QUANTA Lite TM Actin IgG ELISA Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata

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1 QUANTA Lite TM Actin IgG ELISA Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata Finalità d uso QUANTA Lite TM Actin IgG è un test immunoenzimatico per la ricerca semi-quantitativa di anticorpi IgG nell actina del muscolo liscio contenuti nel siero umano. La presenza di anticorpi anti-actin può essere usata, insieme al quadro clinico del paziente ed al risultato degli altri test di laboratorio eseguiti, come aiuto nella diagnosi di patologie epatiche autoimmuni come ad esempio l epatite autoimmune (EAI) e la cirrosi biliare primaria (Primary Biliary Cirrhosis, PBC). Riassunto e Spiegazione del test Gli autoanticorpi anti-actina sono la componente principale degli anticorpi denominati anticorpi anti-muscolo liscio (Smooth Muscle Antibodies, ASMA). Questi anticorpi mostrano specificità nei riguardi dell actina del citoscheletro 1,2 e sono tradizionalmente rivelati tramite l immunofluorescenza indiretta utilizzando come substrato sezioni sottili di fegato, rene o stomaco di roditore. 2,3 Gli anticorpi anti-actina sono riscontrati nel 52-85% dei pazienti affetti da epatite autoimmune (EAI) o da epatite cronica attiva (CAH) e nel 22% dei pazienti affetti da cirrosi biliare primaria (PBC). 3,4,5 In genere si sono riscontrati titoli bassi di anticorpi anti-actina,nel 3-18% dei campioni di siero prelevati dalla popolazione generale sana. 6 Le procedure di immunofluorescenza utilizzate per rilevare gli anticorpi anti-actina o anti-muscolo liscio sono soggettive, ed il risultato dell analisi dipende dal tipo di tessuto utilizzato, dalla specificità del coniugato, dalla potenza del microscopio utilizzato per leggere i risultati ed anche dall esperienza dell esaminatore. I più recenti metodi ELISA introdotti fra la seconda metà degli anni 80 e l inizio degli anni 90 4,5,7,8 presentano il potenziale per rendimenti superiori, più standardizzati ed automatizzabili. È stato riportato che la specificità anti-muscolo liscio per l actina si riscontra principalmente in pazienti affetti da epatite cronica attiva (CAH); mentre nelle infezioni virali come ad esempio la mononucleosi, l epatite virale, il morbillo e la parotite la reattività anti-muscolo liscio è dovuta alla reattività verso antigeni citoplasmatici non-actinici. 1,2,3,9,10 Gli anticorpi anti-muscolo liscio e gli anticorpi antinucleo sono le indicazioni immunosierologiche tipiche dell epatite autoimmune di tipo Gli anticorpi anti-muscolo liscio sono diretti verso varie componenti; la più importante delle quali è l actina, ma l immunofluorescenza può rivelare anche anticorpi diretti verso la tubulina o il filamento intermedio. 12 In seguito a studi recenti si è visto che gli anticorpi anti-actina sono specifici per la malattia epatica autoimmune. Essi sono stati indicati come marker migliori per l epatite autoimmune rispetto agli anticorpi anti-muscolo liscio. 12,13,14 Infatti qualche volta è stato utilizzato il nome Epatite anti-actina per descrivere questa malattia. 15 Czaja et al. 14 hanno mostrato che gli anticorpi anti-actina erano presenti in 73 dei 99 (74%) pazienti affetti da epatite autoimmune di tipo 1, in 0 degli 83 donatori di sangue sani e nel 3-15% dei pazienti affetti da altri tipi di epatiti croniche. Da questo stesso studio si è determinato che quasi tutti (99%) i pazienti actina-positivi erano anche positivi agli anticorpi anti-muscolo liscio mentre il 46% del gruppo actina-negativo aveva reattività diretta verso il muscolo liscio. I pazienti con reattività anti-actina tendono maggiormente a non rispondere alla terapia con corticosteroidi (16% rispetto a 4%) ed erano più soggetti a soffrire di insufficienza epatica (20% rispetto a 4%). 14 Principio della Metodica L antigene purificato F-actin è adsorbito sulla parete dei pozzetti di una piastra microtiter di polistirene in condizioni adatte a conservare l antigene nel suo stato nativo. I controlli pre-diluiti ed i sieri diluiti dei pazienti vengono distribuiti nei pozzetti corrispondenti, consentendo agli anticorpi anti-actin eventualmente presenti di legarsi all antigene adsorbito. L eccesso di campione non legato viene allontanato mediante il lavaggio e successivamente si aggiunge a ciascun pozzetto un anticorpo anti-igg umane marcato con un enzima. Una seconda incubazione consente agli anticorpi anti-igg umane marcati con l enzima di legarsi agli anticorpi del paziente che si sono eventualmente legati alla parete dei pozzetti. Dopo ulteriore lavaggio per allontanare l eccesso di anticorpi anti-igg umane marcati con l enzima, l attività dell enzima rimasto viene misurata aggiungendo un substrato cromogenico e misurando l intensità del colore che si sviluppa. Il test può essere letto mediante uno spettrofotometro ed interpretato confrontando l intensità del colore che si sviluppa nei pozzetti dei campioni con quella dei pozzetti dei controlli. Reagenti 1. Piastra microtiter ELISA in polistirene adsorbita con antigene Actin purificato (12-1 x 8 pozzetti), con supporto, in busta chiusa contenente materiale essicante 2. Controllo ELISA Negativo, 1 flacone di tampone contenente conservante e siero umano senza IgG anticorpi umani anti-actin, prediluito, 1,2mL 3. Controllo ELISA fortemente positivo per Actin IgG, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi umani IgG anti-actin, prediluito, 1,2mL 4. Controllo ELISA debolmente positivo per Actin IgG, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi umani IgG anti-actin, prediluito, 1,2mL 5. Diluente per campioni HRP, 1 flacone di colore rosa contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris, Tween 20, stabilizzatori delle proteine e conservante, 50mL 6. Soluzione di lavaggio HRP Concentrata, 1 flacone di soluzione concentrata 40x di colore rosso contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris e Tween 20, 25mL. Vedi la Sezione Metodi per le istruzioni sulla diluizione. 1

2 7. Coniugato HRP IgG, (montone), anti-igg umane, 1 flacone di colore blu contenente tampone, stabilizzatori delle proteine e conservante, 10mL 8. Cromogeno TMB, 1 flacone contenente stabilizzatori, 10mL 9. Soluzione di arresto HRP, Acido solforico 0,344M, 1 flacone incolore, 10mL Avvertenze 1. ATTENZIONE: Questo prodotto contiene un composto chimico (cloramfenicolo allo 0,02%) nel diluente per i campioni, nei controlli e nel coniugato, noto allo Stato della California come causa di tumori. 2. Tutte le fonti umane di materiali usati nella preparazione dei controlli per questo prodotto sono state testate e sono risultate negative per la presenza di anticorpi anti-hiv, per HBsAg e per anticorpi anti- HCV mediante metodi approvati dall FDA. Tuttavia nessun test offre la certezza completa dell assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i Controlli ELISA fortemente positivo Actin, ELISA debolmente positivo Actin ed ELISA Negativo devono essere maneggiati come materiali potenzialmente infettivi La sodio azide è usata come conservante. La sodio azide è un veleno e può essere tossica se ingerita o assorbita attraverso la cute o gli occhi. La sodio azide può reagire con le tubature di piombo o rame formando azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lasciar scorrere grandi quantità di acqua, se si usa un lavandino per eliminare i reagenti, per prevenire la formazione di azidi. 4. Il Coniugato HRP contiene un composto chimico velenoso/corrosivo, che può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. 5. Il Cromogeno TMB contiene un irritante, che può essere dannoso se inalato, ingerito o assorbito attraverso la cute. Per prevenire lesioni, evitare l inalazione, l ingestione o il contatto con la cute e con gli occhi. 6. La Soluzione di arresto HRP è costituita da una soluzione di acido solforico diluito. Evitare l esposizione a basi, metalli o altri composti che possono reagire con gli acidi. L acido solforico è velenoso e corrosivo e può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. 7. Usare appropriati indumenti personali protettivi mentre si lavora con i reagenti forniti. 8. I reagenti eventualmente rovesciati devono essere rimossi immediatamente. Seguire tutte le normative vigenti in materia di eliminazione dei residui di natura chimica. Precauzioni 1. Questo prodotto è stato messo a punto per l uso diagnostico In Vitro. 2. La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel kit può causare risultati non attendibili. 3. Un lavaggio incompleto o non accurato e l insufficiente aspirazione del liquido dai pozzetti ELISA può causare una scarsa precisione e/o un elevato background. 4. L adattamento di questo test all uso con apparecchiature automatiche e altri dispositivi per trattamento dei campioni liquidi, in toto o in parte, può causare differenze nei risultati rispetto a quelli ottenuti mediante la procedura manuale. E responsabilità di ciascun Laboratorio confermare che le procedure automatizzate utilizzate diano risultati entro limiti di accettabilità. 5. Una serie di fattori influenza le prestazioni del test. Essi comprendono l iniziale temperatura dei reagenti, la temperatura dell ambiente, l accuratezza e la riproducibilità della tecnica di pipettamento, la scrupolosità delle operazioni di lavaggio e di aspirazione del liquido dai pozzetti delle piastre ELISA, il tipo di spettrofotometro usato per leggere i risultati e la lunghezza dei tempi di incubazione durante l esecuzione del test. Bisogna prestare molta attenzione alla costanza per ottenere risultati accurati e riproducibili. 6. Si raccomanda di attenersi scrupolosamente alle istruzioni fornite. 7. Una chiusura incompleta della busta richiudibile contenente le strisce di pozzetti ed il materiale essicante causa la degradazione dell antigene ed una scarsa precisione nei risultati. 8. Valori di assorbanza inaccettabilmente bassi possono essere osservati dopo aver usato due o più volte lo stesso flacone di coniugato HRP per un certo periodo di tempo. E importante seguire attentamente le istruzioni fornite per il trattamento del coniugato HRP per evitare tale inconveniente. 9. Un eventuale contaminazione chimica del coniugato HRP può essere conseguenza di una impropria pulizia o risciacquo di apparecchi o di strumenti. Residui di comuni reagenti chimici di laboratorio quali formalina, candeggina, etanolo o detergenti causano la degradazione nel tempo del coniugato HRP. Risciacquare molto accuratamente tutti gli apparecchi e gli strumenti dopo l uso di detergenti chimici. Condizioni di conservazione 1. Conservare tutti i reagenti del kit a 2-8 C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza se conservati e trattati seguendo le istruzioni fornite. 2. Le strisce di pozzetti non utilizzate devono essere rimesse immediatamente nella busta richiudibile contenente il materiale essicante e conservate nella busta ben chiusa a 2-8 C. 3. Il tampone di lavaggio diluito è stabile per 1 settimana a 2-8 C. Raccolta dei campioni Questa tecnica deve essere usata con un campione di siero. L aggiunta al campione di sodio azide o di altri conservanti può influenzare in modo negativo i risultati. Campioni con segni di contaminazione microbica, trattati con calore o contenenti particelle visibili non dovrebbero essere usati. Si dovrebbe evitare anche l uso di sieri fortemente emolizzati o lipemici. 2

3 Dopo il prelievo, il siero dovrebbe essere separato dal coagulo. Il Documento H18-A2 dell NCCLS raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) Conservare i campioni a temperatura ambiente per non più di 8 ore. 2) Se il test non può essere eseguito entro 8 ore, conservare i campioni in frigorifero a 2-8 C. 3) Se il test non può essere eseguito entro 48 ore, oppure per la spedizione dei campioni, congelare a -20 C. I campioni congelati devono essere mescolati bene dopo lo scongelamento e prima di essere testati. Procedura Materiali forniti 1 Piastra microtiter ELISA Actin IgG (12-1 x 8 pozzetti), con supporto 1 1,2mL Controllo ELISA Negativo prediluito 1 1,2mL Controllo ELISA debolmente positivo Actin IgG prediluito 1 1,2mL Controllo ELISA fortemente positivo Actin IgG prediluito 1 50mL Diluente per campioni HRP 1 25mL Soluzione di lavaggio HRP concentrata, 40x concentrata 1 10mL Coniugato HRP IgG, (montone), anti-igg umane 1 10mL Cromogeno TMB 1 10mL Soluzione di arresto HRP, 0,344M Acido solforico Materiali richiesti ma non forniti Micropipette in grado di erogare volume di 5, 100, e 500µL Puntali monouso per micropipette Provette per la diluizione dei sieri, volume 4mL Acqua distillata o deionizzata Beuta da 1L per diluite la Soluzione di lavaggio HRP concentrata Lettore per piastre ELISA in grado di leggere a 450nm (e 620nm per le letture a doppia lunghezza d onda) Metodica Prima di incominciare 1. Portare tutti i reagenti ed i campioni a temperatura ambiente (20-26 o C) e mescolarli bene. 2. Diluire la Soluzione di lavaggio HRP concentrata 1:40 aggiungendo il contenuto del flacone fornito con il kit a 975mL di acqua distillata o deionizzata. Se non si usa l intera piastra in una sola volta, si può preparare una minore quantità di soluzione di lavaggio aggiungendo 2,0mL di concentrato a 78mL di acqua distillata o deionizzata ogni 16 pozzetti utilizzati. La soluzione di lavaggio diluita è stabile per 1 settimana a 2-8 o C. 3. Preparare una diluizione 1:101 di ciascun campione da testare aggiungendo 5µL di siero a 500µL di Diluente per campioni HRP. I campioni diluiti devono essere testati entro 8 ore dalla preparazione. NON DILUIRE i Controllo ELISA debolmente positivo Actin IgG, Controllo ELISA fortemente positivo Actin IgG ed Controllo ELISA Negativo. 4. La determinazione della presenza o dell assenza di Actin usando unità arbitrarie richiede due pozzetti per ciascuno dei tre controlli ed uno o due pozzetti per ciascun campione clinico. Si raccomanda di testare i campioni in duplicato. Esecuzione del test 1. TUTTI I REAGENTI DEVONO ESSERE PORTATI A TEMPERATURA AMBIENTE (20-26 C) PRIMA DI INIZIARE IL TEST. Posizionare i pozzetti/le strisce necessarie nel supporto. Rimettere immediatamente la strisce inutilizzate nella busta contenente il materiale essicante e sigillarla bene per minimizzare l esposizione all umidità ambientale. 2. Distribuire 100µL dei Controlli ELISA debolmente positivo Actin IgG, ELISA fortemente positivo Actin IgG ed ELISA Negativo prediluiti e dei sieri diluiti nei rispettivi pozzetti. Coprire i pozzetti ed incubare per 30 minuti a temperatura ambiente su una superficie piana. Il tempo di incubazione inizia dopo l aggiunta dell ultimo campione. 3. Lavaggio: Aspirare completamente il contenuto di ciascun pozzetto. Distribuire µL di soluzione di lavaggio HRP diluita in tutti i pozzetti e quindi aspirarla. Ripetere questa operazione per altre due volte, per un totale di tre lavaggi. Dopo l ultimo lavaggio capovolgere la piastra e scuoterla fermamente su tovaglioli di carta assorbente per rimuovere eventuali residui di liquido. E importante vuotare completamente ciascun pozzetto dopo ciascun lavaggio. Per l aspirazione mantenere la stessa sequenza usata per l aggiunta dei campioni. 4. Distribuire 100μL di Coniugato HRP IgG in ciascun pozzetto. Il coniugato dovrebbe essere prelevato dal flacone mediante tecniche sterili. Prelevare dal flacone solo la quantità di coniugato necessaria per l esecuzione del test. PER EVITARE POSSIBILI CONTAMINAZIONI MICROBICHE E/O CHIMICHE, NON RIMETTERE MAI IL CONIUGATO INUTILIZZATO NEL FLACONE. Incubare i pozzetti per 30 minuti come descritto al punto Lavaggio: Ripetere la procedura descritta al punto Distribuire 100µL di Cromogeno TMB in ciascun pozzetto ed incubare al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. 7. Distribuire 100µL di Soluzione di arresto HRP in ogni pozzetto. Per l aggiunta della Soluzione di arresto HRP mantenere la stessa sequenza e gli stessi tempi utilizzati per l aggiunta del Cromogeno TMB. Agitare gentilmente la piastra con le dita per mescolare completamente i reagenti nei pozzetti. 3

4 8. Leggere l assorbanza (OD) di ciascun pozzetto a 450nm entro 1 ora dall aggiunta della soluzione di arresto. Se si preferisce una lettura a doppia lunghezza d onda, si può usare la lunghezza d onda di 620nm come riferimento. Controllo di qualità 1. I Controlli ELISA debolmente positivo Actin IgG, ELISA fortemente positivo Actin IgG ed ELISA Negativo devono essere inclusi ogni volta che si esegue il test per assicurare che tutti i reagenti ed il test funzionino in modo corretto. 2. Si deve notare che, poichè i Controlli ELISA debolmente positivo Actin IgG, ELISA fortemente positivo Actin IgG ed ELISA Negativo sono prediluiti, essi non rappresentano un controllo procedurale per le tecniche di diluizione utilizzate per i campioni. 3. Ulteriori controlli possono essere inclusi in base alle indicazioni o alle richieste delle vigenti regolamentazioni o delle organizzazioni di accreditamento. Ulteriori sieri di controllo possono essere preparati raccogliendo un pool dei sieri umani, aliquotandolo e conservandolo a < -20 C. 4. Perchè i risultati del test siano considerati validi, tutti i seguenti criteri devono essere soddisfatti. Se anche uno solo non rientra nei valori specificati, i risultati non dovrebbero essere considerati validi ed il test dovrebbe essere ripetuto. a. L assorbanza del Controllo ELISA fortemente positivo Actin IgG prediluito deve essere maggiore di quella del Controllo ELISA debolmente positivo Actin IgG prediluito che a sua volta deve essere maggiore di quella del Controllo ELISA Negativo prediluito. b. Il Controllo ELISA fortemente positivo Actin IgG prediluito deve avere un assorbanza maggiore di 1,0 mentre l assorbanza del Controllo ELISA Negativo prediluito non deve essere maggiore di 0,2. c. L assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo Actin IgG deve essere maggiore di due volte rispetto a quella del Controllo ELISA Negativo oppure >0,25. d. Il Controllo ELISA Negativo e quello ELISA fortemente positivo Actin IgG servono per controllare un eventuale malfunzionamento dei reagenti. Il Controllo ELISA fortemente positivo Actin IgG non assicura la precisione in corrispondenza del valore soglia del test. e. L utente del test dovrebbe fare riferimento al Documento C24-A dell NCCLS per ulteriori informazioni su appropriate tecniche di Controllo di Qualità. Calcolo dei risultati Si deve determinare innanzitutto il valore medio di assorbanza per ciascun set di duplicati. La reattività di ciascun campione viene quindi calcolata dividendo il valore medio di assorbanza del campione per il valore medio di assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo Actin IgG e moltiplicando il risultato per il numero di unità assegnate al Controllo ELISA debolmente positivo Actin IgG, che è stampato sull etichetta del flacone. Assorbanza campione Valore del campione = (unità) Assorbanza Controllo ELISA debolmente positivo Actin IgG x Valore Controllo ELISA debolmente positivo Actin IgG (unità) La reattività è collegata in modo non lineare alla quantità di anticorpi presente. Mentre gli aumenti e le diminuzioni delle concentrazioni degli anticorpi vengono evidenziate da un corrispondente aumento o diminuzione della reattività, il cambiamento non è proporzionale (ad es., un raddoppio della concentrazione di anticorpi non raddoppia necessariamente la reattività). Se si desidera una più accurata quantificazione del contenuto di anticorpi, si possono allestire e testare diluizioni seriate del campione. L ultima diluizione che risulta positiva nel test dovrebbe essere refertata come il titolo anticorpale del paziente. Interpretazione dei risultati Il metodo ELISA è molto sensibile alla procedura ed è in grado di individuare anche piccole differenze nella popolazione dei pazienti. I valori riportati qui di seguito sono solo valori suggeriti. Ciascun Laboratorio dovrebbe stabilire il proprio range di normalità basato sulla procedura da esso utilizzata, sui controlli, sull apparecchiatura e sulla popolazione di pazienti secondo le proprie metodiche standard. Il campione può essere quindi classificato come negativo, debolmente positivo o moderatamente o fortemente positivo in base alla seguente tabella. Unità Negativo <20 Debolmente Positivo Moderatamente o Fortemente Positivo >30 1. Un risultato positivo indica la presenza di anticorpi diretti contro Actin e suggerisce la possibilità della malattia patologie epatiche autoimmuni come ad esempio l epatite autoimmune (EAI) o da epatite cronica attiva (CAH). 2. Un risultato negativo indica l assenza di anticorpi diretti contro Actin anticorpi oppure la loro presenza a livelli inferiori al limite di sensibilità del metodo. 3. Sul referto si dovrebbe riportare la seguente frase: I seguenti risultati sono stati ottenuti mediante il test QUANTA Lite TM Actin IgG ELISA della INOVA. I valori Actin ottenuti con test prodotti da altre Ditte possono non essere utilizzabili in modo intercambiabile. Il livello di IgG determinato con questo metodo non può essere correlato ad un titolo endpoint. 4

5 Limitazioni del test 1. La presenza nel campione di complessi immuni o di altri aggregati di immunoglobuline può causare un aumento del livello di reazioni a specifiche con conseguenti risultati falsi positivi con questo test. 2. Non tutti i pazienti affetti da epatite cronica attiva o da cirrosi biliare primaria sono positivi agli anticorpi anti-actina. 3. Non tutti i campioni positivi al muscolo liscio contengono anticorpi anti-actina. 4. I risultati di questo test devono essere valutati dal medico curante alla luce del quadro clinico del paziente e del risultato degli altri test sierologici. 5. Le prestazioni caratteristiche del test non sono state valutate per campioni diversi dal siero. 6. Al momento attuale, l'effetto della terapia sui livelli di autoanticorpi anti actina sono sconosciuti. Valori attesi La capacità del QUANTA Lite TM Actin IgG ELISA di rilevamento degli anticorpi anti-actina è stata valutata tramite comparazione con un test di immunofluorescenza reperibile in commercio ed anche valutando campioni di pazienti clinicamente definiti. I risultati del test di immunofluorescenza sono stati determinati seguendo le istruzioni fornite nel foglietto illustrativo accluso dal produttore. Range normale Lo studio del range normale è stato eseguito nel laboratorio di ricerca presso la INOVA Diagnostics, Inc. Centocinquanta campioni di siero normale sono stati selezionati in maniera casuale e testati con il QUANTA Lite Actin IgG ELISA. La popolazione consisteva in 89 soggetti maschili di età compresa tra i 18 ed i 70 anni (media 31 anni) e 61 soggetti femminili di età compresa fra i 17 e i 74 anni (media 36 anni). Solo 3 di questi 150 campioni sono risultati positivi. Due campioni avevano positività moderata e forte con 75 e 31 unità mentre l altro era solo debolmente positivo con 21 unità. La soglia di positività per questa analisi è di 20 unità. Il valore medio per questi 150 campioni normali era di 7,3 unità. I 3 campioni normali risultati positivi sono stati testati con il kit all immunofluorescenza NOVA Lite ANA Plus Mouse Kidney & Stomach. I campioni risultati fortemente positivi (75 e 31 unità) hanno reagito con il tipico pattern degli anti-muscolo liscio actina positivi. Questi campioni hanno prodotto fluorescenza intensa con il muscolo liscio dei vasi sanguigni del rene, della muscolare dello stomaco e con le proteine contrattili presenti fra le cellule parietali gastriche. Il campione debolmente positivo (21 unità) ha prodotto una colorazione del muscolo liscio atipica, più simile a quella della reticolina. La Concordanza relativa tra ELISA e Immunofluorescenza Per determinare la sensibilità e la specificità relative dello studio, sono stati analizzati 83 campioni della tabella precedente sottoposti a test per anticorpi contro il muscolo liscio più altri 150 campioni normali utilizzando sia il QUANTA Lite Actin IgG ELISA che un altra metodologia IFA esistente in commercio. Dei 233 campioni, 65 sono risultati positivi e 136 negativi con entrambi i metodi. Trentadue campioni sono risultati positivi con il metodo IFA ma non con l ELISA. Di questi 32 campioni risultati positivi con l IFA ma negativi con l ELISA, 11 appartenevano al gruppo normale e 17 dei rimanenti 21 campioni sono risultati positivi all IFA ma solo ad una diluizione di 1:40. QUANTA Lite Actin IgG ELISA Concordanza positivi 67,0% Metodo IFA Concordanza negativo 100% Concordanza Totale 86,3% Sensibilità e specificità clinica Si riporta qui di seguito un elenco di dati clinici derivati da studi condotti nei laboratori INOVA e da uno studio esterno. Gruppo di pazienti Numero Numero di positivi % positivi Epatite autoimmune (EAI) ,4 Epatite criptogenetica ,0 Colangite autoimmune ,5 Cirrosi biliare primaria (PBC) ,0 Coesistenza di EAI/PBC ,8 Coesistenza di EAI/PSC ,0 Epatite indotta da droghe ,0 Epatite autoimmune di tipo ,0 Epatite virale 3 0 0,0 Cirrosi 1 0 0,0 Colangite sclerosante primaria (Primary Sclerosing Cholangitis, PSC) 1 0 0,0 Controlli positivi agli autoanticorpi ,0 Normali ,8 La sensibilità per l EAI potrebbe essere più elevata di quanto indicato se si tiene conto del fatto che molti di questi pazienti erano sottoposti a terapia immunosoppressiva al momento del prelievo del campione. Inoltre in molti pazienti sono stati eseguiti prelievi multipli. La sieropositività per la tabella in alto è stata definita come positività al primo prelievo. Altri 7 pazienti affetti da EAI, 1 da EAI/PBC ed 1 da EAI/PSC sono diventati positivi ai prelievi successivi dando sensibilità del 75,7% per il gruppo EAI. 5

6 Reazioni crociate Per determinare potenziali reazioni crociate di altri autoanticorpi con il QUANTA Lite Actin IgG ELISA sono stati esaminati in totale 68 sieri diversi. Ognuno conteneva livelli elevati di vari autoanticorpi comunemente testati. Sei dei 68 campioni contenuti in questo gruppo provenivano da pazienti affetti da LES, e contenevano livelli elevati di ANA e di DNA a doppia elica, 2 sieri contenevano il fattore reumatoide, 6 sieri erano positivi per la transglutaminasi endomisiale/tissutale e 7 sieri erano positivi per la perossidasi tiroidea (Thyroid Peroxidase, TPO). Sono state riscontrate 8 positività agli ANCA, 4 ai p-anca e 4 ai c-anca. Sono stati analizzati: una membrana basale glomerulare (MBG), 1 positivo all anticoagulante tipo lupus e 4 di ciascuno dei seguenti: Sm, RNP, SS-A, SS-B, Scl-70, Jo-1. Dei rimanenti sieri 4 erano anticardiolipina, 3 β 2 GPI, 2 positivi alla protrombina, 1 istone e 3 campioni di pazienti affetti da diabete di tipo 1 positivi agli ICA. Solamente 4 campioni hanno dato risultati positivi. Due di questi erano fortemente positivi con 83 e 66 unità. Entrambi i campioni sono stati analizzati tramite IFA con il kit NOVA Lite ANA Plus Mouse Kidney & Stomach (rene/stomaco di topo) e sono risultati positivi agli anticorpi anti-muscolo liscio con un titolo di 1:320 e con pattern tipico dell actina. Due campioni sono risultati debolmente positivi, entrambi con 26 unità. Nessuno di questi due ha mostrato alcuna reattività al muscolo liscio con l immunofluorescenza. Entrambi i campioni erano positivi agli ANA ed al DNA. Analisi di 83 campioni riconosciuti positivi al muscolo liscio La seguente tabella elenca la positività all actina tramite ELISA secondo il titolo IFA al muscolo liscio. Titolo IFA Numero Numero actina positivi % positivi % % % % % % % Totale % Precisione e riproducibilità La precisione e la riproducibilità del metodo sono state valutate testando sei repliche di un campione negativo (14 unità), uno debolmente positivo (25 unità) ed uno fortemente positivo (110 unità) durante sei esperimenti diversi. La precisione Inter ed Intra-Test è stata calcolata nel seguente modo: La deviazione standard ed il coefficiente di variazione per ciascun campione sono riportati nella seguente tabella. Negativo Debolmente Positivo Fortemente Positivo SD CV SD CV SD CV Generale 1,3 9,7% 1,4 5,5% 4,5 4,1% Intra-test 1,1 8,0% 1,4 5,8% 3,8 3,5% Inter-test 1,2 8,6% 1,3 5,3% 5,3 4,2% 6

7 Bibliografia 1. Anderson P, et al. Studies on the specificity of smooth-muscle antibodies. Clin Exp Immunol 26:57-66, Bottazzo GF, et al. Classification of smooth muscle autoantibodies detected by immunofluorescence. J Clin Pathol 129: , George, J and Shoenfeld Y. Actin Autoantibodies, p10-12 in Autoantibodies by JB Peter and Y Shoenfeld eds. Elsevier, Amsterdam, Bretherton L, et al. Elisa assay for IgG autotantibody to G-actin: comparison of chronic active hepatitis and acute viral hepatitis. Clin Exp Immunol 51: , Dighiero G, et al. Sera with high levels of antismooth muscle and anti mitochondrial antibodies frequently bind to cytoskeletal proteins. Clin Ept Immunol 82:52-56, Fagraeus A and Norberg R. Antiactin antibodies. Curr Top Microbiol Immunol 82:1-13, DeScheerder I, et al. Post-Cardiac injury syndrome and an increased humoral immune response against the major contractile proteins (actin and myosin). Am J Cardiol 56: , Leibovitch L, et al. Anti-actin antibodies in sera from patients with autoimmune liver diseases and patients with carcinomas by ELISA. Immunol Letters 48: , Kurki P, et al. Smooth muscle antibodies of actin and nonactin specificity. Clin Immuno Immunpathol 9: , Toh BH, et al. Viral infections and IgM autoantibody to cytoplasmic intermediate filaments. Clin Exp Immunol 37:76-82, Alvarez F, et al. International autoimmune hepatitis group report: review of criteria for diagnosis of autoimmune hepatitis. J of Hepatology 31: , Toh BH. Smooth muscle atuoantibodies and autoantigens. Clin Exp Immunol 38: , Fusconi M, et al. Anti-actin antibodies: a new test for an old problem? J Immunol Mehtods 130:1-8, Czaja A, et al. Frequency and significance of antibodies to actin in type 1 autoimmune hepatitis. Hepatology 24: , Homberg J, et al. Chronic active hepatitis associated with antiliver/kidney microsome antibody type 1: a second type of autoimmune hepatitis. Hepatology 7: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition. Fornitore: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Rappresentante Autorizzato: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service ITA September 2009 Revision 4 7