QUANTA Lite CCP3 IgG ELISA Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata

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1 QUANTA Lite CCP3 IgG ELISA Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata Finalità d uso Il test QUANTA Lite CCP3 IgG ELISA è un saggio immunoassorbente semiquantitativo legato all enzima per il rilevamento degli pazienti anticorpi anti-ccp3 (3 peptide citrullinato ciclico) delle IgG in sieri o in citratato o plasma EDTA. La presenza di anticorpi anti-ccp3 IgG, può essere usata, insieme al quadro clinico del paziente ed al risultato degli altri test di laboratorio eseguiti, come aiuto nella diagnosi di artrite reumatoide. Riassunto e Spiegazione del test L artrite reumatoide (RA) è una delle malattie autoimmunitarie sistemiche più comuni che colpisce circa 0,5% della popolazione mondiale. 1 La diagnosi dipende primariamente dalle manifestazioni cliniche della malattia. Fino a recentemente, l unico esame sierologico utilizzato di routine era la determinazione della presenza del fattore reumatoide (RF) individuato in circa 50%-90% di questi pazienti. 1,2 Tuttavia, il RF viene anche individuato in soggetti con infezioni, altre malattie autoimmunitarie e in alcuni soggetti sani. 1,2 È importante per la gestione della malattia avere la possibilità di diagnosticare e trattare le persone affette da RA il più presto possibile. È noto da molti anni che gli autoanticorpi anti-perinucleari, chiamati anche autoanticorpi anticheratina, vengono rilevati nei soggetti affetti da RA. 4 Recentemente è stato scoperto che questi anticorpi riconoscono un epitopo che contiene la forma deamidata dell arginina denominata citrullina. 5,6 Un peptide circolare contenente citrullina denominato CCP (peptide citrullinato ciclico) si è dimostrato più efficace nella discriminazione dei pazienti RA da altri pazienti rispetto al test dell anticorpo perinucleare o ai test del fattore reumatoide. 4,7-9 In una revisione della letteratura pubblicata 6 il 77% dei pazienti con RA sono positivi per gli anti-ccp, mentre fra i soggetti non-ra la media è del 3%. Un test ELISA costruito con la sequenza CCP descritta originalmente 6 non è stato commercializzato diffusamente. Tuttavia il test anti-ccp di seconda generazione (chiamato CCP2 da alcune aziende) è ampiamente disponibile e dimostra prestazioni superiori rispetto al peptide originale. 10 INOVA denomina il test di seconda generazione CCP IgG ELISA. Gli anticorpi da alcuni pazienti RA che sono negativi per gli anti-ccp, sono reattivi con altre proteine citrullinate 4,7,8 suggerendo l esistenza di ulteriori epitopi non presenti nella sequenza dell antigene CCP di seconda generazione. Il peptide di terza generazione usato in questo ELISA, CCP3, è stato sviluppato testando un gran numero di pazienti RA e controlli su una varietà di peptidi citrullinati. Un ELISA costruito con CCP3 presenta una sensibilità superiore di 5% circa nel rilevamento dei pazienti RA rispetto ai CCP2 di seconda generazione mantenendo nel contempo una specificità molto elevata. Ulteriori miglioramenti nel test CCP3 ELISA includono pozzetti asportabili codificati con colore e la possibilità di utilizzare campioni paziente di siero o di plasma. Principio della Metodica L antigene utilizzato nel test QUANTA Lite CCP3 IgG ELISA è un peptide sintetico citrullinato ciclico che si è scoperto avere alta sensibilità e specificità nel rivelare anticorpi nei pazienti affetti da AR. Questo antigene è adsorbito sulla parete dei pozzetti della piastra. I controlli prediluiti ed i campioni paziente diluiti vengono aggiunti in pozzetti separati consentendo agli anticorpi IgG anti-ccp presenti di legarsi all antigene immobilizzante. L eccesso di campione non legato viene allontanato mediante il lavaggio e successivamente si aggiunge a ciascun pozzetto un anticorpo anti-igg umane marcato con un enzima. Una seconda incubazione consente agli anticorpi anti-igg umane marcati con l enzima di legarsi agli anticorpi del paziente che si sono eventualmente legati alla parete dei pozzetti. Dopo ulteriore lavaggio per allontanare l eccesso di anticorpi anti-igg umane marcati con l enzima, l attività dell enzima rimasto viene misurata aggiungendo un substrato cromogenico e misurando l intensità del colore che si sviluppa. Il test può essere letto mediante uno spettrofotometro ed interpretato confrontando l intensità del colore che si sviluppa nei pozzetti dei campioni con quella dei pozzetti dei controlli. Reagenti 1. Piastra microtiter ELISA in polistirene adsorbita con antigene CCP3 purificato (12-1 x 8 pozzetti), con supporto, in busta chiusa contenente materiale essicante 2. Controllo ELISA Negativo, 1 flacone di tampone contenente conservante e siero umano senza anticorpi IgG 3. Controllo ELISA debolmente positivo per CCP3 IgG, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi IgG 4. Controllo ELISA fortemente (Calibratore A) per CCP3 IgG, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi IgG 5. Calibratore B ELISA positivo per CCP IgG, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi IgG 6. Calibratore C ELISA positivo per CCP IgG, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi IgG 7. Calibratore D ELISA positivo per CCP IgG, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi IgG 8. Calibratore E ELISA positivo per CCP IgG, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi IgG 9. Diluente per campioni HRP, 1 flacone di colore rosa contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris, Tween 20, stabilizzatori delle proteine e conservante, 50mL 10. Soluzione di lavaggio HRP Concentrata, 1 flacone di soluzione concentrata 40x di colore rosso contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris e Tween 20, 25mL. Vedi la Sezione Metodi per le istruzioni sulla diluizione. 11. Coniugato HRP CCP3 IgG, (montone), anti-igg umane, 1 flacone di colore blu contenente tampone, stabilizzatori delle proteine e conservante, 10mL 12. Cromogeno TMB, 1 flacone contenente stabilizzatori, 10mL 13. Soluzione di arresto HRP, Acido solforico 0,344M, 1 flacone incolore, 10mL 1

2 Avvertenze 1. ATTENZIONE: Questo prodotto contiene un composto chimico (cloramfenicolo allo 0,02%) nel diluente per i campioni, nei controlli e nel coniugato, noto allo Stato della California come causa di tumori. 2. Tutte le fonti umane di materiali usati nella preparazione dei controlli per questo prodotto sono state testate e sono risultate negative per la presenza di anticorpi anti-hiv, per HBsAg e per anticorpi anti-hcv mediante metodi approvati dall FDA. Tuttavia nessun test offre la certezza completa dell assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i Controlli ELISA fortemente positivo CCP3 IgG, ELISA debolmente positivo CCP3 IgG (Calibratore A), CCP3 IgG Calibratori B - E ed ELISA Negativo devono essere maneggiati come materiali potenzialmente infettivi La sodio azide è usata come conservante. La sodio azide è un veleno e può essere tossica se ingerita o assorbita attraverso la cute o gli occhi. La sodio azide può reagire con le tubature di piombo o rame formando azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lasciar scorrere grandi quantità di acqua, se si usa un lavandino per eliminare i reagenti, per prevenire la formazione di azidi. 4. Il Coniugato HRP contiene un composto chimico velenoso/corrosivo, che può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. 5. Il Cromogeno TMB contiene un irritante, che può essere dannoso se inalato, ingerito o assorbito attraverso la cute. Per prevenire lesioni, evitare l inalazione, l ingestione o il contatto con la cute e con gli occhi. 6. La Soluzione di arresto HRP è costituita da una soluzione di acido solforico diluito. Evitare l esposizione a basi, metalli o altri composti che possono reagire con gli acidi. L acido solforico è velenoso e corrosivo e può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. 7. Usare appropriati indumenti personali protettivi mentre si lavora con i reagenti forniti. 8. I reagenti eventualmente rovesciati devono essere rimossi immediatamente. Seguire tutte le normative vigenti in materia di eliminazione dei residui di natura chimica. Precauzioni 1. Questo prodotto è stato messo a punto per l uso diagnostico In Vitro. 2. La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel kit può causare risultati non attendibili. 3. Un lavaggio incompleto o non accurato e l insufficiente aspirazione del liquido dai pozzetti ELISA può causare una scarsa precisione e/o un elevato background. 4. L adattamento di questo test all uso con apparecchiature automatiche e altri dispositivi per trattamento dei campioni liquidi, in toto o in parte, può causare differenze nei risultati rispetto a quelli ottenuti mediante la procedura manuale. E responsabilità di ciascun Laboratorio confermare che le procedure automatizzate utilizzate diano risultati entro limiti di accettabilità. 5. Una serie di fattori influenza le prestazioni del test. Essi comprendono l iniziale temperatura dei reagenti, la temperatura dell ambiente, l accuratezza e la riproducibilità della tecnica di pipettamento, la scrupolosità delle operazioni di lavaggio e di aspirazione del liquido dai pozzetti delle piastre ELISA, il tipo di spettrofotometro usato per leggere i risultati e la lunghezza dei tempi di incubazione durante l esecuzione del test. Bisogna prestare molta attenzione alla costanza per ottenere risultati accurati e riproducibili. 6. Si raccomanda di attenersi scrupolosamente alle istruzioni fornite. 7. Una chiusura incompleta della busta richiudibile contenente le strisce di pozzetti ed il materiale essicante causa la degradazione dell antigene ed una scarsa precisione nei risultati. 8. Valori di assorbanza inaccettabilmente bassi possono essere osservati dopo aver usato due o più volte lo stesso flacone di coniugato HRP per un certo periodo di tempo. E importante seguire attentamente le istruzioni fornite per il trattamento del coniugato HRP per evitare tale inconveniente. 9. Un eventuale contaminazione chimica del coniugato HRP può essere conseguenza di una impropria pulizia o risciacquo di apparecchi o di strumenti. Residui di comuni reagenti chimici di laboratorio quali formalina, candeggina, etanolo o detergenti causano la degradazione nel tempo del coniugato HRP. Risciacquare molto accuratamente tutti gli apparecchi e gli strumenti dopo l uso di detergenti chimici. Condizioni di conservazione 1. Conservare tutti i reagenti del kit a 2-8 C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza se conservati e trattati seguendo le istruzioni fornite. 2. Le strisce di pozzetti non utilizzate devono essere rimesse immediatamente nella busta richiudibile contenente il materiale essicante e conservate nella busta ben chiusa a 2-8 C. 3. Il tampone di lavaggio diluito è stabile per 1 settimana a 2-8 C. Raccolta dei campioni Questa procedura va effettuata con campioni di siero o di plasma citratato o di plasma EDTA poiché questi campioni producono risultati identici. Non si dovrebbe usare plasma con litio o eparina in quanto produce risultati diversi rispetto al siero. L aggiunta di azidi o altri conservanti ai campioni del test potrebbe influenzare negativamente i risultati. Campioni con segni di contaminazione microbica, trattati con calore o contenenti particelle visibili non dovrebbero essere usati. Si dovrebbe evitare anche l uso di sieri fortemente emolizzati o lipemici. Dopo il prelievo, il siero dovrebbe essere separato dal coagulo. Il Documento H18-A3 dell CLSI (precedentemente NCCLS) raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) Conservare i campioni a temperatura ambiente per non più di 8 ore. 2) Se il test non può essere eseguito entro 8 ore, conservare i campioni in frigorifero a 2-8 C. 3) Se il test non può essere eseguito entro 48 ore, oppure per la spedizione dei campioni, congelare a -20 C. I campioni congelati devono essere mescolati bene dopo lo scongelamento e prima di essere testati. Procedura Materiali forniti 1 Piastra microtiter ELISA CCP3 IgG (12-1 x 8 pozzetti), con supporto 1 1,2mL Controllo ELISA Negativo prediluito 1 1,2mL Controllo ELISA debolmente positivo CCP3 IgG prediluito 2

3 1 1,2mL Controllo ELISA fortemente positivo (Calibratore A) CCP3 IgG prediluito 1 1,2mL Calibratore B ELISA CCP3 IgG prediluito 1 1,2mL Calibratore C ELISA CCP3 IgG prediluito 1 1,2mL Calibratore D ELISA CCP3 IgG prediluito 1 1,2mL Calibratore E ELISA CCP3 IgG prediluito 1 50mL Diluente per campioni HRP 1 25mL Soluzione di lavaggio HRP concentrata, 40x concentrata 1 10mL Coniugato HRP CCP3 IgG, (montone), anti-igg umane 1 10mL Cromogeno TMB 1 10mL Soluzione di arresto HRP, 0,344M Acido solforico Materiali richiesti ma non forniti Micropipette in grado di erogare volume di 5, 100, e 500µL Puntali monouso per micropipette Provette per la diluizione dei sieri, volume 4mL Acqua distillata o deionizzata Beuta da 1L per diluite la Soluzione di lavaggio HRP concentrata Lettore per piastre ELISA in grado di leggere a 450nm (e 620nm per le letture a doppia lunghezza d onda) Metodica Prima di incominciare 1. Portare tutti i reagenti ed i campioni a temperatura ambiente (20-26 o C) e mescolarli bene. 2. Diluire la Soluzione di lavaggio HRP concentrata 1:40 aggiungendo il contenuto del flacone fornito con il kit a 975mL di acqua distillata o deionizzata. Se non si usa l intera piastra in una sola volta, si può preparare una minore quantità di soluzione di lavaggio aggiungendo 2,0mL di concentrato a 78mL di acqua distillata o deionizzata ogni 16 pozzetti utilizzati. La soluzione di lavaggio diluita è stabile per 1 settimana a 2-8 o C. 3. Preparare una diluizione 1:101 di ciascun campione da testare aggiungendo 5µL di siero a 500µL di Diluente per campioni HRP. I campioni diluiti devono essere testati entro 8 ore dalla preparazione. NON DILUIRE i Controllo ELISA debolmente positivo CCP3 IgG, Controllo ELISA fortemente positivo CCP3 IgG ed Controllo ELISA Negativo. 4. La determinazione della presenza o dell assenza di CCP3 IgG usando unità arbitrarie richiede due pozzetti per ciascuno dei tre controlli ed uno o due pozzetti per ciascun campione clinico. Si raccomanda di testare i campioni in duplicato. 5. Se si desidera, i risultati possono essere anche quantizzati utilizzando una curva standard a 5 punti. Per i punti da A ad E della curva standard a 5 punti utilizzare i calibratori PREDILUITI CCP3 IgG da A ad E direttamente dalla fiala. La curva standard a 5 punti ha i seguenti valori: Punto Unità A Calibratore A CCP3 IgG prediluito 250,0 B Calibratore B CCP3 IgG prediluito 125,0 C Calibratore C CCP3 IgG prediluito 62,5 D Calibratore D CCP3 IgG prediluito 31,25 E Calibratore E CCP3 IgG prediluito 15,62 Esecuzione del test 1. TUTTI I REAGENTI DEVONO ESSERE PORTATI A TEMPERATURA AMBIENTE (20-26 C) PRIMA DI INIZIARE IL TEST. Posizionare i pozzetti/le strisce necessarie nel supporto. Rimettere immediatamente la strisce inutilizzate nella busta contenente il materiale essicante e sigillarla bene per minimizzare l esposizione all umidità ambientale. 2. Distribuire 100µL dei Controlli ELISA debolmente positivo CCP3 IgG, ELISA fortemente positivo CCP3 IgG, dei Calibratori ELISA positivi per CCP3 IgG da B ad E (se si vuole), ed ELISA Negativo prediluiti e dei sieri diluiti nei rispettivi pozzetti. Coprire i pozzetti ed incubare per 30 minuti a temperatura ambiente su una superficie piana. Il tempo di incubazione inizia dopo l aggiunta dell ultimo campione. 3. Lavaggio: Aspirare completamente il contenuto di ciascun pozzetto. Distribuire µL di soluzione di lavaggio HRP diluita in tutti i pozzetti e quindi aspirarla. Ripetere questa operazione per altre due volte, per un totale di tre lavaggi. Dopo l ultimo lavaggio capovolgere la piastra e scuoterla fermamente su tovaglioli di carta assorbente per rimuovere eventuali residui di liquido. E importante vuotare completamente ciascun pozzetto dopo ciascun lavaggio. Per l aspirazione mantenere la stessa sequenza usata per l aggiunta dei campioni. 4. Distribuire 100μL di Coniugato HRP CCP3 IgG in ciascun pozzetto. Il coniugato dovrebbe essere prelevato dal flacone mediante tecniche sterili. Prelevare dal flacone solo la quantità di coniugato necessaria per l esecuzione del test. PER EVITARE POSSIBILI CONTAMINAZIONI MICROBICHE E/O CHIMICHE, NON RIMETTERE MAI IL CONIUGATO INUTILIZZATO NEL FLACONE. Incubare i pozzetti per 30 minuti come descritto al punto Lavaggio: Ripetere la procedura descritta al punto Distribuire 100µL di Cromogeno TMB in ciascun pozzetto ed incubare al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. 7. Distribuire 100µL di Soluzione di arresto HRP in ogni pozzetto. Per l aggiunta della Soluzione di arresto HRP mantenere la stessa sequenza e gli stessi tempi utilizzati per l aggiunta del Cromogeno TMB. Agitare gentilmente la piastra con le dita per mescolare completamente i reagenti nei pozzetti. 8. Leggere l assorbanza di ciascun pozzetto a 450nm entro 1 ora dall aggiunta della soluzione di arresto. Se si preferisce una lettura a doppia lunghezza d onda, si può usare la lunghezza d onda di 620nm come riferimento. 3

4 Controllo di qualità 1. I Controlli ELISA debolmente positivo CCP3 IgG, ELISA fortemente positivo CCP3 IgG ed ELISA Negativo devono essere inclusi ogni volta che si esegue il test per assicurare che tutti i reagenti ed il test funzionino in modo corretto. 2. Si deve notare che, poichè i Controlli ELISA debolmente positivo CCP3 IgG, ELISA fortemente positivo CCP3 IgG ed ELISA Negativo sono prediluiti, essi non rappresentano un controllo procedurale per le tecniche di diluizione utilizzate per i campioni. 3. Ulteriori controlli possono essere inclusi in base alle indicazioni o alle richieste delle vigenti regolamentazioni o delle organizzazioni di accreditamento. Ulteriori sieri di controllo possono essere preparati raccogliendo un pool dei sieri umani, aliquotandolo e conservandolo a < -20 C. 4. Perchè i risultati del test siano considerati validi, tutti i seguenti criteri devono essere soddisfatti. Se anche uno solo non rientra nei valori specificati, i risultati non dovrebbero essere considerati validi ed il test dovrebbe essere ripetuto. a. L assorbanza del Controllo ELISA fortemente positivo CCP3 IgG prediluito deve essere maggiore di quella del Controllo ELISA debolmente positivo CCP3 IgG prediluito che a sua volta deve essere maggiore di quella del Controllo ELISA Negativo prediluito. b. Il Controllo ELISA fortemente positivo CCP3 IgG prediluito deve avere un assorbanza maggiore di 1,0 mentre l assorbanza del Controllo ELISA Negativo prediluito non deve essere maggiore di 0,2. c. L assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo CCP3 IgG deve essere maggiore di due volte rispetto a quella del Controllo ELISA Negativo oppure >0,25. d. Il Controllo ELISA Negativo e quello ELISA fortemente positivo CCP3 IgG servono per controllare un eventuale malfunzionamento dei reagenti. Il Controllo ELISA fortemente positivo CCP3 IgG non assicura la precisione in corrispondenza del valore soglia del test. e. L utente del test dovrebbe fare riferimento al Documento C24-A3 dell CLSI (precedentemente NCCLS) per ulteriori informazioni su appropriate tecniche di Controllo di Qualità. Calcolo dei risultati semi-quantitativi Metodo del rapporto Si deve determinare innanzitutto il valore medio di assorbanza per ciascun set di duplicati. La reattività di ciascun campione viene quindi calcolata dividendo il valore medio di assorbanza del campione per il valore medio di assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo CCP3 IgG e moltiplicando il risultato per il numero di unità assegnate al Controllo ELISA debolmente positivo CCP3 IgG, che è stampato sull etichetta del flacone. Assorbanza campione Valore del campione = x Valore Controllo ELISA debolmente positivo CCP3 IgG (unità) (unità) Assorbanza Controllo ELISA debolmente positivo CCP3 IgG La reattività è collegata in modo non lineare alla quantità di anticorpi presente. Mentre gli aumenti e le diminuzioni delle concentrazioni degli anticorpi vengono evidenziate da un corrispondente aumento o diminuzione della reattività, il cambiamento non è proporzionale (ad es., un raddoppio della concentrazione di anticorpi non raddoppia necessariamente la reattività). Se si desidera una più accurata quantificazione del contenuto di anticorpi, si possono allestire e testare diluizioni seriate del campione. L ultima diluizione che risulta positiva nel test dovrebbe essere refertata come il titolo anticorpale del paziente. Metodo di calcolo opzionale: risultati semi-quantitativi utilizzando una curva standard Calcolo dei risultati utilizzando la curva standard opzionale 1. Calcolare un valore medio per i valori doppi. 2. Tracciare l assorbanza media dei campioni nella curva standard utilizzando i rispettivi valori in Unità. Utilizzare uno Spline cubico, lineare/lineare (polinomiale di terzo ordine) oppure una curva punto-a-punto per disegnare la curva. 3. Determinare la concentrazione sconosciuta di CCP3 in Unità dall asse Y leggendo l assorbanza corrispondente sull asse X. Calcolare le Unità sconosciute. 4. Nota: i valori calcolati utilizzando il metodo del rapporto saranno differenti rispetto a quelli calcolati con il metodo della curva standard. I valori elevati differiranno di più rispetto a quelli più bassi. Il CCP3 Fortemente Positivo non darà un valore di 250 Unità con il metodo del titolo. Interpretazione dei risultati Il metodo ELISA è molto sensibile alla procedura ed è in grado di individuare anche piccole differenze nella popolazione dei pazienti. I valori riportati qui di seguito sono solo valori suggeriti. Ciascun Laboratorio dovrebbe stabilire il proprio range di normalità basato sulla procedura da esso utilizzata, sui controlli, sull apparecchiatura e sulla popolazione di pazienti secondo le proprie metodiche standard. Il campione può essere quindi classificato come negativo, debolmente positivo, moderatamente o fortemente positivo in base alla seguente tabella. Unità Negativo <20 Debolmente Positivo Moderatamente Positivo Fortemente Positivo >60 1. Un risultato positivo indica la presenza di anticorpi diretti contro CCP3 IgG e suggerisce la possibilità di artrite reumatoide. 2. Un risultato negativo indica l assenza di anticorpi diretti contro CCP3 IgG anticorpi oppure la loro presenza a livelli inferiori al limite di sensibilità del metodo. 3. Sul referto si dovrebbe riportare la seguente frase: I seguenti risultati sono stati ottenuti mediante il test QUANTA Lite CCP3 IgG ELISA della INOVA. I valori CCP3 IgG ottenuti con test prodotti da altre Ditte possono non essere utilizzabili in modo intercambiabile. Il livello di IgG determinato con questo metodo non può essere correlato ad un titolo di punto finale. 4

5 Limitazioni del test 1. La presenza nel campione di complessi immuni o di altri aggregati di immunoglobuline può causare un aumento del livello di reazioni a specifiche con conseguenti risultati falsi positivi con questo test. 2. Non tutti i pazienti affetti da AR risultano positivi agli anticorpi CCP. 3. I risultati di questo test devono essere valutati dal medico curante alla luce del quadro clinico del paziente e del risultato degli altri test sierologici. 4. Le prestazioni caratteristiche del test non sono state valutate per campioni diversi dal siero o di plasma citratato o di plasma EDTA. 5. Il valore diagnostico degli anticorpi anti-ccp3 in pazienti affetti da artrite reumatoide giovanile non è stato determinato. 6. Sostanze interferenti: alti livelli di emoglobina, bilirubina, colesterolo o trigliceridi non causano risultati falso negativi o falso positivi. Valori attesi da campioni clinici La capacità di QUANTA Lite CCP3 IgG ELISA di rilevare anticorpi IgG CCP3 è stata valutata confrontando 521 campioni con un test ELISA che misura gli anti-ccp2 IgG. Erano inclusi 156 pazienti con diagnosi clinica di RA. Sono stati inoltre analizzati i sieri di 166 donatori di sangue selezionati aleatoriamente. Dei 146 di cui erano disponibili i dati dell età e del sesso, 59 erano femmine e l età media era 38,3. I controlli di malattia comprendevano113 soggetti con altre patologie reumatiche (ORD) quali lupus eritematoso sistemico (78), sindrome di Sjögren s (11) e scleroderma (24), oltre a 86 campioni aggiuntivi con anticorpi di malattie infettive (ID) quali epatite C (62), herpes simplex virus (8), citomegalovirus (8), toxoplasmosi (6) e rosolia (2) in un grande studio interno. Sensibilità e specificità clinica La seguente tabella riassume i risultati di tutti i nostri studi clinici. Championi N=521 CCP 3 ELISA CCP IgG ELISA RA (N=156) Controlli totali (N=365) Donatori di sangue (N=166) Altre malattie reumatiche (N=113) Malattia infettiva (N=86) Sensibilità Clinica [(95% Intervallo di confidenza (CI)] = CCP3 = 74% (67-81%) CCP = 69% (61-76%) Specificità Clinica (95% CI) = CCP3 = 96% (93-98%) CCP = 98% (96-99%) Confronto tra i metodi Tutti i Championi N=521 CCP IgG ELISA + - CCP * ELISA - 2** 388 Sensibilità Relative (95% CI) = 98% (94-100%) Specificità Relative (95% CI) = 95% (93-97%) Accordo =96,0% *10 di questi pazienti sono diagnosticati RA mentre 3 degli altri sono positivi per RF IgM e/o IgA ** Questi due campioni sono diagnosticati come pazienti RA. Reazioni crociate Per valutare la potenziale reattività crociata dell antigene CCP3 con altri autoanticorpi, QUANTA Lite CCP3 ELISA è stato valutato con 16 campioni, tutti con elevati livelli di diversi altri autoanticorpi. In questo gruppo erano inclusi 2 campioni, ed entrambi avevano reagito con SS-A, SS-B, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, Ribo-P e dsdna. Tutti i campioni risultavano negativi per anti-ccp3. Lo studio precedente non evidenza alcuna reattività crociata significativa dell'antigene CCP3 con una varietà di altri autoanticorpi. 5

6 Precisione e riproducibilità La variazione dei test fra le sedute è stata misurata analizzando dei canottiera di campioni negativi, debolmente positivi e fortemente positivi in 6 saggi separati in 4 giorni diversi. La variazione dei test nelle sedute è stata misurata analizzando 9 campioni 8 o 9 volte ciascuno sulla stessa piastra ELISA. I risultati rappresentativi vengono presentati nella seguente tabella. Variazione inter-analisi Negativo 1 Debolmente 1 Debolmente 2 Fortemente 1 1 pt.* 5 pt.** 1 pt. 5 pt. 1 pt. 5 pt. 1 pt. 5 pt. Unità medie 5 U 0 U 28 U 31 U 35 U 42 U 110 U 226 U Deviazione standard 0,2 0,0 1,6 2,4 1,1 1,8 4,4 9,2 Coefficiente di variazione % 4% 0% 6% 8% 3% 4% 4% 4% Variazione intra-analisi Negativo 1 Debolmente 1 Debolmente 2 Fortemente 1 1 pt.5 pt. 1 pt. 5 pt. 1 pt. 5 pt. 1 pt. 5 pt. Unità medie 5 U 0 U 26 U 28 U 32 U 37 U 114 U 226 U Deviazione standard 0,1 0,0 0,6 0,9 1,6 2,6 1,7 6,4 Coefficiente di variazione % 3% 0% 3% 3% 5% 7% 1% 3% * Risultati del test del metodo del rapporto **Risultati del test della curva standard QUANTA Lite è un marchio registrato da INOVA Diagnostics, Inc. 6

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