Complessità CLIA: elevata

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1 NOVA Lite HEp-2 ANA Kits/Substrate Slides Per uso diagnostico In Vitro Codice Prodotto: , , , Complessità CLIA: elevata Finalità d uso NOVA Lite HEp-2 è un test immunofluorescenza indiretta per lo screening e la determinazione semiquantitativa degli anticorpi antinucleo (ANA) nel siero umano. La presenza di anticorpi antinucleo, assieme ad altri test sierologici ed ai riscontri clinici, più essere di ausilio nella diagnosi di lupus eritematoso sistemico (LES) ed altre malattie del tessuto connettivo o reumatiche. Riassunto e Spiegazione del test La definizione anticorpi antinucleo descrive una varietà di autoanticorpi che reagiscono con costituenti dei nuclei delle cellule come il DNA, l RNA e varie proteine e ribonucleoproteine. 1 Questi autoanticorpi si riscontrano con frequenza elevata in pazienti affetti da malattie reumatiche o del tessuto connettivo, specialmente il lupus eritematoso sistemico. Praticamente tutti i pazienti affetti da LES sono positivi agli ANA. Questa sensibilità diagnostica ha portato ad includere la determinazione degli ANA nei criteri revisionati per la classificazione del lupus eritematoso sistemico del 1982 compilata da un sottocomitato dell American College of Rheumatology (collegio americano di reumatologia). 2 L analisi degli ANA è un è un test di screening eccellente per il LES (un risultato negativo in pratica esclude il LES in fase attiva 3 ) ma non è assolutamente un esame specifico. Pazienti con altre malattie del tessuto connettivo come l artrite reumatoide, la sclerodermia e la dermatomiosite risultano spesso positivi, e titoli bassi di ANA possono essere osservati in altre malattie ed anche nella popolazione normale. Si possono riscontrare risultati positivi agli ANA in seguito ad ustioni gravi o ad infezioni virali, e si sono riscontrati anche in individui sani, soprattutto fra gli anziani. Per via di questa mancanza di specificità si raccomanda di titolare fino agli estremi tutti i campioni ANA positivi e di eseguire indagini più accurate per ricercare autoanticorpi diretti verso il DNA a doppia elica (dsdna) e verso l antigene estraibile nucleare (ENA). Il metodo di riferimento per l analisi degli ANA è l immunofluorescenza indiretta. I substrati comuni sono sezioni sottili di organi di roditori o vari tipi di linee cellulari. Si è concordi nell affermare che substrati di linee cellulari sono preferibili alle sezioni di organi per via del fatto che queste cellule a divisione rapida presentano livelli più elevati di certi antigeni clinicamente rilevanti, incluso il centromero, la SS-A(Ro), la Scl-70 e la PCNA/Ciclina. Oltre al tipo di substrato esistono tre altri fattori che sono critici per la performance del test ANA: 1) il fissativo utilizzato per preparare il vetrino, 2) il rapporto fluoresceina/proteina (F/P) e 3) la sottoclasse di specificità immunoglobulinica del coniugato. È rinomato infatti che alcuni fissativi o loro combinazioni distruggono certi antigeni nucleari e se ne dovrebbe quindi evitare l utilizzo. La sensibilità e la colorazione di fondo nonspecifica di un coniugato è determinata dal rapporto F/P mentre la specificità per la malattia di un coniugato è determinata dalla reattività della sottoclasse dell immunoglobulina. In pratica tutti gli autoanticorpi che rivestono significato clinico mostrano una specificità alla sottoclasse IgG anche in presenza di ANA specifico IgM ed IgA. 4 Al contrario, gli ANA riscontrati in donatori di sangue sani sono in genere solamente delle sottoclassi IgM ed IgA. 5 Per questa ragione i coniugati specifici per le IgG sono più specifici per la malattia. Il substrato scelto per il NOVA Lite HEp-2 ANA è una linea cellulare da epitelio umano fissata in maniera ottimale (HEp-2) ed il coniugato è un anti-igg umano purificata per affinità e con un rapporto F/P accuratamente selezionato. Questi parametri del reagente fanno sì che il test per gli NOVA Lite HEp-2 ANA possa rilevare autoanticorpi clinicamente rilevanti (fra cui gli SS-A e gli Scl-70) che con altri test esistenti in commercio possono non venire rilevati. Inoltre la specificità del coniugato per le IgG elimina i risultati fisiologici falsi positivi dovuti a titoli bassi di autoanticorpi IgM normalmente presenti, spesso riscontrati in individui anziani sani. Principio della Metodica Nel test all immunofluorescenza indiretta dei campioni vengono incubati con il substrato dell antigene e gli anticorpi che non hanno reagito vengono lavati via. Il substrato viene incubato con un coniugato specifico marcato con fluoresceina e successivamente il reagente che non si è legato viene lavato via. Quando i campioni positivi agli autoanticorpi vengono osservati con un microscopio a fluorescenza, mostrano una fluorescenza color verde chiaro che corrisponde alle aree delle cellule o dei nuclei dove si è legato l autoanticorpo. 1

2 Reagenti 1. Vetrini di substrato di HEp-2; 6 o 12 pozzetti/vetrino Solo kit: 2. Vetrini di substrato di HEp-2 (cellule epiteliali umane); 12 pozzetti/vetrino o 6 pozzetti/vetrino, con essiccante 3. Coniugato anti-igg umano (capra), marcato alla fluoresceina in tampone contenente Blu di Evans ed azoturo di sodio allo 0,09%, 15 ml 4. ANA Controllo Titolabile Pattern Estremo, 1 fiala di tampone contenente azoturo di sodio allo.0,09% ed anticorpi di siero umano anti HEp-2, prediluto, 0,5 ml 5. Controllo Negativo Sistemi IFA, 1 fiala di tampone contenente azoturo di sodio allo 0,09%, senza anticorpi di siero umano anti HEp-2, prediluto, 0,5 ml 6. Concentrato PBS II (40x), sufficiente per 2000 ml 7. Liquido di montaggio, azoturo di sodio 0,09%, 7 ml 8. Coprivetrini Avvertenze 1. Tutte le fonti umane di materiali usati nella preparazione dei kit controlli per questo prodotto sono state testate e sono risultate negative per la presenza di anticorpi anti-hiv, per HBsAg e per anticorpi anti-hcv mediante metodi approvati dall FDA. Tuttavia nessun test offre la certezza completa dell assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i ANA Controllo Titolabile Pattern Estremo ed Controllo Negativo Sistemi IFA devono essere maneggiati come materiali potenzialmente infettivi La sodio azide è usata come conservante in alcuni dei componenti del kit. La sodio azide è un veleno e può essere tossica se ingerita o assorbita attraverso la cute o gli occhi. La sodio azide può reagire con le tubature di piombo o rame formando azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lasciar scorrere grandi quantità di acqua, se si usa un lavandino per eliminare i reagenti, per prevenire la formazione di azidi. 3. Usare appropriati indumenti personali protettivi mentre si lavora con i reagenti forniti. 4. I reagenti eventualmente rovesciati devono essere rimossi immediatamente. Seguire tutte le normative vigenti in materia di eliminazione dei residui di natura chimica. Precauzioni 1. Questo prodotto (kit) è stato messo a punto per l uso diagnostico In Vitro. 2. La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel kit può causare risultati non attendibili. 3. Un lavaggio incompleto o non accurato dai pozzetti IFA può causare un un elevato background. 4. L'adattamento di questo test per l'uso con un processatore automatico di campioni ed altri dispositivi di manipolazione di liquidi, in tutto od in parte, può portare differenze nei risultati dei test rispetto a quelli ottenuti eseguendo la procedura manuale. E' responsabilità di ogni laboratorio validare la loro procedura automatizzata affinché fornisca risultati dei test entro limiti accettabili. 5. La prestazione del test è influenzata da diversi fattori. Questi includono la temperatura iniziale dei reagenti, la luminosità della lampada del microscopio usato, l'accuratezza e riproducibilità della tecnica di pipettamento, la precisione del lavaggio e la lunghezza dei tempi d'incubazione durante il test. E' richiesto di prestare particolare attenzione alla consistenza per ottenere risultati accurati e riproducibili. 6. Nel tempo, il Coniugato anti IgG Umana può cambiare colore a causa di esposizione alla luce. In ogni caso, il cambiamento del colore non ha effetto sulla prestazione del test. 7. Si raccomanda di attenersi scrupolosamente alle istruzioni fornite. Condizioni di conservazione 1. Conservare tutti i reagenti del vetrini e kit a 2-8 C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza se conservati e trattati seguendo le istruzioni fornite. 2. Il tampone di lavaggio diluito è stabile per 4 settimana a 2-8 C. Raccolta dei campioni Questa tecnica deve essere usata con un campione di siero. L aggiunta al campione di sodio azide o di altri conservanti può influenzare in modo negativo i risultati. Campioni con segni di contaminazione microbica, trattati con calore o contenenti particelle visibili non dovrebbero essere usati. Si dovrebbe evitare anche l uso di sieri fortemente emolizzati o lipemici. Dopo il prelievo, il siero dovrebbe essere separato dal coagulo. Il Documento H18-A3 dell CLSI (NCCLS) raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) Conservare i campioni a temperatura ambiente per non più di 8 ore. 2) Se il test non può essere eseguito entro 8 ore, conservare i campioni in frigorifero a 2-8 C. 3) Se il test non può essere eseguito entro 48 ore, oppure per la spedizione dei campioni, congelare a -20 C. I campioni congelati devono essere mescolati bene dopo lo scongelamento e prima di essere testati. 2

3 Procedura Materiali forniti (kits) pozzetti Vetrini di substrato di HEp ml Coniugato anti-igg umano 1 0,5 ml ANA Controllo Titolabile Pattern Estremo 1 0,5 ml Controllo Negativo Sistemi IFA 2 25 ml Concentrato PBS II (40x) 1 7 ml Liquido di montaggio 1 20 Coprivetrini pozzetti Vetrini di substrato di HEp ml Coniugato anti-igg umano 10 0,5 ml ANA Controllo Titolabile Pattern Estremo 10 0,5 ml Controllo Negativo Sistemi IFA ml Concentrato PBS II (40x) 10 7 ml Liquido di montaggio Coprivetrini pozzetti Vetrini di substrato di HEp ml Coniugato anti-igg umano 1 0,5 ml ANA Controllo Titolabile Pattern Estremo 1 0,5 ml Controllo Negativo Sistemi IFA 1 25 ml Concentrato PBS II (40x) 1 7 ml Liquido di montaggio 1 20 Coprivetrini Materiali forniti (vetrini) Vetrini x 12 pozzetti con cellule HEp Vetrini x 12 pozzetti con cellule HEp Vetrini x 12 pozzetti con cellule HEp Vetrini x 6 pozzetti con cellule HEp-2 Materiali richiesti ma non forniti Micropipette in grando di erogare volume di l Acqua distillata o deionizzata Bottiglie di plastica a spruzzo o pipette Pasteur Camera umida Beuta da 1l per diluire il PBS II Vaschette Coplin Microscopio a fluorescenza con eccitatore a 495 nm e filtro barriera 515 nm Metodica Prima di incominciare 1. Portare tutti i reagenti ed i campioni a temperatura ambiente (20-26 o C) e mescolarli bene. 2. Diluire il concentrato PBS II: IMPORTANTE: diluire il concentrato PBS II 1:40 aggiungendo il contenuto del flacone contenente il concentrato PBS II in 975 ml di acqua distillata o deionizzata e mescolare accuratamente. Il tampone PBS II viene utilizzato per diluire i campioni dei pazienti e come tampone di lavaggio. Il tampone diluito può essere conservato al massimo per 4 settimane 2-8 C. 3. Diluire i campioni del paziente: a. Screening iniziale: diluire i campioni 1:40 con il tampone PBS II diluito (ovvero, aggiungere 50 l di siero a 1,95 ml di tampone PBS II). b. Titolazione: preparare delle diluizioni seriali doppie dalla diluizione di screening iniziale per tutti i campioni positivi con il tampone PBS II diluito (ovvero 1:80, 1:160,... 1:2560). Esecuzione del test 1. Preparare i vetrini del substrato: lasciare raggiungere la temperatura ambiente al vetrino del substrato prima di toglierlo dal sacchetto. Contrassegnarlo con una matita e porlo in una camera umida adeguata. Aggiungere 1 goccia (20-25 l) dei controlli positivi e negativi non diluiti rispettivamente nei pozzetti 1 e 2. Aggiungere 1 goccia (20-25 l) del campione diluito del paziente nei rimanenti pozzetti. 2. Incubazione dei vetrini: incubare il vetrino per minuti in una camera umida (un tovagliolo di carta inumidito disteso sul fondo di un contenitore in plastica o vetro manterrà le condizioni di umidità adeguate). Non lasciare asciugare il substrato durante la procedura d esame. 3

4 3. Lavare i vetrini: dopo l incubazione utilizzare una bottiglia di plastica a spruzzo o una pipetta per lavare via delicatamente il siero utilizzando il tampone PBS II diluito. Orientare il vetrino e la direzione del flusso del tampone PBS II in modo da impedire il più possibile al tampone di scavalcare i vari pozzetti. Evitare di dirigere il flusso direttamente nei pozzetti per evitare danni al substrato. Se voluto, disponga gli vetrini i in un vaso di Coplin dell'amplificatore diluito di PBS II per fino a 5 minuti. 4. Aggiunta del coniugato fluorescente eliminare il tampone PBS II in eccesso. Porre nuovamente il vetrino nella camera umida ed immediatamente coprire tutti i pozzetti con una goccia di coniugato fluorescente. Incubare i vetrini per ulteriori minuti. 5. Lavare i vetrini: ripetere la fase Coprire i vetrini: le procedure per coprire i vetrini variano da laboratorio a laboratorio. Le seguenti procedure sono raccomandate: a. Porre un coprivetrino su un tovagliolo di carta. b. Applicare il liquido di montaggio in una linea continua lungo il bordo inferiore del coprivetrino. c. Eliminare il tampone PBS II in eccesso e fare combaciare il bordo inferiore del vetrino con il bordo del coprivetrino. Abbassare con delicatezza il vetrino sul coprivetrino in modo che il collante scorra fino al bordo superiore del vetrino senza formare bolle d aria. Controllo di qualità L ANA Controllo Titolabile Pattern Estremo ed il Controllo negativo sistema IFA dovrebbero essere effettuati su ogni vetrino in modo da assicurarsi che tutti i reagenti e le procedure siano state eseguite nel modo corretto. Si può preparare dell ulteriore siero di controllo formando ed aliquotando un pool di siero umano e conservandolo a < -70 o C. I risultati dell analisi devono soddisfare tutti i criteri elencati qui di seguito per essere considerati validi. Se uno qualunque non viene soddisfatto, si dovrebbe considerare non valido il risultato dell esame e si dovrebbe ripetere il test. 1. L ANA Controllo Titolabile Pattern Estremo non diluito deve essere > Il Controllo negativo sistema IFA deve risultare negativo. Interpretazione dei risultati Reazione negativa. Un campione viene considerato negativo se la colorazione specifica è uguale o inferiore al Controllo negativo sistema IFA. I campioni possono mostrare differenti gradi di colorazioni di fondo per via di anticorpi eterofili o livelli bassi di autoanticorpi contro costituenti citoplasmatici come le proteine contrattili. Reazione positiva. Un campione viene considerato positivo se la colorazione specifica è maggiore rispetto al Controllo negativo sistema IFA. Determinare il grado o l intensità di fluorescenza utilizzando questi criteri: 4+ Fluorescenza verde chiaro brillante 3+ Fluorescenza verde chiara accesa 2+ Fluorescenza positiva chiaramente distinguibile 1+ La fluorescenza specifica più bassa che permette di distinguere chiaramente la colorazione nucleare e/o citoplasmatica rispetto alla fluorescenza di fondo. Interpretazione dei pattern. In base al tipo ed alla quantità relativa degli autoanticorpi presenti nel campione si possono ottenere differenti pattern nucleari e/o citoplasmatici. Si possono riscontrare i seguenti tipi di pattern: Omogeneo: una colorazione compatta del nucleo che apparentemente copre o no i nucleoli. Tipi di antigeni nucleari presenti: dsdna, ssdna, istoni Associazioni con malattie: titoli elevati sono suggestivi di LES; titoli bassi sono suggestivi di LES o altre patologie a carico del tessuto connettivo. Periferico: una colorazione compatta principalmente attorno la regione esterna del nucleo, con una colorazione più debole verso il centro. Tipi di antigeni nucleari presenti: dsdna, ssdna, DNP, istoni Associazioni con malattie: titoli elevati sono suggestivi di LES; titoli bassi sono suggestivi di LES o altre patologie a carico del tessuto connettivo. A granuli: una colorazione che appare finemente o più grossolanamente granulare, in genere in assenza di colorazione fluorescente dei nucleoli. Tipi di antigeni nucleari presenti: Sm, RNP, Scl-70, SS-A, SS-B, ed altri sistemi antigene/anticorpo non ancora caratterizzati. Associazioni con malattie: titoli elevati sono suggestivi di LES (anticorpo Sm), patologia mista a carico del tessuto connettivo (anticorpo RNP), sclerodermia (anticorpo Scl-70), complesso della sindrome Sjögren (anticorpo SS-B); titoli bassi possono essere suggestivi di altre malattie del tessuto connettivo. Nucleolare: colorazione a granuli grandi e grossolani all interno del nucleo, generalmente in numero inferiore a 6 per ogni cellula, con o senza la presenza di granuli più fini. Antigeni nucleari presenti: 4-6S RNA ed altri antigeni nucleari sconosciuti. Associazioni con malattie: titoli elevati sono prevalenti nella sclerodermia e nella sindrome di Sjögren. Centromerale: pattern a granuli modesti. I granuli nucleari sono modesti ed in genere multipli di 46. Antigeni nucleari presenti: centromero cromosomiale (cinetocoro). Associazioni con malattie: fortemente suggestivo di sindrome di CREST, una variante della sclerosi sistemica progressiva (Progressive Systemic Sclerosis, PSS). La sindrome di CREST è una forma di sclerosi sistemica progressiva che presenta calcinosi prominente, fenomeno di Raynaud, discinesia esofagea e compromissione limitata della cute (in genere limitata alle dita o al viso), teleangectasia. 4

5 Mitocondriale: una granulazione discreta del citoplasma che risparmia relativamente l area nucleare. Antigeni nucleari presenti: vari tipi di antigeni mitocondriali. Associazioni con malattie: titoli elevati indicano la cirrosi biliare primaria. È importante avvertire l utente di esercitare cautela nell affidarsi a questi pattern per determinare la specificità autoanticorpale, tranne che per i pattern nucleolare e centromerale nei quali ognuno degli antigeni è ben definito ed i pattern sono caratteristici. Dal momento che molti autoanticorpi o relative combinazioni possono produrre una colorazione omogenea o a granuli si raccomanda di eseguire successive analisi specifiche per gli autoanticorpi (come gli dsdna e gli ENA) su tutti i campioni che risultano omogenei o a granuli. Limitazioni del test 1. Titoli alti di ANA sono suggestivi di malattie del tessuto connettivo ma non dovrebbero essere considerati diagnostici. I risultati agli ANA dovrebbero essere considerati in combinazione con altre analisi sierologiche e alla storia clinica del paziente. 2. I pattern degli ANA spesso variano se il campione viene titolato fino agli estremi. Questo fenomeno è dovuto al fatto che titoli anticorpali bassi possono cadere al disotto del livello di sensibilità del sistema se si analizza un campione più diluito. 3. La sensibilità del test è influenzata da una serie di fattori esterni fra cui il tipo di microscopio a fluorescenza utilizzato, la forza e l età della lampadina, l ingrandimento utilizzato, il filtro utilizzato e l osservatore. 4. Se viene utilizzato un filtro a banda invece di un filtro barriera 515, si può osservare un numero maggiore di artefatti di colorazione. 5. Si dovrebbe utilizzare solamente una matita per marcare i vetrini. Qualunque altro tipo di materiale per scrivere può causare artefatti. 6. Le vaschette Coplin utilizzate per lavare i vetrini non dovrebbero contenere residui di colorante. L utilizzo di vaschette Coplin che contengono residui di colorante può causare artefatti. 7. I risultati di questo test devono essere valutati dal medico curante alla luce del quadro clinico del paziente e del risultato degli altri test sierologici. 8. Le prestazioni caratteristiche del test non sono state valutate per campioni diversi dal siero. I vetrini venduti separatamente vengono classificati come Reagenti analita-specifici. Ad eccezione di un componente del kit NOVA Lite HEp-2 ANA, le caratteristiche analitiche e prestazionali non sono stabilite. Valori attesi Utilizzando il kit NOVA Lite HEp-2 ANA sono stati analizzati una varietà di pazienti affetti da malattie del tessuto connettivo nonché 200 donatori di sangue scelti in maniera casuale. I risultati appaiono qui di seguito: Gruppo di pazienti Numero Numero di positivi al NOVA Lite HEp-2 ANA LES Lupus indotto da droghe Artrite reumatoide Scleroderma Dermatomiosite Sindrome di Sjögren Normali

6 Bibliografia 1. Tan EM: Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine. Advances in Immunology 33: , Tan EM, et al.: The 1982 Revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 25: , Casalo SP, Friou GJ and Myers LL: Significance of antibodies to DNA in systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 7: , Gonzalez E and Rothfield N: Immunoglobulin class and pattern of nuclear fluorescence in systemic lupus erythematosus. The New England Journal of Medicine 274: , Wiik A: Antinuclear factors in sera from healthy blood donors. Acta Path Microbiology Scand. 84: , Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) 5 th Edition. Centers for Disease Control/National Institute of Health, 2009 Fornitore: INOVA Diagnostics, Inc Old Grove Road San Diego, CA United States of America Technical Service (U.S. & Canada Only) : Technical Service (Outside the U.S.) : support@inovadx.com Authorized Representative in the EU: Autorisierter Repräsentant: Rappresentante Autorizzato: Representante Autorizado: Représentant Autorisé: Representante Autorizado: Aντιπροσωπευτικός: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D St. Ingbert, Germany Tel.: Fax.: ITA December 2012 Revision 21 NOVA Lite, e INOVA Diagnostics, Inc., sono marchi registrati. Copyright 2012 Tutti i diritti riservati 6