QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata

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1 QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata Finalità d uso Il test QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA è un test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) per la determinazione semiquantitativa di anticorpi anti-fattore Intrinseco nel siero umano. La presenza di anticorpi anti-fattore Intrinseco, unitamente ai risultati clinici e ad altri esami di laboratorio, può agevolare la diagnosi di anemia perniciosa. Riassunto e Spiegazione del test L anemia perniciosa (Biemer's 'anemia) è una malattia cronica ed è lo stadio terminale della gastrite atrofica cronica di tipo A (autoimmune). Il Tipo A è di natura autoimmune e associato all anemia perniciosa. Il Tipo B (non-autoimmune) è associato a infezione da H. pylori. 1,2,3 Durante la progressione della gastrite atrofica di tipo A, le cellule gastriche parietali, che producono il Fattore Intrinseco e l HCl, e le cellule zimogene, che producono il pepsinogeno, vengono distrutte e la produzione di Fattore Intrinseco (IF) e HCl viene eliminata. Il Fattore Intrinseco è essenziale per l assorbimento della vitamina B 12 da parte dell intestino e la sua assenza conduce a deficit di vitamina B 12 e anemia megaloblastica. La diagnosi di anemia perniciosa è importante per il trattamento dell anemia stessa e la prevenzione del danno neurologico irreversibile. 1,4 È stato riferito che i pazienti con anemia perniciosa hanno un rischio tre volte aumentato di carcinoma gastrico, un rischio 13 volte aumentato di carcinoide gastrico e un rischio aumentato di cancro esofageo a cellule squamose. 5-7 Gli anticorpi circolanti anti-fattore Intrinseco sono molto specifici e possono essere individuati in >50% dei pazienti con anemia perniciosa. 1,3 Questi anticorpi sono di 2 tipi: anticorpi bloccanti di Tipo 1 che impediscono il legame della vitamina B 12 alla molecola di IF e anticorpi di Tipo 2 che possono interferire con il legame del complesso IF-vitamina B 12 al recettore ileale. 1,8 Il test QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA, contrariamente ai metodi basati su radioimmunodosaggio, rileva gli anticorpi di tipo sia 1 sia 2. Insieme ad altri dati clinici e di laboratorio, un risultato positivo agli anticorpi anti-fattore Intrinseco può aiutare a distinguere l anemia perniciosa autoimmune da altre anemie megaloblastiche nonché a distinguere la gastrite atrofica di tipo A da altre forme non specifiche di gastrite istologica. 1,3,9 Principio della Metodica L antigene anti-fattore Intrinseco umano ricombinante intero purificato si lega nei pozzetti di una piastra di micropozzetti di polistirene in condizioni che consentono la conservazione dell antigene al suo stato nativo. I controlli pre-diluiti ed i sieri diluiti dei pazienti vengono distribuiti nei pozzetti corrispondenti, consentendo agli anticorpi anti-fattore Intrinseco eventualmente presenti di legarsi all antigene adsorbito. L eccesso di campione non legato viene allontanato mediante il lavaggio e successivamente si aggiunge a ciascun pozzetto un anticorpo anti-igg umane marcato con un enzima. Una seconda incubazione consente agli anticorpi anti-igg umane marcati con l enzima di legarsi agli anticorpi del paziente che si sono eventualmente legati alla parete dei pozzetti. Dopo ulteriore lavaggio per allontanare l eccesso di anticorpi anti-igg umane marcati con l enzima, l attività dell enzima rimasto viene misurata aggiungendo un substrato cromogenico e misurando l intensità del colore che si sviluppa. Il test può essere letto mediante uno spettrofotometro ed interpretato confrontando l intensità del colore che si sviluppa nei pozzetti dei campioni con quella dei pozzetti dei controlli. Reagenti 1. Piastra di micropozzetti di polistirene ELISA rivestita di Fattore Intrinseco umano ricombinante (12-1 x 8 pozzetti), con supporto, in busta chiusa contenente materiale essicante 2. Controllo ELISA Negativo, 1 flacone di tampone contenente conservante e siero umano senza anticorpi umani anti-intrinsic Factor antigene, prediluito, 1,2mL 3. Controllo ELISA fortemente positivo per Intrinsic Factor, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi umani anti-intrinsic Factor antigene, prediluito, 1,2mL 4. Controllo ELISA debolmente positivo per Intrinsic Factor, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi umani anti-intrinsic Factor antigene, prediluito, 1,2mL 5. Diluente per campioni HRP, 1 flacone di colore rosa contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris, Tween 20, stabilizzatori delle proteine e conservante, 50mL 6. Soluzione di lavaggio HRP Concentrata, 1 flacone di soluzione concentrata 40x di colore rosso contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris e Tween 20, 25mL. Vedi la Sezione Metodi per le istruzioni sulla diluizione. 7. Coniugato HRP IgG, (montone), anti-igg umane, 1 flacone di colore blu contenente tampone, stabilizzatori delle proteine e conservante, 10mL 8. Cromogeno TMB, 1 flacone contenente stabilizzatori, 10mL 9. Soluzione di arresto HRP, Acido solforico 0,344M, 1 flacone incolore, 10mL Avvertenze 1. ATTENZIONE: Questo prodotto contiene un composto chimico (cloramfenicolo allo 0,02%) nel diluente per i campioni, nei controlli e nel coniugato, noto allo Stato della California come causa di tumori. 2. Tutte le fonti umane di materiali usati nella preparazione dei controlli per questo prodotto sono state testate e sono risultate negative per la presenza di anticorpi anti-hiv, per HBsAg e per anticorpi anti- HCV mediante metodi approvati dall FDA. Tuttavia nessun test offre la certezza completa dell assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i Controlli ELISA fortemente positivo 1

2 Intrinsic Factor, ELISA debolmente positivo Intrinsic Factor ed ELISA Negativo devono essere maneggiati come materiali potenzialmente infettivi La sodio azide è usata come conservante. La sodio azide è un veleno e può essere tossica se ingerita o assorbita attraverso la cute o gli occhi. La sodio azide può reagire con le tubature di piombo o rame formando azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lasciar scorrere grandi quantità di acqua, se si usa un lavandino per eliminare i reagenti, per prevenire la formazione di azidi. 4. Il Coniugato HRP contiene un composto chimico velenoso/corrosivo, che può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. 5. Il Cromogeno TMB contiene un irritante, che può essere dannoso se inalato, ingerito o assorbito attraverso la cute. Per prevenire lesioni, evitare l inalazione, l ingestione o il contatto con la cute e con gli occhi. 6. La Soluzione di arresto HRP è costituita da una soluzione di acido solforico diluito. Evitare l esposizione a basi, metalli o altri composti che possono reagire con gli acidi. L acido solforico è velenoso e corrosivo e può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. 7. Usare appropriati indumenti personali protettivi mentre si lavora con i reagenti forniti. 8. I reagenti eventualmente rovesciati devono essere rimossi immediatamente. Seguire tutte le normative vigenti in materia di eliminazione dei residui di natura chimica. Precauzioni 1. Questo prodotto è stato messo a punto per l uso diagnostico In Vitro. 2. La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel kit può causare risultati non attendibili. 3. Un lavaggio incompleto o non accurato e l insufficiente aspirazione del liquido dai pozzetti ELISA può causare una scarsa precisione e/o un elevato background. 4. L adattamento di questo test all uso con apparecchiature automatiche e altri dispositivi per trattamento dei campioni liquidi, in toto o in parte, può causare differenze nei risultati rispetto a quelli ottenuti mediante la procedura manuale. E responsabilità di ciascun Laboratorio confermare che le procedure automatizzate utilizzate diano risultati entro limiti di accettabilità. 5. Una serie di fattori influenza le prestazioni del test. Essi comprendono l iniziale temperatura dei reagenti, la temperatura dell ambiente, l accuratezza e la riproducibilità della tecnica di pipettamento, la scrupolosità delle operazioni di lavaggio e di aspirazione del liquido dai pozzetti delle piastre ELISA, il tipo di spettrofotometro usato per leggere i risultati e la lunghezza dei tempi di incubazione durante l esecuzione del test. Bisogna prestare molta attenzione alla costanza per ottenere risultati accurati e riproducibili. 6. Si raccomanda di attenersi scrupolosamente alle istruzioni fornite. 7. Una chiusura incompleta della busta richiudibile contenente le strisce di pozzetti ed il materiale essicante causa la degradazione dell antigene ed una scarsa precisione nei risultati. 8. Valori di assorbanza inaccettabilmente bassi possono essere osservati dopo aver usato due o più volte lo stesso flacone di coniugato HRP per un certo periodo di tempo. E importante seguire attentamente le istruzioni fornite per il trattamento del coniugato HRP per evitare tale inconveniente. 9. Un eventuale contaminazione chimica del coniugato HRP può essere conseguenza di una impropria pulizia o risciacquo di apparecchi o di strumenti. Residui di comuni reagenti chimici di laboratorio quali formalina, candeggina, etanolo o detergenti causano la degradazione nel tempo del coniugato HRP. Risciacquare molto accuratamente tutti gli apparecchi e gli strumenti dopo l uso di detergenti chimici. Condizioni di conservazione 1. Conservare tutti i reagenti del kit a 2-8 C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza se conservati e trattati seguendo le istruzioni fornite. 2. Le strisce di pozzetti non utilizzate devono essere rimesse immediatamente nella busta richiudibile contenente il materiale essicante e conservate nella busta ben chiusa a 2-8 C. 3. Il tampone di lavaggio diluito è stabile per 1 settimana a 2-8 C. Raccolta dei campioni Questa tecnica deve essere usata con un campione di siero. L aggiunta al campione di sodio azide o di altri conservanti può influenzare in modo negativo i risultati. Campioni con segni di contaminazione microbica, trattati con calore o contenenti particelle visibili non dovrebbero essere usati. Si dovrebbe evitare anche l uso di sieri fortemente emolizzati o lipemici. Dopo il prelievo, il siero dovrebbe essere separato dal coagulo. Il Documento H18-A3 CLSI (dell NCCLS) raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) Conservare i campioni a temperatura ambiente per non più di 8 ore. 2) Se il test non può essere eseguito entro 8 ore, conservare i campioni in frigorifero a 2-8 C. 3) Se il test non può essere eseguito entro 48 ore, oppure per la spedizione dei campioni, congelare a - 20 C. I campioni congelati devono essere mescolati bene dopo lo scongelamento e prima di essere testati. 11 Procedura Materiali forniti 1 Piastra microtiter ELISA Intrinsic Factor (12-1 x 8 pozzetti), con supporto 1 1,2mL Controllo ELISA Negativo prediluito 1 1,2mL Controllo ELISA debolmente positivo Intrinsic Factor prediluito 1 1,2mL Controllo ELISA fortemente positivo Intrinsic Factor prediluito 2

3 1 50mL Diluente per campioni HRP 1 25mL Soluzione di lavaggio HRP concentrata, 40x concentrata 1 10mL Coniugato HRP IgG, (montone) 1 10mL Cromogeno TMB 1 10mL Soluzione di arresto HRP, 0,344M Acido solforico Materiali richiesti ma non forniti Micropipette in grado di erogare volume di 5, 100, e 500µL Puntali monouso per micropipette Provette per la diluizione dei sieri, volume 4mL Acqua distillata o deionizzata Beuta da 1L per diluite la Soluzione di lavaggio HRP concentrata Lettore per piastre ELISA in grado di leggere a 450nm (e 620nm per le letture a doppia lunghezza d onda) Metodica Prima di incominciare 1. Portare tutti i reagenti ed i campioni a temperatura ambiente (20-26 o C) e mescolarli bene. 2. Diluire la Soluzione di lavaggio HRP concentrata 1:40 aggiungendo il contenuto del flacone fornito con il kit a 975mL di acqua distillata o deionizzata. Se non si usa l intera piastra in una sola volta, si può preparare una minore quantità di soluzione di lavaggio aggiungendo 2,0mL di concentrato a 78mL di acqua distillata o deionizzata ogni 16 pozzetti utilizzati. La soluzione di lavaggio diluita è stabile per 1 settimana a 2-8 o C. 3. Preparare una diluizione 1:101 di ciascun campione da testare aggiungendo 5µL di siero a 500µL di Diluente per campioni HRP. I campioni diluiti devono essere testati entro 8 ore dalla preparazione. NON DILUIRE i Controllo ELISA debolmente positivo Intrinsic Factor, Controllo ELISA fortemente positivo Intrinsic Factor ed Controllo ELISA Negativo. 4. La determinazione della presenza o dell assenza di anticorpi anti-fattore Intrinseco utilizzando unità arbitrarie richiede due pozzetti per ciascuno dei tre controlli e uno o due pozzetti per ogni campione del paziente. Si raccomanda di testare i campioni in duplicato. Esecuzione del test 1. TUTTI I REAGENTI DEVONO ESSERE PORTATI A TEMPERATURA AMBIENTE (20-26 C) PRIMA DI INIZIARE IL TEST. Posizionare i pozzetti/le strisce necessarie nel supporto. Rimettere immediatamente la strisce inutilizzate nella busta contenente il materiale essicante e sigillarla bene per minimizzare l esposizione all umidità ambientale. 2. Distribuire 100µL dei Controlli ELISA debolmente positivo Intrinsic Factor, ELISA fortemente positivo Intrinsic Factor ed ELISA Negativo prediluiti e dei sieri diluiti nei rispettivi pozzetti. Coprire i pozzetti ed incubare per 30 minuti a temperatura ambiente su una superficie piana. Il tempo di incubazione inizia dopo l aggiunta dell ultimo campione. 3. Lavaggio: Aspirare completamente il contenuto di ciascun pozzetto. Distribuire µL di soluzione di lavaggio HRP diluita in tutti i pozzetti e quindi aspirarla. Ripetere questa operazione per altre due volte, per un totale di tre lavaggi. Dopo l ultimo lavaggio capovolgere la piastra e scuoterla fermamente su tovaglioli di carta assorbente per rimuovere eventuali residui di liquido. E importante vuotare completamente ciascun pozzetto dopo ciascun lavaggio. Per l aspirazione mantenere la stessa sequenza usata per l aggiunta dei campioni. 4. Distribuire 100μL di Coniugato HRP IgG in ciascun pozzetto. Il coniugato dovrebbe essere prelevato dal flacone mediante tecniche sterili. Prelevare dal flacone solo la quantità di coniugato necessaria per l esecuzione del test. PER EVITARE POSSIBILI CONTAMINAZIONI MICROBICHE E/O CHIMICHE, NON RIMETTERE MAI IL CONIUGATO INUTILIZZATO NEL FLACONE. Incubare i pozzetti per 30 minuti come descritto al punto Lavaggio: Ripetere la procedura descritta al punto Distribuire 100µL di Cromogeno TMB in ciascun pozzetto ed incubare al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. 7. Distribuire 100µL di Soluzione di arresto HRP in ogni pozzetto. Per l aggiunta della Soluzione di arresto HRP mantenere la stessa sequenza e gli stessi tempi utilizzati per l aggiunta del Cromogeno TMB. Agitare gentilmente la piastra con le dita per mescolare completamente i reagenti nei pozzetti. 8. Leggere l assorbanza (OD) di ciascun pozzetto a 450nm entro 1 ora dall aggiunta della soluzione di arresto. Se si preferisce una lettura a doppia lunghezza d onda, si può usare la lunghezza d onda di 620nm come riferimento. Controllo di qualità 1. I Controlli ELISA debolmente positivo Intrinsic Factor, ELISA fortemente positivo Intrinsic Factor ed ELISA Negativo devono essere inclusi ogni volta che si esegue il test per assicurare che tutti i reagenti ed il test funzionino in modo corretto. 2. Si deve notare che, poichè i Controlli ELISA debolmente positivo Intrinsic Factor, ELISA fortemente positivo Intrinsic Factor ed ELISA Negativo sono prediluiti, essi non rappresentano un controllo procedurale per le tecniche di diluizione utilizzate per i campioni. 3. Ulteriori controlli possono essere inclusi in base alle indicazioni o alle richieste delle vigenti regolamentazioni o delle organizzazioni di accreditamento. Ulteriori sieri di controllo possono essere preparati raccogliendo un pool dei sieri umani, aliquotandolo e conservandolo a < -20 C. 4. Perchè i risultati del test siano considerati validi, tutti i seguenti criteri devono essere soddisfatti. Se anche uno solo non rientra nei valori specificati, i risultati non dovrebbero essere considerati validi ed 3

4 il test dovrebbe essere ripetuto. a. L assorbanza del Controllo ELISA fortemente positivo Intrinsic Factor prediluito deve essere maggiore di quella del Controllo ELISA debolmente positivo Intrinsic Factor prediluito che a sua volta deve essere maggiore di quella del Controllo ELISA Negativo prediluito. b. Il Controllo ELISA fortemente positivo Intrinsic Factor prediluito deve avere un assorbanza maggiore di 1,0 mentre l assorbanza del Controllo ELISA Negativo prediluito non deve essere maggiore di 0,2. c. L assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo Intrinsic Factor deve essere maggiore di due volte rispetto a quella del Controllo ELISA Negativo oppure >0,25. d. Il Controllo ELISA Negativo e quello ELISA fortemente positivo Intrinsic Factor servono per controllare un eventuale malfunzionamento dei reagenti. Il Controllo ELISA fortemente positivo Intrinsic Factor non assicura la precisione in corrispondenza del valore soglia del test. e. L utente del test dovrebbe fare riferimento al Documento C24-A2 CLSI (dell NCCLS) per ulteriori informazioni su appropriate tecniche di Controllo di Qualità. 12 Calcolo dei risultati Si deve determinare innanzitutto il valore medio di assorbanza per ciascun set di duplicati. La reattività di ciascun campione viene quindi calcolata dividendo il valore medio di assorbanza del campione per il valore medio di assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo Intrinsic Factor e moltiplicando il risultato per il numero di unità assegnate al Controllo ELISA debolmente positivo Intrinsic Factor, che è stampato sull etichetta del flacone. Assorbanza campione Valore del campione = x Valore Controllo ELISA debolmente positivo Intrinsic Factor (unità) Assorbanza Controllo ELISA debolmente positivo Intrinsic Factor (unità) La reattività è collegata in modo non lineare alla quantità di anticorpi presente. Mentre gli aumenti e le diminuzioni delle concentrazioni degli anticorpi vengono evidenziate da un corrispondente aumento o diminuzione della reattività, il cambiamento non è proporzionale (ad es., un raddoppio della concentrazione di anticorpi non raddoppia necessariamente la reattività). Se si desidera una più accurata quantificazione del contenuto di anticorpi, si possono allestire e testare diluizioni seriate del campione. L ultima diluizione che risulta positiva nel test dovrebbe essere refertata come il titolo anticorpale del paziente. Interpretazione dei risultati Il metodo ELISA è molto sensibile alla procedura ed è in grado di individuare anche piccole differenze nella popolazione dei pazienti. I valori riportati qui di seguito sono solo valori suggeriti. Ciascun Laboratorio dovrebbe stabilire il proprio range di normalità basato sulla procedura da esso utilizzata, sui controlli, sull apparecchiatura e sulla popolazione di pazienti secondo le proprie metodiche standard. I campioni vengono interpretati come negativi, equivoci o positivi in base alla seguente tabella: Unità Negativo 20 Equivoci 20,1 24,9 Positivo >25 1. Un risultato positivo indica la presenza di anticorpi anti-fattore Intrinseco e suggerisce la possibilità di anemia perniciosa. 2. Un risultato negativo indica l assenza di anticorpi anti-fattore Intrinseco o livelli inferiori al cut-off del test. 3. Un risultato negativo per il Fattore Intrinseco non esclude la diagnosi di anemia perniciosa dato che solo il 60% dei pazienti con anemia perniciosa hanno questo anticorpo Non è possibile valutare lo stato anticorpale di un campione con livelli equivoci di anticorpi anti- Fattore intrinseco. Se i risultati rimangono equivoci dopo ripetuti test, sarebbe opportuno riportare il risultato come equivoco e/o prelevare un altro campione in un momento successivo. 5. La presenza di anticorpi anti-cellule parietali gastriche può o meno essere concorde con quella degli anticorpi anti-fattore intrinseco e la loro misurazione, in aggiunta o in associazione alla misurazione degli anticorpi anti-fattore Intrinseco, può essere di aiuto nella valutazione di pazienti con sospetta anemia perniciosa Sul referto si dovrebbe riportare la seguente frase: I seguenti risultati sono stati ottenuti mediante il test QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA della INOVA. I valori Intrinsic Factor ottenuti con test prodotti da altre Ditte possono non essere utilizzabili in modo intercambiabile. Il livello di IgG determinato con questo metodo non può essere correlato ad un titolo endpoint. Limitazioni del test 1. La presenza nel campione di complessi immuni o di altri aggregati di immunoglobuline può causare un aumento del livello di reazioni a specifiche con conseguenti risultati falsi positivi con questo test. 2. I risultati di questo test devono essere valutati dal medico curante alla luce del quadro clinico del paziente e del risultato degli altri test sierologici. I pazienti con anemia perniciosa possono avere anticorpi anti-fattore Intrinseco e/o anticorpi anti-cellule parietali gastriche. Mentre la presenza di entrambi gli anticorpi aumenta la fiducia nella diagnosi di anemia perniciosa, i pazienti con anemia perniciosa possono avere solo uno dei due anticorpi. 1,9 4

5 3. Le prestazioni caratteristiche del test non sono state valutate per campioni diversi dal siero. Valori attesi Range normale Un panel di 476 campioni ottenuti da soggetti sani e asintomatici è stato testato con il kit QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA. L'età dei soggetti era compresa tra 14 e 78 anni (valore mediano 43). Dei 276 campioni di cui erano note le informazioni sull età e sul sesso, 150 provenivano da uomini e 126 da donne. Dei 476 campioni, uno era fortemente positivo con 103,2 unità, 1 mostrava una positività borderline con 25,5 unità e uno era dubbio borderline con 20,2 unità. La specificità del test era del 99,4% (473/476). La frequenza dell anemia perniciosa è stata stimata pari a 0,1-0,2%. Escludendo il valore erratico del risultato marcatamente positivo, i valori medio e mediano del gruppo di controllo sano erano pari a 5,7 unità e 5,0 unità. Caratteristiche specifiche delle prestazioni Un totale di 177 campioni ottenuti da pazienti con anemia perniciosa sospetta, presunta o confermata come descritto di seguito in Studi clinici e 499 campioni di controlli sani (476) e malati (23) sono stati analizzati con il test QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA allo scopo di valutare la sensibilità e la specificità del test. I valori medi e mediani relativi al gruppo senza anemia perniciosa sono risultati rispettivamente pari a 5,9 e 4,9 unità. Riassunto degli studi clinici I campioni sono stati classificati in 3 categorie per riflettere il grado di fiducia in una diagnosi di anemia perniciosa: 1) Sospetta anemia perniciosa positività degli anticorpi anti-cellule parietali gastriche e/o livello di vitamina B 12 ridotto ma risultati degli anticorpi anti-fattore Intrinseco discrepanti, 2) Presunta anemia perniciosa misurazioni di laboratorio coerenti con l anemia perniciosa compresa positività delle cellule parietali gastriche, livelli di vitamina B 12 ridotti e volume corpuscolare medio aumentato (tipico dell anemia perniciosa), 3) Anemia perniciosa confermata misurazioni di laboratorio coerenti con l anemia perniciosa tra cui positività degli anticorpi anti-cellule parietali gastriche, livelli di vitamina B 12 ridotti e volume corpuscolare medio aumentato (tipico dell anemia perniciosa) e conferma ematologica di anemia megaloblastica. È stata calcolata la sensibilità: 1) conteggiando i campioni con anemia perniciosa confermata o presunta come positivi alla malattia e i campioni con anemia perniciosa sospetta come negativi alla malattia e 2) contando i campioni con anemia perniciosa "confermata, presunta e sospetta" come positivi alla malattia. Nessuno dei campioni con anemia sospetta è risultato positivo agli anticorpi anti-fattore Intrinseco. Tabella 1: Sensibilità e specificità di QUANTA Lite Intrinsic Factor ELISA n = pos eq neg Anemia perniciosa confermata (n=43) e presunta (n=55)* Tutti i campioni di anemia perniciosa** Anemia perniciosa sospetta (n=79), presunta (n=55) e confermata (n=43) Anemia non perniciosa (controlli sani e controlli malati) * i campioni con sospetta anemia perniciosa sono stati conteggiati come negativi alla malattia ** i campioni con sospetta anemia perniciosa sono stati conteggiati come positivi alla malattia Sensibilità 1) I gruppi di anemia perniciosa presunta e confermata includevano come positivi alla malattia: 93,9% (92/98); Intervallo di confidenza (IC) 95%: 87,1%- 97,7% Nota: I risultati equivoci sono stati considerati come negativi nell analisi 2) I gruppi con anemia perniciosa sospetta, presunta o confermata sono stati inclusi come positivi alla malattia: 52,0% (92/177); 95% Intervallo di confidenza (IC): 44,4%- 59,5% Nota: I risultati equivoci sono stati considerati come negativi nell analisi Specificità 99,6% (497/499); 95% Intervallo di confidenza (IC): 98,8-100% Nota: I risultati equivoci sono stati considerati come negativi nell analisi Efficienza 1) I gruppi di anemia perniciosa presunta e confermata includevano come positivi alla malattia: 98,7% 2) I gruppi con anemia perniciosa sospetta, presunta o confermata sono stati inclusi come positivi alla malattia: 87,1% Confronto con i predicate device Il test QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA è stato confrontato con un test ELISA (GPA) relativo agli anticorpi anti-cellule parietali approvato dall FDA e un test RIA per gli anticorpi anti-fattore Intrinseco (IF). La concordanza delle percentuali negative era compreso tra il 97,5 e il 100% per tutti e tre i test. La concordanza delle percentuali positive tra il test QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA e il test IF RIA eseguito sul sito 1 era pari al 93,3%, ma pari al 30,3% sul sito 2. Tutti i risultati positivi al test RIA sul sito 1 provenivano da soggetti con evidenza ematologica di anemia perniciosa. Per i campioni sul sito 2 non erano disponibili informazioni cliniche. 5

6 Tabella 2: Concordanza tra il test QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA e i test predicati Predicate GPA ELISA Predicate Intrinsic Factor RIA Luogo 1 Predicate Intrinsic Factor RIA Luogo 2 QUANTA Lite TM Positivo % Accordo 29,7% (22/74) 93,2% (41/44) 30,3% (24/79) Intrinsic Factor Negativo % Accordo 97,5% (193/198) 100% (25/25) 100% (26/26) Anticorpo ELISA Generale Agreement 49,1% (220/278) 95,6% (66/69) 63,3% (50/79) Reazioni crociate Il siero ottenuto da 23 pazienti con anticorpi anti malattie autoimmuni o infettive comprendenti l H. pylori, l M2 mitocondriale, il citomegalovirus, il virus dell herpes simplex, ASCA, RNP, SS-A, SS-B, Scl-70, dsdna, la transaminasi tissutale e la membrane basale glomeruale sono stati sottoposti a test per rilevare la crossreattività con il test QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA. Nessuno dei campioni è risultato positivo al test QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA. Precisione e riproducibilità Le prestazioni sono state valutate fra i test analizzando 7 campioni e il controllo alto positivo (HPC) del kit per un totale di 5 volte ciascuno. Tabella 3: Performance Intra-Test del QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA Camp.A (HPC) Camp.B Camp.C Camp.D Camp.E Camp.F Camp.G Camp.H Unità medie 108,1 45,4 115,2 108,7 21,3 17,1 10,6 13,4 Deviazione standard 2,1 0,8 2,5 3,4 1,7 0,8 0,4 0,7 Coefficiente di variazione % 1,9 1,8 2,2 3,2 8,0 5,0 4,0 5,3 Le prestazioni inter-test sono state valutate testando, in doppio, 5 campioni, il kit di controllo alto positivo (HPC) e il controllo negativo (NC) due volte al giorno (una volta al mattino e una volta al pomeriggio) per 3 giorni. Tabella 4: Performance Inter-Test del QUANTA Lite TM Intrinsic Factor ELISA (HPC) NC Camp.1 Camp.2 Camp.3 Camp.4 Camp.5 Unità medie 109,1 1,1 107,9 47,4 13,9 108,0 29,2 Deviazione standard 6,0 0,2 4,8 1,7 0,7 5,4 2,4 Coefficiente di variazione % 5,5 14,4 4,5 3,6 5,0 5,0 8,2 6

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