QUANTA Lite TM ssdna ELISA Cantena singloa DNA ELISA Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata

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1 QUANTA Lite TM ssdna ELISA Cantena singloa DNA ELISA Per uso diagnostico In Vitro Complessità CLIA: elevata Finalità d uso QUANTA Lite TM ssdna è un test immunoenzimatico (ELISA) semi-quantitativo per la ricerca degli autoanticorpi anti-dna a catena singola (ssdna). Il kit QUANTA Lite TM ssdna ELISA della INOVA, se usato contemporaneamente con il kit QUANTA Lite TM dsdna della INOVA, consente la determinazione semiquantitativa degli autoanticorpi anti-ssdna nel siero umano per la diagnosi del lupus eritematoso sistemico (LES) e di alcune altre malattie reumatiche. Il risultato del test non è diagnostico ma rappresenta un parametro in un processo diagnostico multidisciplinare. Riassunto e Spiegazione del test Gli anticorpi anti-nucleo (ANA) vengono riscontrati in una grande varietà di malattie del tessuto connettivo e pertanto rappresentano un test di screening molto sensibile. 1 Gli anticorpi anti-dna a doppia elica (dsdna) si trovano quasi esclusivamente in pazienti con LES e perciò vengono considerati un marker della malattia. La presenza di anticorpi anti-dsdna è fortemente indicativa di LES, tuttavia, l assenza di tali anticorpi non consente sempre di eliminare il sospetto di LES. 2 Gli autoanticorpi anti-ssdna vengono ritrovati in numerose malattie reumatiche ed in vari tipi di altre malattie. 3,4 La maggior frequenza ed i titoli più elevati di autoanticorpi anti-ssdna vengono riscontrati in pazienti con LES. 4 Nei pazienti affetti da LES positivi per la presenza di autoanticorpi anti-ssdna, il titolo può essere usato per monitorare i cambiamenti nell attività della malattia e la risposta alla terapia farmacologica. 5,6 Sebbene gli autoanticorpi anti-ssdna non siano specifici del LES, essi possono essere l unico test sierologico positivo in alcuni pazienti con LES che non producono titoli significativi di anticorpi ANA. 7 Molti di questi pazienti con alti titoli di autoanticorpi anti-ssdna mostrano segni di malattia cutanea fotosensibile. Circa il 25% dei pazienti affetti da lupus discoide mostrano autoanticorpi anti-ssdna e sono a rischio di complicanze sistemiche. 3 Nei pazienti con forme severe di lupus discoide ed affetti da glomerulonefrite è stata dimostrata la presenza dei soli autoanticorpi anti-ssdna. 3 Tali studi indicano che la ricerca degli autoanticorpi anti-ssdna può essere un importante test per la diagnosi del lupus discoide oppure per la valutazione dei pazienti sospetti di avere una forma di LES negativa per ANA. 3 Gli anticorpi che reagiscono con ssdna denaturato termicamente sono in grado di reagire con le purine e le pirimidine come pure con lo scheletro zucchero-fosfato della molecola di DNA. 1,4 Da un punto di vista tecnico è ancora impossibile misurare con un singolo test i veri autoanticorpi anti-ssdna (utilizzando le basi puriniche e pirimidiniche come unico antigene). La tecnica ELISA utilizzata in questo test è oggettiva ed i risultati possono essere refertati in modo semi-quantitativo. La metodica ELISA consente di testare sia grandi che piccoli numeri di campioni in in un formato analogo a quello di altri esami per la diagnosi di malattie reumatiche quali dsdna, istone e anticorpi anti-nucleo estraibili (ENA). Principio della Metodica Un ssdna di timo di vitello altamente purificato e denaturato termicamente è adsorbito sulla parete dei pozzetti di una piastra microtiter di polistirene in condizioni adatte a conservare l antigene nel suo stato nativo. I controlli pre-diluiti ed i sieri diluiti dei pazienti vengono distribuiti nei pozzetti corrispondenti, consentendo agli anticorpi anti-ssdna eventualmente presenti di legarsi all antigene adsorbito. L eccesso di campione non legato viene allontanato mediante il lavaggio e successivamente si aggiunge a ciascun pozzetto un anticorpo anti-igg umane marcato con un enzima. Una seconda incubazione consente agli anticorpi anti-igg umane marcati con l enzima di legarsi agli anticorpi del paziente che si sono eventualmente legati alla parete dei pozzetti. Dopo ulteriore lavaggio per allontanare l eccesso di anticorpi anti-igg umane marcati con l enzima, l attività dell enzima rimasto viene misurata aggiungendo un substrato cromogenico e misurando l intensità del colore che si sviluppa. Il test può essere letto mediante uno spettrofotometro ed interpretato confrontando l intensità del colore che si sviluppa nei pozzetti dei campioni con quella dei pozzetti dei controlli. Reagenti 1. Piastra microtiter ELISA in polistirene adsorbita con antigene ssdna purificato (12-1 x 8 pozzetti), con supporto, in busta chiusa contenente materiale essicante 2. Controllo ELISA Negativo, 1 flacone di tampone contenente conservante e siero umano senza anticorpi umani anti-ssdna, prediluito, 1,2mL 3. Controllo ELISA fortemente positivo per ssdna, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi umani anti-ssdna, prediluito, 1,2mL 4. Controllo ELISA debolmente positivo per ssdna, 1 flacone di tampone contenente conservante ed anticorpi umani anti-ssdna, prediluito, 1,2mL 5. Diluente per campioni HRP, 1 flacone di colore rosa contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris, Tween 20, stabilizzatori delle proteine e conservante, 50mL 6. Soluzione di lavaggio HRP Concentrata, 1 flacone di soluzione concentrata 40x di colore rosso contenente soluzione fisiologica tamponata con Tris e Tween 20, 25mL. Vedi la Sezione Metodi per le istruzioni sulla diluizione. 1

2 7. Coniugato HRP IgG, (montone), anti-igg umane, 1 flacone di colore blu contenente tampone, stabilizzatori delle proteine e conservante, 10mL 8. Cromogeno TMB, 1 flacone contenente stabilizzatori, 10mL 9. Soluzione di arresto HRP, Acido solforico 0,344M, 1 flacone incolore, 10mL Avvertenze 1. ATTENZIONE: Questo prodotto contiene un composto chimico (cloramfenicolo allo 0,02%) nel diluente per i campioni, nei controlli e nel coniugato, noto allo Stato della California come causa di tumori. 2. Tutte le fonti umane di materiali usati nella preparazione dei controlli per questo prodotto sono state testate e sono risultate negative per la presenza di anticorpi anti-hiv, per HBsAg e per anticorpi anti- HCV mediante metodi approvati dall FDA. Tuttavia nessun test offre la certezza completa dell assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i Controlli ELISA fortemente positivo ssdna, ELISA debolmente positivo ssdna ed ELISA Negativo devono essere maneggiati come materiali potenzialmente infettivi La sodio azide è usata come conservante. La sodio azide è un veleno e può essere tossica se ingerita o assorbita attraverso la cute o gli occhi. La sodio azide può reagire con le tubature di piombo o rame formando azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lasciar scorrere grandi quantità di acqua, se si usa un lavandino per eliminare i reagenti, per prevenire la formazione di azidi. 4. Il Coniugato HRP contiene un composto chimico velenoso/corrosivo, che può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. 5. Il Cromogeno TMB contiene un irritante, che può essere dannoso se inalato, ingerito o assorbito attraverso la cute. Per prevenire lesioni, evitare l inalazione, l ingestione o il contatto con la cute e con gli occhi. 6. La Soluzione di arresto HRP è costituita da una soluzione di acido solforico diluito. Evitare l esposizione a basi, metalli o altri composti che possono reagire con gli acidi. L acido solforico è velenoso e corrosivo e può essere tossico se ingerito. Per prevenire possibili ustioni chimiche, evitare il contatto con la cute e con gli occhi. 7. Usare appropriati indumenti personali protettivi mentre si lavora con i reagenti forniti. 8. I reagenti eventualmente rovesciati devono essere rimossi immediatamente. Seguire tutte le normative vigenti in materia di eliminazione dei residui di natura chimica. Precauzioni 1. Questo prodotto è stato messo a punto per l uso diagnostico In Vitro. 2. La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel kit può causare risultati non attendibili. 3. Un lavaggio incompleto o non accurato e l insufficiente aspirazione del liquido dai pozzetti ELISA può causare una scarsa precisione e/o un elevato background. 4. L adattamento di questo test all uso con apparecchiature automatiche e altri dispositivi per trattamento dei campioni liquidi, in toto o in parte, può causare differenze nei risultati rispetto a quelli ottenuti mediante la procedura manuale. E responsabilità di ciascun Laboratorio confermare che le procedure automatizzate utilizzate diano risultati entro limiti di accettabilità. 5. Una serie di fattori influenza le prestazioni del test. Essi comprendono l iniziale temperatura dei reagenti, la temperatura dell ambiente, l accuratezza e la riproducibilità della tecnica di pipettamento, la scrupolosità delle operazioni di lavaggio e di aspirazione del liquido dai pozzetti delle piastre ELISA, il tipo di spettrofotometro usato per leggere i risultati e la lunghezza dei tempi di incubazione durante l esecuzione del test. Bisogna prestare molta attenzione alla costanza per ottenere risultati accurati e riproducibili. 6. Si raccomanda di attenersi scrupolosamente alle istruzioni fornite. 7. Una chiusura incompleta della busta richiudibile contenente le strisce di pozzetti ed il materiale essicante causa la degradazione dell antigene ed una scarsa precisione nei risultati. 8. Valori di assorbanza inaccettabilmente bassi possono essere osservati dopo aver usato due o più volte lo stesso flacone di coniugato HRP per un certo periodo di tempo. E importante seguire attentamente le istruzioni fornite per il trattamento del coniugato HRP per evitare tale inconveniente. 9. Un eventuale contaminazione chimica del coniugato HRP può essere conseguenza di una impropria pulizia o risciacquo di apparecchi o di strumenti. Residui di comuni reagenti chimici di laboratorio quali formalina, candeggina, etanolo o detergenti causano la degradazione nel tempo del coniugato HRP. Risciacquare molto accuratamente tutti gli apparecchi e gli strumenti dopo l uso di detergenti chimici. Condizioni di conservazione 1. Conservare tutti i reagenti del kit a 2-8 C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza se conservati e trattati seguendo le istruzioni fornite. 2. Le strisce di pozzetti non utilizzate devono essere rimesse immediatamente nella busta richiudibile contenente il materiale essicante e conservate nella busta ben chiusa a 2-8 C. 3. Il tampone di lavaggio diluito è stabile per 1 settimana a 2-8 C. 2

3 Raccolta dei campioni Questa tecnica deve essere usata con un campione di siero. L aggiunta al campione di sodio azide o di altri conservanti può influenzare in modo negativo i risultati. Campioni con segni di contaminazione microbica, trattati con calore o contenenti particelle visibili non dovrebbero essere usati. Si dovrebbe evitare anche l uso di sieri fortemente emolizzati o lipemici. Dopo il prelievo, il siero dovrebbe essere separato dal coagulo. Il Documento H18-A2 dell NCCLS raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) Conservare i campioni a temperatura ambiente per non più di 8 ore. 2) Se il test non può essere eseguito entro 8 ore, conservare i campioni in frigorifero a 2-8 C. 3) Se il test non può essere eseguito entro 48 ore, oppure per la spedizione dei campioni, congelare a -20 C. I campioni congelati devono essere mescolati bene dopo lo scongelamento e prima di essere testati. Procedura Materiali forniti 1 Piastra microtiter ELISA ssdna (12-1 x 8 pozzetti), con supporto 1 1,2mL Controllo ELISA Negativo prediluito 1 1,2mL Controllo ELISA debolmente positivo ssdna prediluito 1 1,2mL Controllo ELISA fortemente positivo ssdna prediluito 1 50mL Diluente per campioni HRP 1 25mL Soluzione di lavaggio HRP concentrata, 40x concentrata 1 10mL Coniugato HRP IgG, (montone), anti-igg umane 1 10mL Cromogeno TMB 1 10mL Soluzione di arresto HRP, 0,344M Acido solforico Materiali richiesti ma non forniti Micropipette in grado di erogare volume di 5, 100, e 500µL Puntali monouso per micropipette Provette per la diluizione dei sieri, volume 4mL Acqua distillata o deionizzata Beuta da 1L per diluite la Soluzione di lavaggio HRP concentrata Lettore per piastre ELISA in grado di leggere a 450nm (e 620nm per le letture a doppia lunghezza d onda) Metodica Prima di incominciare 1. Portare tutti i reagenti ed i campioni a temperatura ambiente (20-26 o C) e mescolarli bene. 2. Diluire la Soluzione di lavaggio HRP concentrata 1:40 aggiungendo il contenuto del flacone fornito con il kit a 975mL di acqua distillata o deionizzata. Se non si usa l intera piastra in una sola volta, si può preparare una minore quantità di soluzione di lavaggio aggiungendo 2,0mL di concentrato a 78mL di acqua distillata o deionizzata ogni 16 pozzetti utilizzati. La soluzione di lavaggio diluita è stabile per 1 settimana a 2-8 o C. 3. Preparare una diluizione 1:101 di ciascun campione da testare aggiungendo 5µL di siero a 500µL di Diluente per campioni HRP. I campioni diluiti devono essere testati entro 8 ore dalla preparazione. NON DILUIRE i Controlli ELISA debolmente positivo ssdna, ELISA fortemente positivo ssdna ed ELISA Negativo. 4. La determinazione della presenza o dell assenza di ssdna usando unità arbitrarie richiede due pozzetti per ciascuno dei tre controlli ed uno o due pozzetti per ciascun campione clinico. Si raccomanda di testare i campioni in duplicato. Esecuzione del test 1. TUTTI I REAGENTI DEVONO ESSERE PORTATI A TEMPERATURA AMBIENTE (20-26 C) PRIMA DI INIZIARE IL TEST. Posizionare i pozzetti/le strisce necessarie nel supporto. Rimettere immediatamente la strisce inutilizzate nella busta contenente il materiale essicante e sigillarla bene per minimizzare l esposizione all umidità ambientale. 2. Distribuire 100µL dei Controlli ELISA debolmente positivo ssdna, ELISA fortemente positivo ssdna ed ELISA Negativo prediluiti e dei sieri diluiti nei rispettivi pozzetti. Coprire i pozzetti ed incubare per 30 minuti a temperatura ambiente su una superficie piana. Il tempo di incubazione inizia dopo l aggiunta dell ultimo campione. 3. Lavaggio: Aspirare completamente il contenuto di ciascun pozzetto. Distribuire µL di soluzione di lavaggio HRP diluita in tutti i pozzetti e quindi aspirarla. Ripetere questa operazione per altre due volte, per un totale di tre lavaggi. Dopo l ultimo lavaggio capovolgere la piastra e scuoterla fermamente su tovaglioli di carta assorbente per rimuovere eventuali residui di liquido. E importante vuotare completamente ciascun pozzetto dopo ciascun lavaggio. Per l aspirazione mantenere la stessa sequenza usata per l aggiunta dei campioni. 4. Distribuire 100μL di Coniugato HRP IgG in ciascun pozzetto. Il coniugato dovrebbe essere prelevato dal flacone mediante tecniche sterili. Prelevare dal flacone solo la quantità di coniugato necessaria per l esecuzione del test. PER EVITARE POSSIBILI CONTAMINAZIONI MICROBICHE E/O CHIMICHE, NON RIMETTERE MAI IL CONIUGATO INUTILIZZATO NEL FLACONE. Incubare i pozzetti per 30 minuti come descritto al punto 2. 3

4 5. Lavaggio: Ripetere la procedura descritta al punto Distribuire 100µL di Cromogeno TMB in ciascun pozzetto ed incubare al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. 7. Distribuire 100µL di Soluzione di arresto HRP in ogni pozzetto. Per l aggiunta della Soluzione di arresto HRP mantenere la stessa sequenza e gli stessi tempi utilizzati per l aggiunta del Cromogeno TMB. Agitare gentilmente la piastra con le dita per mescolare completamente i reagenti nei pozzetti. 8. Leggere l assorbanza (OD) di ciascun pozzetto a 450nm entro 1 ora dall aggiunta della soluzione di arresto. Se si preferisce una lettura a doppia lunghezza d onda, si può usare la lunghezza d onda di 620nm come riferimento. Controllo di qualità 1. I Controlli ELISA debolmente positivo ssdna, ELISA fortemente positivo ssdna ed ELISA Negativo devono essere inclusi ogni volta che si esegue il test per assicurare che tutti i reagenti ed il test funzionino in modo corretto. 2. Si deve notare che, poichè i Controlli ELISA debolmente positivo ssdna, ELISA fortemente positivo ssdna ed ELISA Negativo sono prediluiti, essi non rappresentano un controllo procedurale per le tecniche di diluizione utilizzate per i campioni. 3. Ulteriori controlli possono essere inclusi in base alle indicazioni o alle richieste delle vigenti regolamentazioni o delle organizzazioni di accreditamento. Ulteriori sieri di controllo possono essere preparati raccogliendo un pool dei sieri umani, aliquotandolo e conservandolo a < -20 C. 4. Perchè i risultati del test siano considerati validi, tutti i seguenti criteri devono essere soddisfatti. Se anche uno solo non rientra nei valori specificati, i risultati non dovrebbero essere considerati validi ed il test dovrebbe essere ripetuto. a. L assorbanza del Controllo ELISA fortemente positivo ssdna prediluito deve essere maggiore di quella del Controllo ELISA debolmente positivo ssdna prediluito che a sua volta deve essere maggiore di quella del Controllo ELISA Negativo prediluito. b. Il Controllo ELISA fortemente positivo ssdna prediluito deve avere un assorbanza maggiore di 1,0 mentre l assorbanza del Controllo ELISA Negativo prediluito non deve essere maggiore di 0,2. c. L assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo ssdna deve essere maggiore di due volte rispetto a quella del Controllo ELISA Negativo oppure maggiore di 0,25. d. Il Controllo ELISA Negativo e quello ELISA fortemente positivo ssdna servono per controllare un eventuale malfunzionamento dei reagenti. Il Controllo ELISA fortemente positivo ssdna non assicura la precisione in corrispondenza del valore soglia del test. e. L utente del test dovrebbe fare riferimento al Documento C24-A dell NCCLS per ulteriori informazioni su appropriate tecniche di Controllo di Qualità. Calcolo dei risultati Si deve determinare innanzitutto il valore medio di assorbanza per ciascun set di duplicati. La reattività di ciascun campione viene quindi calcolata dividendo il valore medio di assorbanza del campione per il valore medio di assorbanza del Controllo ELISA debolmente positivo ssdna e moltiplicando il risultato per il numero di unità assegnate al Controllo ELISA debolmente positivo ssdna, che è stampato sull etichetta del flacone. Assorbanza campione Valore del campione = x Valore Controllo ELISA debolmente positivo ssdna (unità) Assorbanza Controllo ELISA debolmente positivo ssdna (unità) La reattività è collegata in modo non lineare alla quantità di anticorpi presente. Mentre gli aumenti e le diminuzioni delle concentrazioni degli anticorpi vengono evidenziate da un corrispondente aumento o diminuzione della reattività, il cambiamento non è proporzionale (ad es., un raddoppio della concentrazione di anticorpi non raddoppia necessariamente la reattività). Se si desidera una più accurata quantificazione del contenuto di anticorpi, si possono allestire e testare diluizioni seriate del campione. L ultima diluizione che risulta positiva nel test dovrebbe essere refertata come il titolo anticorpale del paziente. Interpretazione dei risultati Il metodo ELISA è molto sensibile alla procedura ed è in grado di individuare anche piccole differenze nella popolazione dei pazienti. I valori riportati qui di seguito sono solo valori suggeriti. Ciascun Laboratorio dovrebbe stabilire il proprio range di normalità basato sulla procedura da esso utilizzata, sui controlli, sull apparecchiatura e sulla popolazione di pazienti secondo le proprie metodiche standard. Le seguenti informazioni servono come esempio per l interpretazione dei risultati. Poichè gli autoanticorpi anti-dna a singola elica (ssdna) ed alcuni autoanticorpi anti-dna a doppia elica (dsdna) possono reagire con l antigene ssdna di questo kit, i campioni dovrebbero essere testati anche per la presenza di autoanticorpi anti-dsdna. Questi risultati, espressi in unità OMS, dovrebbere essere presi in considerazione quando si valutano i livelli di autoanticorpi anti-ssdna. Analizzando contemporaneamente i risultati ottenuti con il test QUANTA Lite TM dsdna ELISA della INOVA e quelli ottenuti mediante il test QUANTA Lite TM ssdna ELISA della INOVA il medico curante può trarre delle conclusioni sulla presenza di autoanticorpi anti-ssdna calcolando il rapporto (ssdna/dsdna). Un risultato <0,5 indica l assenza di autoanticorpi anti-ssdna. Un rapporto >0,5 indica la presenza di autoanticorpi anti-ssdna. 4

5 NOTA: Il campione dovrebbe essere considerato positivo solo quando il risultato del test per la ricerca di autoanticorpi anti-ssdna è positivo ed il rapporto delle unità anti-ssdna rispetto alle unità anti-dsdna è >0,5. Esempio 1: Esempio 2: Esempio 3: Test 1: concentrazione di autoanticorpi anti-dsdna: 120 Unità OMS/mL Test 2: concentrazione di autoanticorpi anti-ssdna: 160 Unità/mL Rapporto di autoanticorpi anti-ssdna (ssdna/dsdna): 160/120 = 1,33 (+) Interpretazione: Il campione del paziente è positivo per la presenza di autoanticorpi antissdna Test 1: concentrazione di autoanticorpi anti-dsdna: 270 Unità OMS/mL Test 2: concentrazione di autoanticorpi anti-ssdna: 130 Unità/mL Rapporto di autoanticorpi anti-ssdna (ssdna/dsdna): 130/270 = 0,48 (-) Interpretazione: Il campione del paziente è negativo per la presenza di autoanticorpi antissdna Test 1: concentrazione di autoanticorpi anti-dsdna: 80 Unità OMS/mL Test 2: concentrazione di autoanticorpi anti-ssdna: 80 Unità/mL Rapporto di autoanticorpi anti-ssdna (ssdna/dsdna): 80/80 = 1,0 (+) Interpretazione: Il campione del paziente è positivo per la presenza di autoanticorpi antissdna Se il risultato del test per la ricerca degli autoanticorpi anti-ssdna risulta positivo, allora le unità di autoanticorpi anti-ssdna possono essere confrontate con le seguenti categorie cliniche. <68,6 Unità/mL Negativo per la presenza di autoanticorpi anti-ssdna 68,6-229 Unità/mL Moderatamente positivo per la presenza di autoanticorpi anti-ssdna >229 Unità/mL Fortemente positivo per la presenza di autoanticorpi anti-ssdna Può essere difficile determinare l attività anti-ssdna in campioni che risultano fortemente positivi (con assorbanza >2,0 OD) sia per ssdna sia per dsdna. Se il campione è fortemente positivo il rapporto può essere ingannevole poichè il test ELISA è saturato dagli anticorpi del paziente. Si raccomanda di ritestare i campioni fortemente positivi sia per ssdna sia per dsdna ad un ulteriore diluizione di 1:4 e 1:20 (cioè 1:404 e 1:2020) nel Diluente per campioni HRP per determinare se gli anticorpi anti-ssdna hanno un livello superiore a quello degli anticorpi anti-dsdna. Le operazioni di calcolo dei valori di unità devono essere ripetute sulle successive diluizioni del campione paziente. Limitazioni del test 1. Poichè gli anticorpi della classe IgG sono considerati quelli più significativi dal punto di vista clinico, questo test usa un coniugato specifico anti-igg. Gli anticorpi anti-ssdna della classe IgM non rilevati da questo test possono competere con le IgG per i siti di legame disponibili. Se si sospetta la presenza di interferenze da parte di IgM, si consiglia di ripetere il test diluendo ulteriormente il campione usando il Diluente per campioni HRP. Un netto aumento del valore per il campione indica la presenza di IgM che competono con le IgG. Questo nuovo valore fornisce una determinazione più accurata della quantità di IgG anti-ssdna nel campione in esame. 2. La presenza nel campione di complessi immuni o di altri aggregati di immunoglobuline può causare un aumento del livello di reazioni aspecifiche con conseguenti risultati falsi positivi con questo test. 3. Poichè sia gli autoanticorpi anti-dna a singola elica (ssdna) sia alcuni autoanticorpi antidna a doppia elica (dsdna) possono reagire con l antigene ssdna di questo kit, i campioni dovrebbero essere testati anche per la presenza di anticorpi anti-dsdna, e questi risultati devono essere tenuti in considerazione nella valutazione dei levelli di anticorpi anti-ssdna. 4. Una serie di fattori può influenzare le prestazioni del test. Questi comprendono l accuratezza e la riproducibilità della tecnica di pipettamento, lo spettrofotometro utilizzato per misurare i risultati e la corretta osservanza dei tempi di incubazione durante l esecuzione del test. Si deve prestare grande attenzione alla tecnica per ottenere risultati accurati e riproducibili. 5. Il kit QUANTA Lite TM ssdna ELISA non è un test definitivo per la presenza di anticorpi anti-ssdna. Esso deve essere utilizzato contemporaneamente al kit QUANTA Lite TM dsdna ELISA della INOVA Diagnostics, Inc. per rilevare la presenza di anticorpi anti-ssdna. Non utilizzare un test per anticorpi anti-dsdna prodotto da altre Ditte perchè la calibrazione dei test ssdna ELISA e del test dsdna y ELISA della INOVA è stata eseguita in parallelo. 6. I risultati di questo test devono essere valutati dal medico curante alla luce del quadro clinico del paziente e del risultato degli altri test sierologici. 7. Le prestazioni caratteristiche del test non sono state valutate per campioni diversi dal siero. Valori attesi La capacità del test QUANTA Lite TM ssdna ELISA di individuare anticorpi anti-ssdna è stata valutata paragonandola a quella di un altro test ELISA disponibile in commercio. I risultati del test ELISA sono stati interpretati in base alle istruzioni fornite dalle Ditte produttrici. Range normale Un campione casuale di 117 sieri è stato selezionato e testato mediante il kit QUANTA Lite TM ssdna ELISA. Di questi campioni, 7 avevano un valore di unità 69 (da considerare come positivo in questo test ELISA). Cinque di questi 7 campioni risultavano positivi anche con il metodo commerciale di riferimento per anticorpi anti-ssdna e pertanto sono stati eliminati dalla popolazione normale. Il valore medio di unità della popolazione testata era pari a 27 con una deviazione standard di 21. Il range di valori ottenuti con i campioni 5

6 studiati andava da 12 a 186. Questo studio indica che il campione normale medio è 2,0 deviazioni standard al di sotto del valore soglia. Sensibilità e specificità relative Un campione casuale di 32 campioni positivi per ANA è stato testato con il test QUANTA Lite TM ssdna e con un altro kit disponibile in commercio (Riferimento). Diciotto campioni sono risultati positivi e 12 negativi con entrambi i metodi. Due campioni sono risultati positivi con il metodo di riferimento ma negativi con INOVA. Questi due campioni sono risultati negativi con un altro kit commerciale. I risultati sono riassunti nella seguente tabella. INOVA Sensibilità relativa 90% Riferimento Specificità relativa 100% Efficienza relativa 94% Per valutare ulteriormente la fase solida del test ssdna, una serie di controlli con elevati titoli di autoanticorpi monospecifici è stata testata con il kit QUANTA Lite TM ssdna. Questi controlli comprendevano i controlli ad alto titolo dei seguenti kit QUANTA Lite TM ELISA della INOVA: Sm, RNP, SS-A, SS-B, Scl-70, Jo-1, Thyroid Microsomal e Thyroglobulin, Histone e Mitochondria M2. Tutti i controlli summenzionati hanno dato risultati negativi con il test ssdna. Positività per anticorpi anti-ssdna in varie malattie del tessuto connettivo Numero di pazienti % Positivi LES Sindrome di Sjogrens Scleroderma Polimiositis 6 17 Lupus indotto da farmaci Artrite Reumatoide 11 45* *2 dei 5 campioni positivi avevano valori borderline (69 e 99 unità). Venticinque dei pazienti con LES erano positivi per anticorpi anti-ssdna. Sei di questi pazienti affetti da LES e positivi per anticorpi anti-ssdna risultavano dubbi con un test ELISA molto sensibile per anticorpi anti-dna a doppia elica (dsdna) (INOVA). Tredici dei 21 pazienti con Sindrome di Sjogren risultavano positivi per anticorpi anti-ssdna. Tutti questi 21 pazienti erano positivi per SS-A, SS-B o sia per SS-A e SS-B mediante metodiche ELISA (INOVA). Tre di questi pazienti con Sindrome di Sjogren risultavano positivi per anticorpi anti-ssdna ma erano completamente negativi con un un test ELISA molto sensibile per anticorpi anti-dsdna (INOVA). Dodici dei 15 pazienti affetti da scleroderma e positivi per Scl-70 erano positivi per anticorpi antissdna e solo 1 dei 6 pazienti con polimiosite era positivo. Tutti i pazienti con polimiosite risultavano positivi per la presenza di autoanticorpi anti-jo-1 con un test ELISA (INOVA). Il paziente con polimiosite che risultava positivo per anticorpi anti-ssdna (112U) era completamente negativo per la presenza di anticorpi anti-dsdna mediante una tecnica ELISA (INOVA). Precisione e riproducibilità La precisione e la riproducibilità del metodo sono state valutate testando sei repliche di ciascun campione negativo, moderatamente positivo e fortemente positivo in quattro esperimenti diversi. Il valore medio di unità del campione fortemente positivo era pari a 814, quello del campione moderatamente positivo era 300 e quello del campione negativo era 72. La deviazione standard ed il coefficiente di variazione per ciascun campione sono riportati nella seguente tabella. Negativo Fortemente positivo Moderatamente positivo SD CV SD CV SD CV Generale 4,7 6,6% 36 4,5% 8,0 2,7% Intra-test 4,7 6,5% 35 4,3% 6,8 2,7% Inter-test 4,6 6,3% 24 3,0% 8,7 2,9% 6

7 Bibliografía Referencias Références Referências Βιβλιογραφία 1. Tan EM: Autoantibodies to nuclear antigens(ana): Their immunobiology and medicine. Advances in Immunology 33: , Casalo SP, Friou GJ and Myers LL: Significance of antibodies to DNA is systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 7: , Provost TT, Herrera-Esparza R and Diaz LA: Nucleoprotein autoantibodies in lupus erythematosus. J. Invest. Dermatol. 85: , Koffler D, et al: Occurence of single-stranded DNA in serum of patients with systemic lupus erythematosus and other diseases. J. Clin. Invest. 52: , Land A: Evaluation of the simultaneous estimation of antidsdna and antissdna antibodies for clinical purposes. Clin. Exp. Immunol. 31: , Gripenberg M, et al: Assessment of class-specific antibodies against denatured DNA in patients with systemic lupus erythematosus. J Clin Immunol. 5: 314, Maddison PJ, Provost TT and Reichlin M: Serological findings in patients with "ANA" negative systemic lupus erythematosus. Medicine(Baltimore) 60: 87-94, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 2007, Fifth Edition Fornitore: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Rappresentante Autorizzato: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: Technical Service ITA June 2009 Revision 11 7