QUANTA Lite TM M2 EP (MIT3) Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata

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1 QUANTA Lite TM M2 EP (MIT3) Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata Finalità d uso QUANTA Lite TM M2 EP (MIT3) è un test immunoenzimatico per la ricerca semi-quantitativa di anticorpi antimitocondrio nel siero umano. La presenza di anticorpi anti-mitocondrio può essere usata, insieme al quadro clinico del paziente ed al risultato degli altri test di laboratorio eseguiti, come aiuto nella diagnosi di cirrosi biliare primaria. Riassunto e Spiegazione del test La cirrosi biliare primaria (PBC) è una malattia epatica cronica caratterizzata dalla distruzione dei piccoli dotti biliari intraepatici. La distruzione progressiva dei dotti porta ad un aumento del danno funzionale epatico e nel tempo può portare a insufficienza epatica e alla necessità di trapianto del fegato. 1, 2 L eziologia della PBC è sconosciuta, anche se una componente genetica e altri fattori potrebbero essere importanti nello sviluppo 1, 3, 4 della malattia. La PBC in genere insorge ad un età fra 30 e 65 anni e colpisce le donne più di frequente rispetto agli uomini (il rapporto stimato donna:uomo è di 9:1). 3, 4 La prevalenza di PBC nei parenti di primo grado di pazienti affetti da PBC può variare da 1,3 a 6,4%. 4, 5 La PBC è presente in tutte le razze ed ha una distribuzione a livello mondiale. Sono state riportate delle grandi variabilità nella prevalenza geografica della PBC, da una stima di 2 ogni soggetti in Giappone e Australia fino a 40 ogni soggetti negli Stati Uniti. 3, 6 I test sierologici rappresentano un ausilio importante per l'individuazione e la diagnosi di PBC poiché molti anticorpi associati alla PBC sono presenti prima della comparsa dei sintomi. 7-9 Gli anticorpi anti-mitocondriali (AMA) rilevati mediante il test di immunofluorescenza indiretta (IFA) rappresentano i classici marker sierologici della PBC. 10 Anche se gli AMA sono stati riportati fino nel 90-95% dei pazienti PBC, la frequenza di rilevamento può essere significativamente inferiore. 11 Il rilevamento degli AMA da parte del test IFA è altamente dipendente dalle abilità dell operatore, dalle componenti tecniche del test e dalla presenza di altri anticorpi che possono oscurare o confondere l interpretazione dei modelli IFA. Precedenti studi hanno descritto 9 sottotipi di antigeni mitocondriali, denominati M1-M9. 12 I principali autoantigeni individuati dai sieri di pazienti PBC riconoscono la frazione antigenica M2. I componenti primari dell antigene M2 sono risultati membri del complesso 1-oxo-acido deidrogenasi. Gli specifici antigeni sono stati identificati come sottounità E2 del complesso piruvato deidrogenasi (PDC-E2), del complesso 2-oxoacido deidrogenasi della catena ramificata (BCOADC-E2) e del complesso 2-oxo glutarato deidrogenasi (OGDC-E2). 13 L identificazione di questi antigeni ha permesso lo sviluppo dei test ELISA. I test ELISA si sono dimostrati più sensibili rispetto al test IFA I test ELISA anti-m2 di prima generazione hanno utilizzato PDC-E2 come substrato primario per rilevare la presenza di anticorpi PBC specifici. Mentre l 80-90% dei pazienti affetto da PBC dimostrata istologicamente hanno anticorpi anti-pdc-e2, circa il 10% dei pazienti PBC reagisce solo a BCOADC-E2 e/o OGDC-E2. 18,19 Gershwin e Leung hanno sviluppato e brevettato un clone ibrido a triplice espressione ( MIT3 ) che esprime gli epitopi immunodominanti di PDC- E2, BCOADC-E2 e OGDC-E2. 11, 15, 16, 19 Il test ELISA su base MIT3 ha dimostrato prestazioni superiori rispetto al test IFA e ai test ELISA convenzionali su base PDC-E2 e ha rilevato anticorpi AMA in oltre due terzi dei sieri di pazienti PBC AMA-negativi (con il test IFA). 15, 16 Poiché la presenza degli anticorpi AMA può precedere lo sviluppo della malattia sintomatica, la capacità di poter identificare più accuratamente la presenza di marker della PBC può contribuire ad una diagnosi e ad un trattamento precoci e può rallentare la progressione della malattia. 7,8,9 Principio della Metodica L antigene ricombinante purificato per affinità (MIT3) contenente porzioni immunodominanti di PDC-E2, BCOADC-E2 e OGDC-E2 si lega ai pozzetti della piastra di polistirene in condizioni che possono conservare l antigene al suo stato nativo. I controlli prediluiti ed i sieri paziente diluiti vengono aggiunti in pozzetti separati consentendo agli anticorpi antimitocondriali presenti di legarsi all antigene immobilizzante. L eccesso di campione non legato viene allontanato mediante il lavaggio e successivamente si aggiunge a ciascun pozzetto un anticorpo anti-igg umane marcato con un enzima. Una seconda incubazione consente agli anticorpi anti-igg umane marcati con l enzima di legarsi agli anticorpi del paziente che si sono eventualmente legati alla parete dei pozzetti. Dopo ulteriore lavaggio per allontanare l eccesso di anticorpi anti-igg umane marcati con l enzima, l attività dell enzima rimasto viene misurata aggiungendo un substrato cromogenico e misurando l intensità del colore che si sviluppa. Il test può essere letto mediante uno spettrofotometro ed interpretato confrontando l intensità del colore che si sviluppa nei pozzetti dei campioni con quella dei pozzetti dei controlli. Reagenti 1. Evitare piastre ELISA di micropozzetti di polistirene rivestiti di antigene MIT3 ricombinante purificato, (12-1 x 8 pozzetti), con supporto, in busta chiusa contenente materiale essicante 2. Controllo ELISA Negativo, 1 flacone di tampone contenente conservante e siero umano senza anticorpi umani anti-mitocondrio M2, prediluito, 1,2mL 3. Controllo ELISA fortemente positivo per M2 EP (MIT3), 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi umani anti-mitocondrio M2, prediluito, 1,2mL 4. Controllo ELISA debolmente positivo per M2 EP (MIT3), 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi umani anti-mitochondrio M2, prediluito, 1,2mL 5. Diluente per campioni HRP, 1 flacone di colore rosa contenente soluzione fisiologica tamponata 1

2 con Tris, Tween 20, stabilizzatori delle proteine e conservante, 50mL 6. Soluzione di lavaggio HRP Concentrata, 1 flacone di soluzione concentrata 40x di colore rosso contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris e Tween 20, 25mL. Vedi la Sezione Metodi per le istruzioni sulla diluizione. 7. Coniugato HRP IgG, (montone), anti-igg umane, 1 flacone di colore blu contenente tampone, stabilizzatori delle proteine e conservante, 10mL 8. Cromogeno TMB, 1 flacone contenente stabilizzatori, 10mL 9. Soluzione di arresto HRP, Acido solforico 0,344M, 1 flacone incolore, 10mL Avvertenze 1. ATTENZIONE: Questo prodotto contiene un composto chimico (cloramfenicolo allo 0,02%) nel diluente per i campioni, nei controlli e nel coniugato, noto allo Stato della California come causa di tumori. 2. Tutte le fonti umane di materiali usati nella preparazione dei controlli per questo prodotto sono state testate e sono risultate negative per la presenza di anticorpi anti-hiv, per HbsAg e per anticorpi anti- HCV mediante metodi approvati dall FDA. Tuttavia nessun test offre la certezza completa dell assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i Controlli ELISA fortemente positivo M2 EP (MIT3), ELISA debolmente positivo M2 EP (MIT3) ed ELISA Negativo devono essere maneggiati come materiali potenzialmente infettivi La sodio azide è usata come conservante. La sodio azide è un veleno e può essere tossica se ingerita o assorbita attraverso la cute o gli occhi. La sodio azide può reagire con le tubature di piombo o rame formando azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lasciar scorrere grandi quantità di acqua, se si usa un lavandino per eliminare i reagenti, per prevenire la formazione di azidi. 4. Il Coniugato HRP contiene un composto chimico velenoso/corrosivo, che può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. 5. Il Cromogeno TMB contiene un irritante, che può essere dannoso se inalato, ingerito o assorbito attraverso la cute. Per prevenire lesioni, evitare l inalazione, l ingestione o il contatto con la cute e con gli occhi. 6. La Soluzione di arresto HRP è costituita da una soluzione di acido solforico diluito. Evitare l esposizione a basi, metalli o altri composti che possono reagire con gli acidi. L acido solforico è velenoso e corrosivo e può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. 7. Usare appropriati indumenti personali protettivi mentre si lavora con i reagenti forniti. 8. I reagenti eventualmente rovesciati devono essere rimossi immediatamente. Seguire tutte le normative vigenti in materia di eliminazione dei residui di natura chimica. Precauzioni 1. Questo prodotto è stato messo a punto per l uso diagnostico In Vitro. 2. La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel kit può causare risultati non attendibili. 3. Un lavaggio incompleto o non accurato e l insufficiente aspirazione del liquido dai pozzetti ELISA può causare una scarsa precisione e/o un elevato background. 4. L adattamento di questo test all uso con apparecchiature automatiche e altri dispositivi per trattamento dei campioni liquidi, in toto o in parte, può causare differenze nei risultati rispetto a quelli ottenuti mediante la procedura manuale. E responsabilità di ciascun Laboratorio confermare che le procedure automatizzate utilizzate diano risultati entro limiti di accettabilità. 5. Una serie di fattori influenza le prestazioni del test. Essi comprendono l iniziale temperatura dei reagenti, la temperatura dell ambiente, l accuratezza e la riproducibilità della tecnica di pipettamento, la scrupolosità delle operazioni di lavaggio e di aspirazione del liquido dai pozzetti delle piastre ELISA, il tipo di spettrofotometro usato per leggere i risultati e la lunghezza dei tempi di incubazione durante l esecuzione del test. Bisogna prestare molta attenzione alla costanza per ottenere risultati accurati e riproducibili. 6. Si raccomanda di attenersi scrupolosamente alle istruzioni fornite. 7. Una chiusura incompleta della busta richiudibile contenente le strisce di pozzetti ed il materiale essicante causa la degradazione dell antigene ed una scarsa precisione nei risultati. 8. Valori di assorbanza inaccettabilmente bassi possono essere osservati dopo aver usato due o più volte lo stesso flacone di coniugato HRP per un certo periodo di tempo. E importante seguire attentamente le istruzioni fornite per il trattamento del coniugato HRP per evitare tale inconveniente. 9. Un eventuale contaminazione chimica del coniugato HRP può essere conseguenza di una impropria pulizia o risciacquo di apparecchi o di strumenti. Residui di comuni reagenti chimici di laboratorio quali formalina, candeggina, etanolo o detergenti causano la degradazione nel tempo del coniugato HRP. Risciacquare molto accuratamente tutti gli apparecchi e gli strumenti dopo l uso di detergenti chimici. Condizioni di conservazione 1. Conservare tutti i reagenti del kit a 2-8 C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza se conservati e trattati seguendo le istruzioni fornite. 2. Le strisce di pozzetti non utilizzate devono essere rimesse immediatamente nella busta richiudibile contenente il materiale essicante e conservate nella busta ben chiusa a 2-8 C. 3. Il tampone di lavaggio diluito è stabile per 1 settimana a 2-8 C. Raccolta dei campioni Questa tecnica deve essere usata con un campione di siero. L aggiunta al campione di sodio azide o di altri 2

3 conservanti può influenzare in modo negativo i risultati. Campioni contaminate microbicamente, trattate termicamente o campioni contenenti particolato visibile. Evitare campioni o siero lipemici o itterici, emolizzati in maniera grossolana. Dopo il prelievo, il siero dovrebbe essere separato dal coagulo. Il Documento H18-A3 dell NCCLS raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) Conservare i campioni a temperatura ambiente per non più di 8 ore. 2) Se il test non può essere eseguito entro 8 ore, conservare i campioni in frigorifero a 2-8 C. 3) Se il test non può essere eseguito entro 48 ore, oppure per la spedizione dei campioni, congelare a -20 C. I campioni congelati devono essere mescolati bene dopo lo scongelamento e prima di essere testati. Procedura Materiali forniti 1 Piastra microtiter ELISA M2 EP (MIT3) (12-1 x 8 pozzetti), con supporto 1 1,2mL Controllo ELISA Negativo prediluito 1 1,2mL Controllo ELISA debolmente positivo M2 EP (MIT3) prediluito 1 1,2mL Controllo ELISA fortemente positivo M2 EP (MIT3) prediluito 1 50mL Diluente per campioni HRP 1 25mL Soluzione di lavaggio HRP concentrata, 40x concentrata 1 10mL Coniugato HRP IgG, (montone), anti-igg umane 1 10mL Cromogeno TMB 1 10mL Soluzione di arresto HRP, 0,344M Acido solforico Materiali richiesti ma non forniti Micropipette in grado di erogare volume di 5, 100, e 500µL Puntali monouso per micropipette Provette per la diluizione dei sieri, volume 4mL Acqua distillata o deionizzata Beuta da 1L per diluire la Soluzione di lavaggio HRP concentrata Lettore per piastre ELISA in grado di leggere a 450nm (e 620nm per le letture a doppia lunghezza d onda) Metodica Prima di incominciare 1. Portare tutti i reagenti ed i campioni a temperatura ambiente (20-26 o C) e mescolarli bene. 2. Diluire la Soluzione di lavaggio HRP concentrata 1:40 aggiungendo il contenuto del flacone fornito con il kit a 975mL di acqua distillata o deionizzata. Se non si usa l intera piastra in una sola volta, si può preparare una minore quantità di soluzione di lavaggio aggiungendo 2,0mL di concentrato a 78mL di acqua distillata o deionizzata ogni 16 pozzetti utilizzati. La soluzione di lavaggio diluita è stabile per 1 settimana a 2-8 o C. 3. Preparare una diluizione 1:101 di ciascun campione da testare aggiungendo 5µL di siero a 500µL di Diluente per campioni HRP. I campioni diluiti devono essere testati entro 8 ore dalla preparazione. NON DILUIRE i Controlli ELISA debolmente positivo M2 EP (MIT3), ELISA fortemente positivo M2 EP (MIT3) ed ELISA Negativo. 4. La determinazione della presenza o dell assenza di anticorpi anti-m2 (MIT3) usando unità arbitrarie richiede due pozzetti per ciascuno dei tre controlli ed uno o due pozzetti per ciascun campione clinico. Si raccomanda di testare i campioni in duplicato. Esecuzione del test 1. TUTTI I REAGENTI DEVONO ESSERE PORTATI A TEMPERATURA AMBIENTE (20-26 C) PRIMA DI INIZIARE IL TEST. Posizionare i pozzetti/le strisce necessarie nel supporto. Rimettere immediatamente la strisce inutilizzate nella busta contenente il materiale essicante e sigillarla bene per minimizzare l esposizione all umidità ambientale. 2. Distribuire 100µL dei Controlli ELISA debolmente positivo M2 EP (MIT3), ELISA fortemente positivo M2 EP (MIT3) ed ELISA Negativo prediluiti e dei sieri diluiti nei rispettivi pozzetti. Coprire i pozzetti ed incubare per 30 minuti a temperatura ambiente su una superficie piana. Il tempo di incubazione inizia dopo l aggiunta dell ultimo campione. 3. Lavaggio: Aspirare completamente il contenuto di ciascun pozzetto. Distribuire µL di soluzione di lavaggio HRP diluita in tutti i pozzetti e quindi aspirarla. Ripetere questa operazione per altre due volte, per un totale di tre lavaggi. Dopo l ultimo lavaggio capovolgere la piastra e scuoterla fermamente su tovaglioli di carta assorbente per rimuovere eventuali residui di liquido. E importante vuotare completamente ciascun pozzetto dopo ciascun lavaggio. Per l aspirazione mantenere la stessa sequenza usata per l aggiunta dei campioni. 4. Distribuire 100μL di Coniugato HRP IgG in ciascun pozzetto. Il coniugato dovrebbe essere prelevato dal flacone mediante tecniche sterili. Prelevare dal flacone solo la quantità di coniugato necessaria per l esecuzione del test. PER EVITARE POSSIBILI CONTAMINAZIONI MICROBICHE E/O CHIMICHE, NON RIMETTERE MAI IL CONIUGATO INUTILIZZATO NEL FLACONE. Incubare i pozzetti per 30 minuti come descritto al punto Lavaggio: Ripetere la procedura descritta al punto Distribuire 100µL di Cromogeno TMB in ciascun pozzetto ed incubare al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. 7. Distribuire 100µL di Soluzione di arresto HRP in ogni pozzetto. Per l aggiunta della Soluzione di 3

4 arresto HRP mantenere la stessa sequenza e gli stessi tempi utilizzati per l aggiunta del Cromogeno TMB. Agitare gentilmente la piastra con le dita per mescolare completamente i reagenti nei pozzetti. 8. Leggere l assorbanza (OD) di ciascun pozzetto a 450nm entro 1 ora dall aggiunta della soluzione di arresto. Se si preferisce una lettura a doppia lunghezza d onda, si può usare la lunghezza d onda di 620nm come riferimento. Controllo di qualità 1. I Controlli ELISA debolmente positivo M2 EP (MIT3), ELISA fortemente positivo M2 EP (MIT3) ed ELISA Negativo devono essere inclusi ogni volta che si esegue il test per assicurare che tutti i reagenti ed il test funzionino in modo corretto. 2. Si deve notare che, poichè i Controlli ELISA debolmente positivo M2 EP (MIT3), ELISA fortemente positivo M2 EP (MIT3) ed ELISA Negativo sono prediluiti, essi non rappresentano un controllo procedurale per le tecniche di diluizione utilizzate per i campioni. 3. Ulteriori controlli possono essere inclusi in base alle indicazioni o alle richieste delle vigenti regolamentazioni o delle organizzazioni di accreditamento. Ulteriori sieri di controllo possono essere preparati raccogliendo un pool dei sieri umani, aliquotandolo e conservandolo a < -20 C. 4. Perchè i risultati del test siano considerati validi, tutti i seguenti criteri devono essere soddisfatti. Se anche uno solo non rientra nei valori specificati, i risultati non dovrebbero essere considerati validi ed il test dovrebbe essere ripetuto. a. L assorbanza del Controllo ELISA fortemente positivo M2 EP (MIT3) prediluito deve essere maggiore di quella del Controllo ELISA debolmente positivo M2 EP (MIT3) prediluito che a sua volta deve essere maggiore di quella del Controllo ELISA Negativo prediluito. b. Il Controllo ELISA fortemente positivo M2 EP (MIT3) prediluito deve avere un assorbanza maggiore di 1,0 mentre l assorbanza del Controllo ELISA Negativo prediluito non deve essere maggiore di 0,2. c. L assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo M2 EP (MIT3) deve essere maggiore di due volte rispetto a quella del Controllo ELISA Negativo oppure maggiore di 0,25. d. Il Controllo ELISA Negativo e quello ELISA fortemente positivo M2 EP (MIT3) servono per controllare un eventuale malfunzionamento dei reagenti. Il Controllo ELISA fortemente positivo M2 EP (MIT3) non assicura la precisione in corrispondenza del valore soglia del test. e. L utente del test dovrebbe fare riferimento al Documento C24-A2 dell NCCLS per ulteriori informazioni su appropriate tecniche di Controllo di Qualità. 21 Calcolo dei risultati Si deve determinare innanzitutto il valore medio di assorbanza per ciascun set di duplicati. La reattività di ciascun campione viene quindi calcolata dividendo il valore medio di assorbanza del campione per il valore medio di assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo M2 EP (MIT3) e moltiplicando il risultato per il numero di unità assegnate al Controllo ELISA debolmente positivo M2 EP (MIT3), che è stampato sull etichetta del flacone. Assorbanza campione Valore del campione = x Valore Controllo ELISA debolmente positivo M2 EP (MIT3) (unità) (unità) Assorbanza Controllo ELISA debolmente positivo M2 EP (MIT3) La reattività è collegata in modo non lineare alla quantità di anticorpi presente. Mentre gli aumenti e le diminuzioni delle concentrazioni degli anticorpi vengono evidenziate da un corrispondente aumento o diminuzione della reattività, il cambiamento non è proporzionale (ad es., un raddoppio della concentrazione di anticorpi non raddoppia necessariamente la reattività). Se si desidera una più accurata quantificazione del contenuto di anticorpi, si possono allestire e testare diluizioni seriate del campione. L ultima diluizione che risulta positiva nel test dovrebbe essere refertata come il titolo anticorpale del paziente. Interpretazione dei risultati Il metodo ELISA è molto sensibile alla procedura ed è in grado di individuare anche piccole differenze nella popolazione dei pazienti. I valori riportati qui di seguito sono solo valori suggeriti. Ciascun Laboratorio dovrebbe stabilire il proprio range di normalità basato sulla procedura da esso utilizzata, sui controlli, sull apparecchiatura e sulla popolazione di pazienti secondo le proprie metodiche standard. I campioni vengono interpretati come negativi, equivoci o positivi in base alla seguente tabella: Unità Negativo <20 Equivoco 20,1-24,9 Positivo Un risultato positivo indica la presenza di anticorpi diretti contro Mitocondrio M2 e suggerisce la possibilità della malattia cirrosi biliare primaria. 2. Un risultato negativo indica l assenza di anticorpi diretti contro Mitocondrio M2 oppure la loro presenza a livelli inferiori al limite di sensibilità del metodo. 3. Sul referto si dovrebbe riportare la seguente frase: I seguenti risultati sono stati ottenuti mediante il test QUANTA Lite TM M2 EP (MIT3) ELISA della INOVA. I valori M2 EP (MIT3) ottenuti con test prodotti da altre Ditte possono non essere utilizzabili in modo intercambiabile. Il livello di IgG determinato con questo metodo non può essere correlato ad un titolo endpoint. 4

5 Limitazioni del test 1. La presenza nel campione di complessi immuni o di altri aggregati di immunoglobuline può causare un aumento del livello di reazioni aspecifiche con conseguenti risultati falsi positivi con questo test. 2. Non tutti i pazienti affetti da cirrosi biliare primaria risultano positivi alla ricerca di anticorpi antimitocondrio. 3. I risultati di questo test devono essere valutati dal medico curante alla luce del quadro clinico del paziente e del risultato degli altri test sierologici. 4. Le prestazioni caratteristiche del test non sono state valutate per campioni diversi dal siero. Valori attesi Si stima che la prevalenza della PBC sia compresa tra 2 casi su in Giappone e Australia e 40 casi su negli Stati Uniti. 3,6 Anche se gli anticorpi anti-mitocondriali in genere si ritiene siano presenti nel 90-95% dei pazienti PBC, la frequenza degli anticorpi individuati dipende dal gruppo studiato e la sensibilità potrebbe essere del 72%. 11 La specificità degli AMA mediante test IFA per la PBC oscilla fra il 95 ed il 97%. 11 Range normale Anticorpi anti-m2 (MIT3) in soggetti sani asintomatici Un pannello di 520 soggetti sani asintomatici è stato analizzato per gli anticorpi anti-m2 EP (MIT3) con il test QUANTA Lite TM M2 EP (MIT3) ELISA. L età ed il sesso erano disponibili per 299 campioni. Le età oscillavano fra anni ed erano inclusi 150 maschi e 149 femmine. Il valore medio per questa popolazione era di 7,6 unità, il valore della mediana era di 6,0 unità. La specificità del test era di 98,5% (512/520) per i soggetti normali. Due campioni reattivi hanno evidenziato chiari modelli AMA al test IFA. Caratteristiche specifiche delle prestazioni La frequenza degli anticorpi anti-m2 (MIT3) rilevati con il test QUANTA Lite TM M2 EP (MIT3) ELISA su un totale di 980 campioni definiti come PBC (978) o epatite autoimmunitaria/pbc (2) assemblati da varie coorti cliniche viene presentata nella Tabella 1. Sono stati esclusi i campioni con AIH, PBC AMA negativa nota o pazienti con malattia sospetta ma non confermata. La sensibilità globale del test era dell 87,3% (856/980). La specificità del test era dell 98,7% (590/598). Il valore predittivo positivo era del 99,1% ed il valore predittivo negativo era dell 82,6%. Il valore medio e la mediana di tutti i campioni non-pbc o PBC/AH era rispettivamente di 7,5 e 5,9 unità. Tabella 1: Sensibilità del test QUANTA Lite TM M2 EP (MIT3) ELISA N=1578 QUANTA Lite TM M2 EP (MIT3) ELISA Gruppo di pazienti n= pos equiv neg PBC (967) or PBC/AIH (13) controlli sani (520); Colangite sclerosante primaria-psc (47), altri controlli di malattia (31) Sensibilità: 87,3% (856/980); 95% Intervallo di confidenza (CI): 85,1% to 89,4% Specificità: 98,7% (590/598); 95% CI: 97,4% to 99,4% Reazioni crociate Sieri da 155 pazienti affetti da malattia epatica non-pbc (70 AIH, 46 PSC, 8 AIH/PSC) e da malattia autoimmunitaria o infettiva (3 LKM-1, 2 SLA, 3 GPA, 3 cromatina, 3 ASCA, 2 Sm, 2 RNP, 2 SS-A, 2 SS-B, 2 Scl-70, 2 Jo-1, 1 SLE, 2 HCV, 2 malattie epatiche non-pbc sospette) sono stati analizzati con il kit QUANTA Lite TM M2 EP (MIT3) ELISA per valutare la specificità del test. Nessuno dei sieri della malattia autoimmunitaria o infettiva è stato interpretato come positivo da QUANTA Lite TM M2 EP (MIT3) ELISA. Cinque campioni di AIH sono risultati positivi, ma questi potrebbero presentare un sindrome di AIH/PBC in evoluzione o non diagnosticata. Tutti i campioni AIH o AIH/PSC sono stati esclusi dal calcolo della specificità. Precisione e riproducibilità Le prestazioni intra-test sono state valutate analizzando 6 campioni per un totale di 6 volte ciascuno. Tabella 2: Prestazioni intra-test del ELISA QUANTA Lite TM M2 EP (MIT3) A B C D E F Unità medie 123,8 7,3 55,4 11,8 168,2 8,1 Deviazione standard 3,46 0,95 3,14 0,96 2,55 0,78 Coefficiente di variazione % 2,8 13,0 5,7 8,1 1,5 9,7 Le prestazioni fra i saggi sono state valutate esaminando in doppio 5 campioni, il controllo positivo alto (HPC) ed il controllo negativo (NC) del kit due volte al giorno (una al mattino ed una alla sera) per 3 giorni Tabella3: Prestazioni inter-test del ELISA QUANTA Lite TM M2 EP (MIT3) HPC NC A B C D E Unità medie 112,7 2,2 110,3 7,8 54,4 11,6 160,3 Deviazione standard 2,98 0,16 2,56 1,27 1,57 0,61 4,30 Coefficiente di variazione % 2,6 7,4 2,3 16,2 2,9 5,3 2,7 5

6 Bibliografia 1. Kaplan, M. M. Primary biliary cirrhosis. N Engl J Med 335, (1996). 2. Heathcote, E. J. Management of primary biliary cirrhosis. The American Association for the Study of Liver Diseases practice guidelines. Hepatology 31, (2000). 3. Feld, J. J. & Heathcote, E. J. Epidemiology of autoimmune liver disease. J Gastroenterol Hepatol 18, (2003). 4. Talwalkar, J. A. & Lindor, K. D. Primary biliary cirrhosis. Lancet 362, (2003). 5. Jones, D. E., Watt, F. E., Metcalf, J. V., Bassendine, M. F. & James, O. F. Familial primary biliary cirrhosis reassessed: a geographically-based population study. J Hepatol 30, (1999). 6. Kim, W. R. et al. Epidemiology and natural history of primary biliary cirrhosis in a US community. Gastroenterology 119, (2000). 7. Metcalf, J. V. et al. Natural history of early primary biliary cirrhosis. Lancet 348, (1996). 8. Kisand, K. E. et al. The follow-up of asymptomatic persons with antibodies to pyruvate dehydrogenase in adult population samples. J Gastroenterol 36, (2001). 9. Prince, M., Chetwynd, A., Newman, W., Metcalf, J. V. & James, O. F. Survival and symptom progression in a geographically based cohort of patients with primary biliary cirrhosis: follow-up for up to 28 years. Gastroenterology 123, (2002). 10. Walker, J. G., Doniach, D., Roitt, I. M. & Sherlock, S. Serological Tests in Diagnosis of Primary Biliary Cirrhosis. Lancet 39, (1965). 11. Muratori, P. et al. 'True' antimitochondrial antibody-negative primary biliary cirrhosis, low sensitivity of the routine assays, or both? Clin Exp Immunol 135, (2004). 12. Berg, P. A. & Klein, R. Mitochondrial antigens and autoantibodies: from anti-m1 to anti-m9. Klin Wochenschr 64, (1986). 13. Fussey, S. P., Guest, J. R., James, O. F., Bassendine, M. F. & Yeaman, S. J. Identification and analysis of the major M2 autoantigens in primary biliary cirrhosis. Proc Natl Acad Sci USA 85, (1988). 14. Vergani, D. & Bogdanos, D. P. Positive markers in AMA-negative PBC. Am J Gastroenterol 98, (2003). 15. Miyakawa, H. et al. Detection of antimitochondrial autoantibodies in immunofluorescent AMAnegative patients with primary biliary cirrhosis using recombinant autoantigens. Hepatology 34, (2001). 16. Moteki, S. et al. Use of a designer triple expression hybrid clone for three different lipoyl domain for the detection of antimitochondrial autoantibodies. Hepatology 24, (1996). 17. Fritzler, M. J. & Manns, M. P. Anti-mitochondrial autoantibodies. Clin Appl Immunol Rev 3, (2002). 18. Nishio, A., Keeffe, E. B. & Gershwin, M. E. Immunopathogenesis of primary biliary cirrhosis. Semin Liver Dis 22, (2002). 19. Leung, P. S. et al. Use of designer recombinant mitochondrial antigens in the diagnosis of primary biliary cirrhosis. Hepatology 15, (1992). 20. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, Fourth Edition, HHS Pub#(CDC) , (CDC/NIH, 1999). 21. Internal Quality Control: Principles and Definitions, Approved Guidline, NCCLS Doc C24-A2 (National Committee for Clinical Laboratory Standards, 1991). Fornitore: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Rappresentante Autorizzato: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service November 2005 Revision ITA0 6