I nuovi sistemi automatizzati per la lettura degli ANA in immunofluorescenza indiretta

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1 I nuovi sistemi automatizzati per la lettura degli ANA in immunofluorescenza indiretta Am Am J Clin J Clin Pathol Pathol Elio Tonutti Laboratorio di Immunopatologia e Allergologia Azienda Ospedaliero-Universitaria di Udine Tolmezzo Flow-chart of Connective Tissue Disease Ann Rheum Dis 2010 ANA - IIF + - STOP Pattern Centromer Cytoplasmic/Nucleolar Nuclear dots PM or SS? Others CENP-B AMA, ribosomial, Jo1, Polym/Dermat, Scleroder Sp-100 Pos > 1:160 - DNA EIA o IIF + ENA screen EIA + ENA profile SLE? EIA DB LIA ALB Anti-nucleosome EIA confirm titre IIF RNP, Sm, SSA, SSB, Scl70, Jo-1, PCNA, histone 4 CRITERIA FOR THE CLASSIFICATION OF SYSTEMIC LUPUS ERYTHEMATOSUS (ACR Subcommittee) Hochberg MC. Arthritis Rheum 1997; 40: 1725 Le problematiche legate alla refertazione: 1. Malar rash 2. Discoid rash 3. Photosensitivity 4. Oral ulcers 5. Arthritis 6. Serositis 7. Renal disorder 8. Neurologic disorder 9. Haematologic disorder Haemolitic anemia Lymphopenia Leucopenia Thrombocitopenia 10. Immunologic disorder dsdna Abs SmAbs Serologic test for syphilis acl IgG acl IgM LAC 11. Antinuclear antibody Quali pattern refertare Come refertare i pattern Quando e se eseguire test di conferma (ANA reflex) Quando inserire un commento interpretativo 5

2 J Autoimm 2010

3 Pattern Antigeni Patologie associate Test reflex Membrana nucleare Lamina, Gp210 SLE, Sj, CBP,AH GP210 Omogeneo, nucleoli+ DNA,Istoni SLE, Drug SLE, AR j DNA, ENA?, Istoni, Nucleos Omogeneo, nucleoli - DNA, Istoni SLE, Drug SLE DNA,ENA?, Istoni, Nucleos Speckled coarse hnrnp, U1 RNP MCTD ENA Speckled large granul. U1 RNP MCTD ENA Fine speckled SSA,SSB,Mi2,Ku Sj,SLE,SSc/PM ENA,SSc/PM auto-ab SCL70-like pattern SCL70,PM/Scl Pm/Scl ENA SCL70, Pm/Scl auto-ab PCNA pleiomorphic PCNA SLA, MCTD PCNA Centromerico CENP A,B,C,D SSc limited; Rayn. CENP Multi dots (5-10) Sp100,PML PBC Sp100, PML Few nuclear dots (2-6) P80 coilin (raro) Sj, SLE, Rayn. P80 coilin Nucleolare: omog, clumpy, speckled Fibrill, Pm/Scl,RNA pol Scleroderma Fibrill, Pm/Scl,RNA pol Centriolo diversi Mycoplasma, Sj?? NuMa centrofilina Mycoplasma? Pattern Antigeni Patologie associate Test reflex CENP-F MSA-3 cancer? Citoplasmatico diffuso Jo1, PL7, PL12, OJ, EJ, Sc, ribosomi Citoplasmatico fin. Speck. Jo1 e auto-ab anti-sintetasi Miosite, SLE, alveolite, Rayn Miosite, dermatomiosite Ribosomi, auto-ab Pm-associati Jo1 e auto-ab antisintetasi Mitocondri-like M2 CBP M2 Lilsosomi -like??? Smooth muscle actina Autoimmune Hep actina Vimentina-like??? Midbody MSA-2 SSc, Rayn?

4 Sistemi per lo screening dei campioni negativi e per consentire all operatore di concentrare professionalità e tempo sui veri campioni positivi,, per i quali i sistemi possono fornire un interpretazione di alcuni pattern fluoroscopici fondamentali Microscopio a fluorescenza Lampada LED (10000 h di durata) Stazione motorizzata per individuare vetrini e pozzetti Fotocamera o telecamera Software Sistema autofocusing Screening totalmente automatizzato Analisi HEp2: completa: tempo varia da1 minuto a 5 minuti a pozzetto screening pos / neg analisi dei pattern (alcuni) Quantificazione dei risultati Archiviazione di dati-immagini immagini Preparazione report per paziente Visione live dei pozzetti Esperienza col sistema Aklides Il sistema analizza intensità e struttura della fluorescenza di ogni campione, per poter fare la discriminazione POSITIVI- NEGATIVI Oltre alla normale procedura dei test in IFI, ogni pozzetto viene incubato con DAPI (4 6- diamidino-2-phenylindol). Il DAPI permette il riconoscimento dell elemento elemento cellulare e la messa a fuoco

5 Sui campioni positivi localizza la fluorescenza: NUCLEARE o CITOPLASMATICA con assegnazione della fluorescenza ad uno dei 5 pattern basilari del software omogeneo speckled dots La segmentazione delle immagini Le immagini cellulari vengono considerate OGGETTI che vengono definiti utilizzando sistemi di identificazione: Regionali (spazio fisico) Topologici (proprietà di figure e forme) Di superficie nucleolare centromerico DAPI Image Processing of AKLIDES FITC homogenous Pattern omogeneo nucleolar speckeld centromere dots cytoplasm Pattern centromerico VALUTAZIONE ESEGUITA A UDINE CAMPIONI ANALIZZATI: 530 sieri in totale di cui 502 campioni consecutivi inviati per ricerca ANA 28 campioni selezionati con pattern IFI peculiari e/o specificità autoanticorpale nota

6 CAMPIONI ANALIZZATI ANALISI 68 sieri con SSA SSB DNA SP100 Cenp-B AMA-M2 Gp210 RNP Specificità Scl70 Jo1 PCNA PMscl Sm P-ribosomiale Anche più specificità presenti: fino a 4 Microscopia tradizionale: tessuto: Hep-2 Alifax Valutazione al a fluorescenza di due operatori esperti: Titolo e pattern Sistema automatizzato di lettura tessuto Hep-2 Alifax Valutazione automatizzata con lampada a led Titolo e pattern ANALISI : sistema automatizzato Titolo: Negativo, debolm. pos., 1+, 2+, 3+, Pattern: speckled, omogeneo, dots nucleolare, citoplasmatico centromerico non definito RISULTATI N = 530 Negativi POSITIVI Non determinati Lettura Aklides 279 (53%) 245 (46%) 6 (1%) Lettura 256 (48%) 270 (51%) 4 (1%) Positivi 67 su 68 sieri con specificità definita RISULTATI POSITIVI : titolo Lettura Aklides N = 245 Lettura N = 270 BASSO ALTO Debol pos e 1+ 2+, 3+, (47%) 130 (53%) 1:80 1:160 Non titolati 82 (30%) 185 (69%) 3 PATTERN IFI omogeneo e speckled N CAMPION Aklides OMOGENEO SPECKLED

7 PATTERN IFI: altri AGREEMENT (88.4%) MICROSCOPIO N CAMPION Aklides AKLIDES POS NEG POS (3.7%) NEG 42 (7.9%) Dots : misti + speckled e omogeneo = 20 non defi... matrice n membra.. citoplasmat dots nucleolare centromero PATTERN N = DEI 42 SIERI AKLIDES NEGATIVI/MICROSCOPIO POSITIVI: 29 speckled e/o omogeneo 1:80 8 speckled e/ o omogeneo o matrice nucleare 1:160 5 speckled o matrice nucleare 320 (1 siero SSA 52 kd positivo a basso titolo) 4,2% 3,1% M. pos/a. neg M. neg/a. pos Udine* 7.9% 3.7% Berlin University** 4.2% 3.1% Berlin private Lab** 8.0% 2.0% 8% 2% M = lettura al A = lettura Aklides *Diluizione 1:80 **Diluizione 1:160

8 Il gruppo di studio SIMeL di Autoimmunologia ha in corso uno studio comparativo tra 6 sistemi per l interpretazione automatizzata del test ANA: 132 sieri validati in 6 laboratori utilizzando 6 diversi substrati Hep-2 I 132 sieri sono stati sucessivamente processati per gli ANA dai rispettivi specialist nei laboratori di Udine e Merano Sono in corso le analisi dei risultati A B C D E D Falsi negativi 7/95 2/95 27/95 11/95 10/95 2/94 Sensibilità% Falsi positivi 2/42 15/42 0/42 2/42 8/42 10/42 automazione degli step interpretativi oggettività del sistema assenza di influenza della struttura intrinseca dell occhio umano abbattimento della soggettività interpretativa in fase di screening Specificità% STANDARDIZZAZIONE

9 CONCLUSIONI I sistemi automatici per la lettura degli ANA sono in grado di discriminare i sieri ANA positivi da quelli ANA negativi Sono in grado di identificare i sieri ANA positivi e con autoanticorpi specifici I sistemi sono completamente automatizzati Sono in grado di archiviare tutte le immagini su scheda/paziente e di collegarsi al LIS. Possono processare oltre ai vetrini HEp-2 anche vetrini per ds-dna, ANCA e 3 tessuti Come tutti i sistemi di acquisizione e di interpretazione di immagini interpretano l immagine in rapporto alla qualità del substrato utilizzato Possono avere un ruolo rilevante nel fornire un titolo oggettivo di positività