catena intrinseca della coagulazione del sangue, 15 dell aggregazione ADP-dipendente 16 e dell attività protrombinasica delle piastrine attivate, 17 la sua funzione fisiologica è ancora sconosciuta. Sembra che gli anticorpi anti-cardiolipina presenti nei pazienti con sindrome anti-fosfolipidica (APS) siano in grado di riconoscere una struttura modificata della β 2 GPI e non la cardiolipina, la β 2 GPI nativa o un epitopo strutturalmente definito sia dalla cardiolipina che dalla β 2 GPI Galli et al. 9 e Viard et al. 18 hanno segnalato separatamente che anticorpi anti-cardiolipina nei pazienti con malattie autoimmuni (ad es., LES e/o APS) erano diretti contro la molecula di β 2 GPI adsorbita sulle piastre di polistirene. Koike 11 e Matsuura 12 hanno dimostrato definitivamente che la β 2 GPI è l antigene al quale molti anticorpi anti-cardiolipina si legano effettivamente ed inoltre che il fosfolipide serve solo per legare la β 2 GPI alla fase solida. I test tradizionali per la ricerca di anticorpi anti-cardiolipina sono caratterizzati da un ben noto rischio di ottenere risultati falsi positivi a causa delle reazioni crociate da parte dei fosfolipidi con i campioni positivi per certe malattie infettive, soprattutto sifilide, ed anche con certi altri tipi di autoanticorpi quali quelli anti-dna a doppia elica. 2,3 Eliminando il fosfolipide dalla fase solida ed usando solo la β 2 GPI, il test diventa ancora più specifico per l individuazione di possibili problemi di coagulazione. Questa aumentata specificità è stata definitivamente dimostrata da numerosi gruppi di ricerca. 11,12,16,17,19,20,21,22 La ricerca degli anticorpi anti-β 2 GPI rappresenta un test utile e più specifico da usare parallelamente ai test tradizionali per la ricerca di anticorpi anti-cardiolipina ed ai test anticoagulanti per il lupus come aiuto per la diagnosi di trombosi nei pazienti a rischio. Gli anticorpi anti-β 2 GPI della classe IgG sono stati trovati in 17/47 pazienti affetti da LES (36%). 18 Nove di questi 47 pazienti erano colpiti da trombosi ed 8 (89%) presentavano anticorpi anti-β 2 GPI. Hisham et al. 20 hanno trovato anticorpi anti-β 2 GPI della classe IgG in tutti i pazienti (5/5, 100%) con almeno 2 manifestazioni cliniche documentate di APS. Questi 5 pazienti sono stati classificati come positivi ad alto titolo di anticorpi anti-β 2 GPI. Otto pazienti su 14 (57%), classificati come positivi a basso titolo di anticorpi anti-β 2 GPI, avevano avuto almeno 1 episodio di trombosi. Tsutsumi et al.22 hanno individuato anticorpi anti-β 2 GPI della classe IgG ed IgM nel 10,1% e nel 5,8% rispettivamente di un gruppo di 308 pazienti giapponesi affetti da LES selezionati a caso. Gli anticorpi anti-β 2 GPI della classe IgG erano più comuni nei pazienti con anamnesi di trombosi. Inoltre, il 20% di 15 pazienti senza perdite fetali ricorrenti era positivo per IgG anti-β 2 GPI. Questi Ricercatori hanno inoltre dimostrato che i pazienti con anamnesi di trombosi avevano una maggiore probabilità di essere positivi per IgM anti-β 2 GPI e che i livelli di IgM anti-β 2 GPI erano maggiori nel gruppo di pazienti con trombosi rispetto a quelli senza. Nessuno dei 15 patients senza anamnesi di perdite fetali ricorrenti era positivo per IgM anti-β 2 GPI. Cabiedes et al. 23 hanno stidiato 94 pazienti con LES, 39 dei quali presentavano sintomi clinici di APS. L associazione delle manifestazioni cliniche di APS era più consistentemente associata alla presenza di anticorpi anti-β 2 GPI rispetto alla positività di test convenzionali per ACA Gli anticorpi anti-β 2 GPI della classe IgG erano presenti nel siero di 16/18 pazienti (89%) con APS. Su 22 pazienti positivi per ACA ma senza manifestazioni cliniche di APS, nessuno era positivo per anticorpi anti-β 2 GPI. Cerrato et al. 24 hanno individuato anticorpi anti-β 2 GPI della classe IgG nell 87,5% di un gruppo di 32 pazienti con anamnesi di episodi trombotici (APS). Gli anticorpi anti-β 2 GPI della classe IgM sono stati individuati nel 71,9% di questo stesso gruppo di 32 pazienti. Sebastiani et al. 25 hanno rilevato la presenza di IgG anti-β 2 GPI in 110 pazienti (20,3%) e di IgM in 109 pazienti (20,1%) su un totale di 542 pazienti affetti da LES. La presenza di anticorpi anti-β 2 GPI era fortemente associata a quella di anticorpi ACA (p < 10-5 ). Essi hanno inoltre dimostrato che gli anticorpi anti-β 2 GPI delle classi IgG ed IgM erano associati a trombosi sia arteriosa che venosa. Principio della Metodica L antigene purificato β 2 GPI è adsorbito sulla parete dei pozzetti di una micropiastra di polistirene in condizioni adatte a conservare l antigene nel suo stato nativo. I controlli pre-diluiti ed i sieri diluiti dei pazienti vengono distribuiti nei pozzetti, consentendo agli anticorpi anti-β 2 eventualmente presenti di legarsi all antigene adsorbito. L eccesso di campione non legato viene allontanato mediante il lavaggio; successivamente si aggiunge in ciascun pozzetto un siero anti-igg umane marcato con un enzima. Una seconda incubazione consente agli anticorpi anti-igg umane marcati con l enzima di legarsi agli anticorpi del paziente che sono eventualmente legati alla parete dei pozzetti. Dopo ulteriore lavaggio per allontanare l eccesso di anticorpi anti-igg viene aggiunto il substrato per la perossidasi, che subisce un cambiamento di colore in presenza dell enzima coniugato. Dopo l arresto della reazione enzimatica, la presenza o l assenza di anticorpi anti-β 2 GPI viene determinata paragonando il valore di assorbanza del campione a quello di una curva di calibrazione a cinque punti. Lo standard utilizzato per costruire questa curva è standardizzato con i calibratori di riferimento per IgG anti-β 2 -Glycoprotein I disponibili presso il Rheumatology Lab, Seton Hall University, St. Joseph's Hospital and Medical Center. 26 I risultati vengono refertati in modo semi-quantitativo esprimendoli in unità standard di IgG anti-β 2 GPI (SGU). 1

2 Reagenti 1. Micropiastra ELISA in polistirene adsorbita con antigene β 2 GPI purificato (12-1 x 8 pozzetti), con supporto, in busta chiusa contenente materiale essicante 2. Controllo ELISA Negativo, 1 flacone di tampone contenente conservante e siero umano senza IgG anticorpi umani anti-β 2, prediluito, 1,2mL 3. Controllo ELISA β 2 GPI IgG, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi IgG umani anti-β 2 GPI, prediluito, 1,2mL 4. Calibratore A ELISA β 2 GPI IgG, 1 flacone di tampone contenente conservante ed IgG anticorpi umani anti-β 2 5. Calibratore B ELISA β 2 GPI IgG, 1 flacone di tampone contenente conservante ed IgG anticorpi umani anti-β 2 6. Calibratore C ELISA β 2 GPI IgG, 1 flacone di tampone contenente conservante ed IgG anticorpi umani anti-β 2 7. Calibratore D ELISA β 2 GPI IgG, 1 flacone di tampone contenente conservante ed IgG anticorpi umani anti-β 2 8. Calibratore E ELISA β 2 GPI IgG, 1 flacone di tampone contenente conservante ed IgG anticorpi umani anti-β 2 9. Diluente per campioni HRP, 1 flacone di colore rosa, contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris, Tween 20, stabilizzatori delle proteine e conservante, 50mL 10. Soluzione di lavaggio HRP Concentrata, 1 flacone di soluzione concentrata 40x di colore rosso, contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris e Tween 20, 25mL. Vedi la Sezione Metodi per le istruzioni sulla diluizione. 11. Coniugato β 2 HRP IgG, (montone), siero anti-igg umane, 1 flacone di colore blu, contenente tampone, stabilizzatori delle proteine e conservante, 10mL 12. Cromogeno TMB, 1 flacone contenente stabilizzatori, 10mL 13. Soluzione di arresto HRP, Acido solforico 0,344M, 1 flacone incolore, 10mL Avvertenze 1. ATTENZIONE: Questo prodotto contiene un composto chimico (cloramfenicolo allo 0,02%) nel diluente per i campioni, nei controlli e nel coniugato, noto allo Stato della California come causa di tumori. 2. Tutte le fonti umane di materiali usati nella preparazione dei controlli per questo prodotto sono state testate e sono risultate negative per la presenza di anticorpi anti-hiv, per HBsAg e per anticorpi anti-hcv mediante metodi approvati dall FDA. Tuttavia nessun test offre la certezza completa dell assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i Controlli ELISA β 2 GPI IgG, ELISA Negativo, ed i Calibratori ELISA β 2 GPI IgG devono essere maneggiati come materiali potenzialmente infettivi La sodio azide è usata come conservante. La sodio azide è un veleno e può essere tossica se ingerita o assorbita attraverso la cute o gli occhi. La sodio azide può reagire con le tubature di piombo o rame formando azidi metalliche potenzialmente esplosive. Per prevenire la formazione di azidi, lasciar scorrere grandi quantità di acqua, se si usa un lavandino per eliminare i reagenti. 4. Il Coniugato HRP contiene un composto chimico velenoso/corrosivo, che può essere tossico se ingerito in quantità elevate. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. 5. Il Cromogeno TMB contiene un irritante, che può essere dannoso se inalato, ingerito o assorbito attraverso la cute. Per prevenire lesioni, evitare l inalazione, l ingestione o il contatto con la cute e con gli occhi. 6. La Soluzione di arresto HRP è costituita da una soluzione di acido solforico diluito. Evitare l esposizione a basi, metalli o altri composti che possono reagire con gli acidi. L acido solforico è velenoso e corrosivo e può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. 7. Usare appropriati indumenti personali protettivi mentre si lavora con i reagenti forniti. 8. I reagenti eventualmente rovesciati devono essere rimossi immediatamente. Seguire tutte le normative vigenti in materia di eliminazione dei residui di natura chimica. Precauzioni 1. Questo prodotto è stato messo a punto per l uso diagnostico in vitro. 2. La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel kit può causare risultati non attendibili. 3. Un lavaggio incompleto o non accurato e l insufficiente aspirazione del liquido dai pozzetti ELISA può causare una scarsa precisione e/o un elevato background. 4. L adattamento di questo test all uso con apparecchiature automatiche e altri dispositivi per trattamento dei campioni liquidi, in toto o in parte, può causare differenze nei risultati rispetto a quelli ottenuti mediante la procedura manuale. E responsabilità di ciascun Laboratorio confermare che le procedure automatizzate utilizzate diano risultati entro limiti di accettabilità. 5. Una serie di fattori influenza le prestazioni del test. Essi comprendono l iniziale temperatura dei reagenti, la temperatura dell ambiente, l accuratezza e la riproducibilità della tecnica di pipettamento, la scrupolosità delle operazioni di lavaggio e di aspirazione del liquido dai pozzetti delle piastre ELISA, il tipo di spettrofotometro usato per leggere i risultati e la lunghezza dei tempi di incubazione durante l esecuzione del test. Bisogna prestare molta attenzione alla costanza per ottenere risultati accurati e riproducibili. 6. Si raccomanda di attenersi scrupolosamente alle istruzioni fornite. 7. Una chiusura incompleta della busta contenente le strisce di pozzetti ed il materiale essicante causa la degradazione dell antigene ed una scarsa precisione nei risultati. 8. Valori di assorbanza inaccettabilmente bassi possono essere osservati dopo aver usato due o più volte lo stesso flacone di coniugato HRP per un certo periodo di tempo. E importante seguire attentamente le istruzioni fornite per il trattamento del coniugato HRP per evitare tale inconveniente. 9. Un eventuale contaminazione chimica del coniugato HRP può essere conseguenza di una impropria pulizia o risciacquo di apparecchi o di strumenti. Residui di comuni reagenti chimici di laboratorio quali formalina, candeggina, etanolo o detergenti causano la degradazione nel tempo del coniugato HRP. Risciacquare molto accuratamente tutti gli apparecchi e gli strumenti dopo l uso di detergenti chimici. 2

3 Condizioni di conservazione 1. Conservare tutti i reagenti del kit a 2-8 C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza se conservati e trattati seguendo le istruzioni fornite. 2. Le strisce di pozzetti non utilizzate devono essere rimesse immediatamente nella busta richiudibile contenente il materiale essicante e conservate nella busta ben chiusa a 2-8 C. 3. Il tampone di lavaggio diluito è stabile per 1 settimana a 2-8 C. Raccolta dei campioni Questa tecnica deve essere usata con un campione di siero. L aggiunta al campione di sodio azide o di altri conservanti può influenzare in modo negativo i risultati. Campioni con segni di contaminazione microbica, trattati al calore o contenenti particelle visibili non dovrebbero essere usati. Si dovrebbe evitare anche l uso di sieri fortemente emolizzati o lipemici. Dopo il prelievo, il siero dovrebbe essere separato dal coagulo. Il Documento H18-A2 dell CLSI (Precedentemente NCCLS) raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) Conservare i campioni a temperatura ambiente per non più di 8 ore. 2) Se il test non può essere eseguito entro 8 ore, conservare i campioni in frigorifero a 2-8 C. 3) Se il test non può essere eseguito entro 48 ore, oppure per la spedizione dei campioni, congelare a -20 C. I campioni congelati devono essere mescolati bene dopo lo scongelamento e prima di essere testati. Procedura Materiali forniti 1 Micropiastra ELISA β 2 GPI (12-1 x 8 pozzetti), con supporto 1 1,2mL Controllo ELISA Negativo prediluito 1 1,2mL Controllo ELISA β 2 GPI IgG, prediluito 1 1,2mL Calibratore A ELISA β 2 GPI IgG, prediluito 1 1,2mL Calibratore B ELISA β 2 GPI IgG, prediluito 1 1,2mL Calibratore C ELISA β 2 GPI IgG, prediluito 1 1,2mL Calibratore D ELISA β 2 GPI IgG, prediluito 1 1,2mL Calibratore E ELISA β 2 GPI IgG, prediluito 1 50mL Diluente per campioni HRP 1 25mL Soluzione di lavaggio HRP concentrata, 40x concentrata 1 10mL Coniugato β 2 HRP IgG, (montone), anti-igg umane 1 10mL Cromogeno TMB 1 10mL Soluzione di stop HRP, 0,344M Acido solforico Materiali richiesti ma non forniti Micropipette in grado di erogare volume di 5, 100, e 500µL Puntali monouso per micropipette Provette per la diluizione dei sieri, volume 4mL Acqua distillata o deionizzata Beuta da 1L per diluite la Soluzione di lavaggio HRP concentrata Lettore di micropiastra ELISA in grado di leggere a 450nm (e 620nm per le letture a doppia lunghezza d onda) Metodica Prima di incominciare 1. Portare tutti i reagenti ed i campioni a temperatura ambiente (20-26 o C) e mescolarli bene. 2. Diluire la Soluzione di lavaggio HRP concentrata 1:40 aggiungendo il contenuto del flacone fornito con il kit a 975mL di acqua distillata o deionizzata. Se non si usa l intera piastra in una sola volta, si può preparare una minore quantità di soluzione di lavaggio aggiungendo ad esempio, 2,0mL di concentrato a 78mL di acqua distillata o deionizzata ogni 16 pozzetti utilizzati. La soluzione di lavaggio diluita è stabile per 1 settimana a 2-8 o C. 3. Preparare una diluizione 1:101 di ciascun campione da testare aggiungendo 5µL di siero a 500µL di Diluente per campioni HRP. I campioni diluiti devono essere testati entro 8 ore dalla preparazione. NON DILUIRE i Calibratori ELISA β 2 GPI IgG, il Controllo ELISA β 2 GPI IgG ed ELISA Negativo. 4. La determinazione della presenza o dell assenza di anticorpi anti β 2 richiede due pozzetti per ciascuno dei tre controlli ed uno o due pozzetti per ciascun campione clinico. Si raccomanda di testare i campioni in duplicato. 5. Preparazione della curva standard: Per i punti da A a E della curva standard a cinque punti, utilizzare i Calibratori ELISA β 2 GPI IgG NON DILUITI da A a E direttamente dalla fiala. La curva standard a cinque punti ha i seguenti valori: Punto n. Unità Standard di IgG β 2 GPI (SGU) A Calibratore A ELISA β 2 GPI IgG prediluito 150,0 B Calibratore B ELISA β 2 GPI IgG prediluito 75,0 C Calibratore C ELISA β 2 GPI IgG prediluito 37,5 D Calibratore D ELISA β 2 GPI IgG prediluito 18,8 o 18,75 E Calibratore E ELISA β 2 GPI IgG prediluito 9,4 o 9,375 Esecuzione del test 1. TUTTI I REAGENTI DEVONO ESSERE PORTATI A TEMPERATURA AMBIENTE (20-26 o C) PRIMA DI INIZIARE IL TEST. Posizionare i pozzetti/le strisce necessarie nel supporto. Rimettere immediatamente la strisce inutilizzate nella busta contenente il materiale essicante e sigillarla bene per minimizzare l esposizione all umidità ambientale. 2. Distribuire 100 µl di ciascuno dei cinque calibratori, dei campioni diluiti, del Controllo Negativo e del Controllo β 2 GPI IgG nei pozzetti corrispondenti. NOTA: Sia il Controllo β 2 GPI IgG sia il Controllo Negativo sono pre-diluiti e pronti all uso. Il valore ed il range di accettabilità del Controllo β 2 GPI IgG è stampato sull etichetta del flacone. Se il valore del Controllo non rientra nel range di accettabilità stampato sull etichetta, si consiglia di ripetere il test. 3

4 3. Coprire i pozzetti ed incubare per 30 minuti a temperatura ambiente su una superficie piana. Il tempo di incubazione inizia dopo l aggiunta dell ultimo campione. 4. Lavaggio: Aspirare completamente il contenuto di ciascun pozzetto. Distribuire µL di soluzione di lavaggio HRP diluita in tutti i pozzetti e quindi aspirarla. Ripetere questa operazione per altre due volte, per un totale di tre lavaggi. Dopo l ultimo lavaggio capovolgere la piastra e scuoterla fermamente su tovaglioli di carta assorbente per rimuovere eventuali residui di liquido. E importante vuotare completamente ciascun pozzetto dopo ciascun lavaggio. Per l aspirazione mantenere la stessa sequenza usata per l aggiunta dei campioni. 5. Distribuire 100μL di Coniugato β 2 HRP IgG in ciascun pozzetto. Il coniugato dovrebbe essere prelevato dal flacone mediante tecniche sterili. Prelevare dal flacone solo la quantità di coniugato necessaria per l esecuzione del test. PER EVITARE POSSIBILI CONTAMINAZIONI MICROBICHE E/O CHIMICHE, NON RIMETTERE MAI IL CONIUGATO INUTILIZZATO NEL FLACONE. Incubare i pozzetti per 30 minuti come descritto al punto Lavaggio: Ripetere la procedura descritta la punto Distribuire 100µL di Cromogeno TMB in ciascun pozzetto ed incubare al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. 8. Distribuire 100µL di Soluzione di arresto HRP in ogni pozzetto. Per l aggiunta della Soluzione di arresto HRP mantenere la stessa sequenza e gli stessi tempi utilizzati per l aggiunta del Cromogeno TMB. Agitare gentilmente la piastra con le dita per mescolare completamente i reagenti nei pozzetti. 9. Leggere l assorbanza (OD) di ciascun pozzetto a 450nm entro 1 ora dall aggiunta della soluzione di arresto. Se si preferisce una lettura a doppia lunghezza d onda, si può usare la lunghezza d onda di 620nm come riferimento. Controllo di qualità 1. I Calibratori ELISA β 2 GPI IgG, il Controllo ELISA β 2 GPI IgG ed il Controllo ELISA Negativo devono essere inclusi ogni volta che si esegue il test per assicurare che tutti i reagenti funzionino in modo corretto. 2. Poichè i Calibratori ELISA β 2 GPI IgG, il Controllo ELISA β 2 GPI IgG ed il Controllo Negativo sono prediluiti, essi non rappresentano un controllo procedurale per le tecniche di diluizione utilizzate per i campioni. 3. Ulteriori controlli possono essere inclusi in base alle indicazioni o alle richieste delle vigenti regolamentazioni o delle organizzazioni di accreditamento. Ulteriori sieri di controllo possono essere preparati raccogliendo un pool dei sieri umani, aliquotandolo e conservandolo a < -20 C. 4. Affinché i risultati del test possano essere considerati validi, tutti i seguenti criteri devono essere soddisfatti. Se anche uno solo non rientra nei valori specificati, i risultati non dovrebbero essere considerati validi ed il test dovrebbe essere ripetuto. a. L assorbanza del Calibratore A ELISA β 2 GPI IgG prediluito deve essere maggiore di quella del Controllo ELISA β 2 GPI IgG prediluito che a sua volta deve essere maggiore di quella del Controllo ELISA Negativo prediluito. b. Il Calibratore A ELISA β 2 GPI IgG prediluito deve avere un assorbanza maggiore di 1,0 mentre l assorbanza del Controllo ELISA Negativo prediluito non deve essere maggiore di 0,2. c. L assorbanza del Controllo ELISA β 2 GPI IgG deve essere maggiore di due volte rispetto a quella del Controllo ELISA Negativo oppure maggiore di 0,25. d. La concentrazione di Controllo ELISA β 2 GPI IgG deve risultare compresa nel range indicato sulla relativa etichetta. e. L utente del test dovrebbe fare riferimento al Documento C24-A dell CLSI (Precedentemente NCCLS) per ulteriori informazioni su appropriate tecniche di Controllo di Qualità. Calcolo dei risultati 1. Determinare il valore medio per tutte le letture in duplicato. 2. Tracciare la curva di assorbanza media del Calibratore per il test IgG contro il logaritmo delle rispettive concentrazioni. Usare una linea best fit oppure, in alternativa, una curva log/log. 3. Determinare per interpolazione la concentrazione ignota di IgG anti-β 2 GPI espressa in Unità Standard di IgG anti-β 2 GPI (SGU) sull asse delle "X" leggendo l assorbanza sull asse delle "Y". I Calibratori ed i Controlli di questo kit sono stati standardizzati con i calibratori di riferimento per IgG anti-β 2 -Glicoproteina. 4. Il range di valori negativi varia da 0 a 20 unità. I campioni positivi presentano valori maggiori di 20 SGU. Interpretazione dei risultati Il metodo ELISA è molto sensibile alla procedura ed è in grado di individuare anche piccole differenze di concentrazione anticorpale nella popolazione dei pazienti. Ciascun Laboratorio dovrebbe stabilire il proprio range di normalità basato sulla procedura da esso utilizzata, sui controlli, sull apparecchiatura e sulla popolazione di pazienti secondo le proprie metodiche standard. 1. Un risultato positivo indica la presenza di anticorpi diretti contro β 2 e suggerisce la possibilità della presenza di alcuni disordini trombotici autoimmuni, come quelli secondari al lupus eritematoso sistemico (LES) o altri disordini simili al lupus. 2. Un risultato negativo indica l assenza di anticorpi diretti contro β 2 oppure la loro presenza a livelli inferiori al limite di sensibilità del metodo. 3. Sul referto si dovrebbe riportare la seguente frase: I seguenti risultati sono stati ottenuti mediante il test QUANTA Lite β 2 GPI IgG ELISA della INOVA. I valori β 2 ottenuti con test prodotti da altre Ditte possono non essere utilizzabili in modo intercambiabile. Il livello di IgG determinato con questo metodo non può essere correlato ad un titolo endpoint. Limitazioni del test 1. Il significato clinico degli anticorpi anti-β 2 GPI in malattie diverse da LES è tuttora in fase di valutazione. 2. Quando si ha in risultato negativo per anticorpi anti-β 2 GPI in presenza di sintomi clinici, si consiglia di eseguire test per anticoagulanti per il lupus, anti-cardiolipina o ulteriori test. 4

5 3. La diagnosi non può essere basata sul solo risultato del test per anticorpi anti-β 2 GPI. Questi risultati devono essere intrerpretati alla luce del quadro clinico del paziente. 4. Il trattamento non deve essere iniziato in base al solo risultato positivo del test per anticorpi anti-β 2 GPI. Devono essere presenti anche indicazioni cliniche. 5. Alcuni campioni possono essere positivi per anticorpi anti-cardiolipina ma negativi per anticorpi anti-β 2 GPI. Il test per anticorpi anti-β 2 GPI rappresenta un marker più specifico di rischio di trombosi. Il test per anticorpi anticardiolipina può dare risultati falsi positivi a causa di reazioni crociate con gli anticorpi anti-dsdna o con quelli di certe malattie infettive. 6. Le prestazioni caratteristiche del test non sono state valutate per campioni diversi dal siero. Valori attesi Campioni usati durante il Seminario - 7th International Symposium on Antiphospholipid Antibodies - New Orleans Come parte del 7th Antiphospholipid Meeting tenutosi dal 9 al 13 ottobre 1996, si è svolto un seminario pratico per stabilire le prestazioni di vari test, sperimentali e commerciali, per la ricerca di anticorpi anti-cardiolipina. Il kit QUANTA Lite β 2 GPI IgG ELISA è stato utilizzato per testare questi campioni. Il pannello comprendeva 10 campioni di pazienti con sindrome antifosfolipidica documentata (APS), 7 campioni di pazienti con malattie infettive quali sifilide e febbre Q, 2 campioni di pazienti con malattia reumatica autoimmune e 11 campioni normali. I campioni sono stati testati anche con un metodo tradizionale per la ricerca di anticorpi anti-cardiolipina. I risultati sono riassunti più avanti. Gruppo N. campioni N. +β 2 GPI N.+ Cardiolipina APS Infettivi Reumatici Normali Tutti i 10 pazienti con APS risultavano positivi sia con il test β 2 GPI sia con quello per gli anticorpi anti-cardiolipina. Per quanto riguarda gli altri tre gruppi di pazienti, tutti i campioni erano negativi con il test β 2 GPI tranne 1 paziente con malattia reumatica. Quattro pazienti con malattie infettive, entrambi quelli con malattia reumatica ed 1 degli 11 soggetti normali risultavano positivi con il test tradizionale per la ricerca di anticorpi anti-cardiolipina. Prestazioni caratteristiche specifiche Riassunto degli studi clinici Le prestazioni del test QUANTA Lite β 2 GPI IgG ELISA sono state valutate nel corso di 1 studio interno e di 4 studi clinici esterni. I risultati sono riassunti nella seguente tabella. Gruppo di pazienti N. N. Positivi (%) APS * secondaria a LES (97,2) APS primaria (93,3) LES 34 2 (5,8) Artrite reumatoide 17 0 (0) Poli-ipergammaglobulinemia 7 0 (0) Infettivi ** 81 0 (0) Normali (0,4) * APS = Sindrome antifosfolipidica ** La maggioranza di questi pazienti risultava positiva in test sierologici per la sifilide Sulla base dei risultati del precedente studio il test β 2 GPI presenta una sensibilità clinica pari al 96,2% ed una specificità clinica pari al 99,6%. Sensibilità e specificità relative Concordanza con il test anti-cardiolipina 40 sieri scelti a caso tra i campioni inviati ad un grande laboratorio di riferimento per la ricerca di anticorpi anticardiolipina sono stati testati per la presenza di IgG anti-cardiolipina ed anti-β 2 GPI. I risultati sono riassunti qui di seguito. β 2 GPI Sensibilità relativa 20,8% Cardiolipina Specificità relativa 100,0% Efficienza relativa 52,5% Cinque campioni risultavano positivi e 16 negativi con entrambi i metodi. Non è stato trovato nessun campione positivo per anticorpi anti-β 2 GPI e negativo per anticorpi anti-cardiolipina. Diciannove campioni risultavano positivi per anticorpi anti-cardiolipina e negativi per IgG anti-β 2 GPI. Nel corso di questo piccolo studio comparativo eseguito su campioni scelti a caso senza particolari storie cliniche, la sensibilità relativa dei risultati ottenuti con il test per le IgG anti-β 2 GPI sembra essere bassa quando paragonata a quella del test per le IgG anti-cardiolipina. Questo dato non è una sorpresa. I test tradizionali anti-cardiolipina individuano la presenza di anticorpi anti-β 2 GPI come pure quella di anticorpi che reagiscono con il solo fosfolipide. Come dimostrato dai dati del succitato Seminario di New Orleans ed anche nel Riassunto degli studi clinici, il test β 2 GPI mostra una sensibilità paragonabile ed una maggiore specificità rispetto ai risultati dei test di ricerca di anticorpi anti-cardiolipina nei pazienti con APS documentata. 5

6 Precisione e riproducibilità I dati relativi alla Precisione ed alla Riproducibilità sono stati calcolati testando un campione negativo, uno fortemente positivo ed uno moderatamente positivo sei volte nel corso di un test mattutino ed di uno pomeridiano per tre giorni consecutivi. Il rapporto medio del campione negativo era pari a 18,9, quello del campione moderatamente positivo era 44,3 e quello del campione fortemente positivo era 82,4. I risultati della valutazione intra-test ed inter-test sono riassunti qui di seguito. Negativo Moderatamente positivo Fortemente Positivo SD CV SD CV SD CV Generale 0,86 4,5% 2,48 5,6% 2,79 3,4% Intra-test 0,75 4,0% 2,34 5,3% 2,66 3,2% Inter-test 0,82 4,3% 2,41 5,4% 2,87 3,5% QUANTA Lite è un marchio registrato da INOVA Diagnostics, Inc. Bibliografía 1. Harris, E.N., A.E. Gharavi, M.L. Boey, B.M. Patel, C.G. Mackworth-Young, S. Loizou and G.R.V. Hughes. Anticardiolipin antibodies: detection by radioimmunoassay and association with thrombosis in systemic lupus erythematosus. Lancet, 2: , Koike, T., M. Sueishi, H. Funaki, H. Tomioka and S Yoshida. Antiphospholipid antibodies and biological false positive serological test for syphilis in patients with systemic lupus erythematosus. Clin Exp Immunol, 56: , Asherson, R.A. and E.N. Harris. Anticardiolipin antibodies: clinical associations. Postgrad Med J, 61: , Lockshin, M.D., M.L. Druzin, S. Goei, T. Qamar, M.S. Magid, L. Jovanovic and M. Ferenc. Antibody to cardiolipin as the predictor of fetal distress or death in pregnant patients with systemic lupus erythematosus. N Engl J Med, 313: , McNeil, H.P., C.N. Chesterman and S.A. Krilis. Immunology and clinical importance of antiphospholipid antibodies. Adv Immunol, 49: , Harris, E.N., A.E. Gharavi and G.R.V. Hughes. Anti-phospholipid antibodies. Clin Rheum Dis, 11: , Hughes, G.R.V., E.N. Harris and A.E. Gharavi. The anticardiolipin syndrome. J Rheumatol, 13: , McNeil, H.P., R.J. Simpson, C.N. Chesterman and S.A. Krilis. Anti-phospholipid antibodies are directed against a complex antigen that includes a lipid-binding inhibitor of coagulation: β 2 -glycoprotein I (apolipoprotein H). Proc Natl Acad Sci USA, 87: , Galli, M., P. Comfurius, C. Maassen, H.C. Hemker, M.H. De Baets, P.J.C. Van Breda-Vriesman, T. Barbui, R.F.A. Zwaal and E.M. Bevers. Anticardiolipin antibodies (ACA) directed not to cardiolipin but to a plasma protein cofactor. Lancet, 335: , Matsuura, E., Y. Igarashi, M. Fujimoto, K. Ichikawa and T. Koike. Anticardiolipin cofactor(s) and differential diagnosis of autoimmune disease. Lancet, 336: , Koike, T. and E. Matsuura. What is the "true" antigen for anticardiolipin antibodies? Lancet, 337: , Matsuura, E., Y. Igarashi, M. Fujimoto, K. Ichikawa, T. Suzuki, T. Sumida, T. Yasuda and T. Koike. Heterogeneity of anticardiolipin antibodies defined by the anticardiolipin cofactor. J Immunol, 148: , Matsuura, E., M. Igarashi, Y. Igarashi, H. Nagae, K. Ichikawa, T. Yasuda and T. Koike. Molecular definition of human β 2 -glycoprotein I (β 2 -GPI) by cdna cloning and inter-species differences of β 2 -GPI in alternation of anticardiolipin binding. Int Immunol, 3: , Igarashi, M., E. Matsuura, Y. Igarashi, H. Nagae, Y. Matsuura, K. Ichikawa, T. Yasuda, D.R. Voelker and T. Koike. Expression of anticardiolipin cofactor, human β 2 -glycoprotein I, by a recombinant baculovirus/insect cell system. Clin Exp Immunol, In press. 15. Schousboe, I. β 2 -glycoprotein I: a plasma inhibitor of the contact activation of the intrinsic blood coagulation pathway. Blood, 66: , Nimph, J., H. Wurm and G.M. Kostner. β 2 -glycoprotein I (apo-h) inhibits the release reaction of human platelets during ADP-induced aggregation. Atherosclerosis, 63: , Nimph, J., E.M. Bevers, P.H. Bomans, U. Till, H. Wurm, G.M. Kostner and R.F. Zwaal. Prothrombinase activity of human platelets is inhibited by β 2 -glycoprotein I. Biochim Biophys Acta, 884: , Viard, J.P., Z. Amoura and J.F. Bach. Association of anti-β 2 -glycoprotein I antibodies with lupus-type circulating anticoagulant and thrombosis in systemic lupus erythematosus. Am J Med, 93: , Keil, L.B., M. Galazka, H. El-Kadi, E. Erickson and V. DeBari. Binding of β 2 -glycoprotein I to activated polystyrene and its recognition by human IgG autoantibodies. Biotechnol Appl Biochem, 22: , Hisham, E., L. Keil and V. DeBari. Analytical and Clinical Relationships between human IgG autoantibodies to β 2 -glycoprotein I and anticardiolipin antibodies. J Rheumatol, 22: , Roubey, RA. Immunology of the Antiphospholipid Syndrome. Arthritis and Rheumatism, 39: , Tsutsumi A, et al. Antibodies to β 2 -Glycoprotein I and Clinical Manifestations in Patients with Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis and Rheumatism, 39: , Cabiedes, et al. Clinical manifestations of the antiphospholipid syndrome in systemic lupus erythematosus patients associate more strongly with anti β 2 glycoprotein I than with antiphosphlipid antibodies. J Rheumatol, 22: 1899,

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