L evoluzione tecnologica dell immunofluorescenza: verso la completa automazione degli ANA IFI

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1 L evoluzione tecnologica dell immunofluorescenza: verso la completa automazione degli ANA IFI Claudia Alpini, Laboratorio Analisi Chimico Cliniche, Fondazione I.R.C.C.S. Policlinico San Matteo Pavia

2 CENNI STORICI La storia della diagnostica autoimmune inizia negli anni 40 e Antigen Anti-nuclear antibodies: Contemporary techniques and clinical application to connective tissue diseases G. A. McCarty, D. W. Valencia and M. J. Fritzler Oxford University Press, Oxford, 1984

3 Metodi di dosaggio degli autoanticorpi Renato Tozzoli LigandAssay 15 (4) 2010 Tra i metodi convenzionali di prima generazione l IFI rappresenta la prima tecnica per la rivelazione degli autoanticorpi e nella sua applicazione principale (ANA-IFI) rappresenta anche il primo esempio di test Multiplex nella storia.

4 Nell ultimo ventennio, la ricerca ha prodotto una vera rivoluzione nell ambito delle tecnologie diagnostiche dirette alla rivelazione/quantificazione degli autoanticorpi, che si è tradotta in un aumento esponenziale della capacità analitica in un rapido incremento numerico delle richieste Tozzoli et al.: Current state of diagnostic technologies in the autoimmunology laboratory Figure 1 The evolution of technologies for autoantibody detection: the role of automation (see text for legends).

5 L evoluzione delle tecnologie : la determinazione degli ANA un aumento esponenziale della capacità analitica

6 L evoluzione delle tecnologie : la determinazione degli ANA un rapido incremento numerico delle richieste Journal of Immunology Research

7 ANA anno 2013 Statistica richieste ANA A S L B E L G C C H I R Incremento ANA negli anni A S L E M A T INF A M B A P E D REU Laboratorio Analisi Chimico Cliniche, Fondazione I.R.C.C.S. Policlinico San Matteo Pavia M E D. I N T

8 Anticorpi anti-antigeni nucleo-citoplasmatici : ANA Definizione sono autoanticorpi appartenenti a tutte le classi di immunoglobuline, più spesso IgG, diretti verso i normali costituenti e compartimenti cellulari, comuni a tutti i tipi di cellule,rappresentati da acidi nucleici, macromolecole, proteine associate acidi nucleici, enzimi e loro cofattori; sono presenti in modo stabile nel nucleo e nelle principali strutture cellulari (membrana, nucleoplasma e cromatina, nucleolo); migranti dal nucleo al citoplasma, durante le fasi del ciclo cellulare; sono presenti in modo stabile nel citoplasma; sono la conseguenza della perdita, da parte dell organismo, della tolleranza verso antigeni self.

9 Ann Rheum Dis July 2014 Vol 73 No 7

10 ANA - Sono un test di screening utilizzato per la diagnosi di quasi tutte la malattie reumatiche autoimmuni, e in alcuni casi, ne rappresentano un parametro diagnostico/classificativo. - Utili da un punto di vista clinico/diagnostico in altre patologie autoimmuni e non. Journal of Immunology Research Volume 2014, Article ID , 18 pages

11 rapido incremento numerico delle richieste disponibilità di tecnologie ad elevato throughput ANA test?? ANA new technologies ANA-IFI

12 vecchio ANA-IFI nuovo ANA test Screening Ma..il problema: Consolidamenti in atto: necessità di assorbire aumentati carichi di lavoro Esigenza di integrazione ed accentramento su stazioni analitiche multiparametriche Aumento richieste esami Ha evidenziato crescenti preoccupazioni circa l adozione unilaterale di questi nuovi metodi. Alla domanda : Quale metodo utilizzare? del controllo della qualità ( riproducibilità, sensibilità, specificità); dell interpretazione clinica dei risultati ; dell accuratezza dei metodi

13 Comitati internazionali ad hoc, come: - IUIS/WHO/AF/CDC Comitato per la standardizzazione di autoanticorpi correlati a malattie autoimmuni - Task Force della American College of Rheumatology (ACR)

14 ANA-IFI deve la sua riaffermata superiorità ad una elevata sensibilità. Sensibilità non riscontrabile nei metodi alternativi e caratteristica fondamentale ed obbligatoria in un saggio destinato ad essere utilizzato come screening. Meroni et al. BMC Medicine2014, 12:38 Journal of Immunology Research Volume 2014, Article ID , 18 pages

15 Nella pratica clinica, una corretta interpretazione del test ANA deve essere d aiuto a stabilire Qual è la probabilità di un paziente di avere la malattia quando il test di laboratorio è positivo o non avere la malattia quando il test di laboratorio è negativo. difficile in termini di specificità e sensibilità PVN di SPA è inferiore al PVN di IFI

16 In virtù della riaffermata superiorità.. rivoluzione e modernizzazione del test ANA-IFI

17 Negli ultimi anni si sono intensificati gli sforzi per migliorarne in modo significativo i principali svantaggi Piattaforme tecnologiche avanzate per l automazione di ANA-IFI Piattaforme tecnologiche avanzate per la lettura e l interpretazione di ANA-IFI 1 2

18 Agmon-Levin N, et al. Ann Rheum Dis 2013;0:1 7. doi: /annrheumdis

19 Agmon-Levin N, et al. Ann Rheum Dis 2013;0:1 7. doi: /annrheumdis

20 Piattaforme tecnologiche avanzate per l automazione di ANA-IFI

21 LIS LIS Oggi: stato dell arte

22 Questi Sistemi Intelligenti utilizzano: microscopi automatizzati con sorgente luminosa a LED; vassoi porta vetrini robotizzati; video camere ad alta sensibilità; hardware e software diversi dedicati all acquisizione, alla analisi e alla valutazione dell immagine ANA-IFI. Piattaforme tecnologiche avanzate per la lettura e l interpretazione di ANA-IFI

23 Criticità sono state rilevate: interpretazione di alcuni quadri fluoroscopici; pattern con reattività multiple. Metodo robusto nello screening Tale interpretazione errata può avere dei campioni positivi/negativi; implicazioni in ambito clinico, sottolineando la necessità e l importanza dell interpretazione dell esperto.

24 Autoimmunity Reviews 13 (2014)

25 Complessivamente l efficacia analitica dei sistemi è notevole: 40/756 errori pari al 5,3% Sensibilità 96,7% Specificità 89,2% Imprecisione analitica buona < 1,99% x< 25,26% 18 falsi negativi* 22 falsi positivi (manuale 39,12%) * 2 sieri critici anche per operatori esperti; Buona correlazione tra valore analitico del segnale e titolo errore manuale 3,3% con sens.media 96,7% 16 sieri 50% pattern citoplasmatici (1 Jo1non riconosciuto da 4/6) (titoli 50% bassi pattern e morfologia inusuali complessa penalizzano corretta classificazione) 65% con titolo 1:160 (1/3 pattern citoplasmatico e 2/3 pattern inusuale) 35% con titolo 1:320 ( 60% pattern citoplasmatico e 40% pattern inusuale) % errori calcolata sul totale delle osservazioni pari al 10,8%

26 Interpretazione ANA-IFI * * * * non sono stati valutati sieri con pattern misti Corretta identificazione L interpretazione dei quadri dei quadri morfologici fluoroscopici classici dipende : Difficoltà nell interpretazione limitazioni dichiarate quadri dai produttori; fluoroscopici inusuali e citoplasmatici Difficoltà qualità nella del corretta substrato; interpretazione di quadri fluoroscopici misti preparazione vetrini.

27 Time...verso la completa automazione degli ANA-IFI.siamo vicini alla meta! Throughput ANA-IFI Standardizzazione e completa automazione procedura di esecuzione Armonizzazione dei risultati in IFI: -riduzione soggettività; -riduzione variabilità intra-inter laboratorio; -throughput più elevato flusso di lavoro

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