NOVA Lite ANCA A n t i-neutrophil Cytoplasmic Autoantibody Reagents Per uso diagnostico In Vitro

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1 NOVA Lite ANCA A n t i-neutrophil Cytoplasmic Autoantibody Reagents Per uso diagnostico In Vitro Codice Prodotto: , , , , , , Complessità CLIA: elevata Finalità d uso NOVA Lite ANCA è un test immunofluorescenza indiretta per la rilevazione di anticorpi anti-citoplasma dei neutrofili (ANCA) nel siero umano. Il riscontro degli ANCA può essere di ausilio nell accertare la presenza di varie vasculiti sistemiche quando viene utilizzato assieme ad altre analisi di laboratorio e ai riscontri clinici. Riassunto e Spiegazione del test L analisi degli anticorpi anti-citoplasma dei neutrofili (ANCA) ha rivoluzionato la diagnosi e la terapia delle vasculiti autoimmuni. 1-4 Gli autoanticorpi ANCA perinucleari (panca) e citoplasmatici (canca) si sono dimostrati utili per rivelare malattie quali la granulomatosi di Wegener e la glomerulonefrite crescentica. Esistono almeno sei antigeni ANCA identificati e molti sono ancora non identificati. 1,5 La maggior parte di questi antigeni sembrano essere enzimi che risiedono nei granuli primari dei neutrofili. Questi enzimi includono la mieloperossidasi, (MPO), la serina proteasi 3 (PR3), l elastasi, la lattoferrina, la catepsina G e la proteina cationica 57 (CAP-57). Malgrado i test ELISA siano stati sviluppati per rivelare molti dei più importanti anticorpi anti-neutrofili la maggior parte degli esperti nel campo delle vasculiti autoimmuni raccomanda tuttora di utilizzare la prova alla immunofluorescenza (IFA) per lo screening iniziale. Sono riscontrabili due pattern ANCA utilizzando la procedura standard IFA. Il pattern classico appare come una fluorescenza citoplasmatica granulare. Questo pattern, tipico della granulomatosi di Wegener ed in misura minore della poliarterite microscopica è stato denominato canca. 6 È stato descritto un secondo pattern ANCA 7,8 che colora la regione perinucleare dei neutrofili fissati in alcool. Questo pattern è stato denominato panca. Il pattern panca è stato associato a vasculiti più limitate ad organi specifici, in particolare, la glomerulonefrite crescentica o glomerulonefrite a progressione rapida. 9 È ben stabilita la correlazione fra i canca e la granulomatosi di Wegener. 3,10 La granulomatosi di Wegener è caratterizzata da un processo infiammatorio necrotizzante con formazione di granuloma e vasculite che coinvolge principalmente il tratto respiratorio superiore ed inferiore ed i reni. Questa triade clinica è considerata la caratteristica della granulomatosi di Wegener. I canca sono presenti in una percentuale di pazienti affetti da granulomatosi di Wegener con malattia attiva generalizzata che arriva fino 96% ma si riduce al 65% nei pazienti con malattia attiva localizzata e nel 30-40% dei pazienti in remissione. Il titolo dei canca segue il decorso della malattia, diminuendo in remissione ed aumentando nelle ricadute. 4,12 Diversamente dai canca e la loro associazione con la granulomatosi di Wegener principalmente sistemica, i panca sono stati di frequente associati con la glomerulonefrite necrotizzante. I panca tipicamente non si riscontrano in sindromi sistemiche. L antigene bersaglio più comune associato ai panca è la mieloperossidasi, ma si riscontra anche reattività alla elastasi ed alla lactoferrina. Quasi il 90% dei sieri panca positivi provenienti da pazienti affetti da glomerulonefrite è reattivi alla mieloperossidasi; tuttavia dei pazienti affetti da malattie differenti dalla glomerulonefrite che presentano i panca, una percentuale molto minore è reattiva alla mieloperossidasi. 11,13 Ciò starebbe ad indicare che sono rilevabili più antigeni differenti come colorazione perinucleare di neutrofili fissati in alcool, inclusi sieri che contengono anticorpi antinucleo. È possibile confermare che i pattern perinucleari rilevati tramite i neutrofili fissati in alcool siano panca effettuando un analisi IFA su neutrofili fissati in formalina. L antigene bersaglio primario dei panca, la mieloperossidasi, resta nel citoplasma della cellule fissate in formalina, mentre in quelle fissate in alcool l antigene migra nel nucleo causando il pattern perinucleare. Principio della Metodica Nel test all immunofluorescenza indiretta dei campioni vengono incubati con il substrato dell antigene e gli anticorpi che non hanno reagito vengono lavati via. Il substrato viene incubato con un coniugato specifico marcato con fluoresceina e successivamente il reagente che non si è legato viene lavato via. Quando i campioni positivi agli autoanticorpi vengono osservati con un microscopio a fluorescenza, mostrano una fluorescenza color verde chiaro che corrisponde alle aree delle cellule o dei nuclei dove si è legato l autoanticorpo. Reagenti 1. Vetrini ANCA, vetrini con substrato di neutrofili umani fissati in etanolo; 6 o 12 pozzetti/vetrino, con essiccante Solo kit 2. Coniugato anti-igg umano (capra), marcato alla fluoresceina in tampone contenente Blu di Evans ed azoturo di sodio allo 0,09%, 3. Positivo canca, 1 fiala di tampone contenente azoturo di sodio allo 0,09% ed anticorpi da siero umano verso gli antigeni canca, prediluito 4. Positivo panca, 1 fiala di tampone contenente azoturo di sodio allo 0,09% ed anticorpi da siero umano verso gli antigeni panca, prediluito 1

2 5. Controllo negativo sistema IFA, 1 fiala di tampone contenente azoturo di sodio allo 0,09% ma priva di anticorpi verso il ANCA da siero umano, prediluito 6. Concentrato PBS II (40x) 7. Liquido di montaggio, azoturo di sodio 0,09% 8. Coprivetrini Avvertenze 1. Tutte le fonti umane di materiali usati nella preparazione dei controlli per questo prodotto sono state testate e sono risultate negative per la presenza di anticorpi anti-h I V, p e BsAg r H e per anticorpi anti- HCV mediante metodi approvati dall FDA. Tuttavia nessun test offre la certezza completa dell assenza di HIV, HBV, HCV o di altri agenti infettivi. Pertanto, i Positivo canca, Positivo panca ed Controllo Negativo Sistemi IFA devono essere maneggiati come materiali potenzialmente infettivi La sodio azide è usata come conservante. La sodio azide è un veleno e può essere tossica se ingerita o assorbita attraverso la cute o gli occhi. La sodio azide può reagire con le tubature di piombo o rame formando azidi metalliche potenzialmente esplosive. Lasciar scorrere grandi quantità di acqua, se si usa un lavandino per eliminare i reagenti, per prevenire la formazione di azidi. 3. Usare appropriati indumenti personali protettivi mentre si lavora con i reagenti forniti. 4. I reagenti eventualmente rovesciati devono essere rimossi immediatamente. Seguire tutte le normative vigenti in materia di eliminazione dei residui di natura chimica. Precauzioni 1. Questo prodotto è stato messo a punto per l uso diagnostico In Vitro. 2. La sostituzione di componenti diversi da quelli forniti nel kit può causare risultati non attendibili. 3. Un lavaggio incompleto o non accurato dai pozzetti IFA può causare un un elevato background. 4. L'adattamento di questo test per l'uso con un processatore automatico di campioni ed altri dispositivi di manipolazione di liquidi, in tutto od in parte, può portare differenze nei risultati dei test rispetto a quelli ottenuti eseguendo la procedura manuale. E' responsabilità di ogni laboratorio validare la loro procedura automatizzata affinché fornisca risultati dei test entro limiti accettabili. 5. La prestazione del test è influenzata da diversi fattori. Questi includono la temperatura iniziale dei reagenti, la luminosità della lampada del microscopio usato, l'accuratezza e riproducibilità della tecnica di pipettamento, la precisione del lavaggio e la lunghezza dei tempi d'incubazione durante il test. E' richiesto di prestare particolare attenzione alla consistenza per ottenere risultati accurati e riproducibili. 6. Nel tempo, il Coniugato anti IgG Umana può cambiare colore a causa di esposizione alla luce. In ogni caso, il cambiamento del colore non ha effetto sulla prestazione del test. 7. Si raccomanda di attenersi scrupolosamente alle istruzioni fornite. Condizioni di conservazione 1. Conservare tutti i reagenti del kit a 2-8 C. Non congelare. I reagenti sono stabili fino alla data di scadenza se conservati e trattati seguendo le istruzioni fornite. 2. Il tampone di lavaggio diluito è stabile per 4 settimana a 2-8 C. Raccolta dei campioni Questa tecnica deve essere usata con un campione di siero. L aggiunta al campione di sodio azide o di altri conservanti può influenzare in modo negativo i risultati. Campioni con segni di contaminazione microbica, trattati con calore o contenenti particelle visibili non dovrebbero essere usati. Si dovrebbe evitare anche l uso di sieri fortemente emolizzati o lipemici. Dopo il prelievo, il siero dovrebbe essere separato dal coagulo. Il Documento H18-A3 dell CLSI (precedentemente NCCLS) raccomanda le seguenti condizioni di conservazione per i campioni: 1) Conservare i campioni a temperatura ambiente per non più di 8 ore. 2) Se il test non può essere eseguito entro 8 ore, conservare i campioni in frigorifero a 2-8 C. 3) Se il test non può essere eseguito entro 48 ore, oppure per la spedizione dei campioni, congelare a -20 C. I campioni congelati devono essere mescolati bene dopo lo scongelamento e prima di essere testati. Procedura Materiali forniti (kits) pozzetti Vetrini ANCA con substrato di neutrofili umani fissati in etanolo 1 4 ml Coniugato anti-igg umano 1 25 ml Concentrato PBS II (40x) 1 10 Coprivetrini 2

3 pozzetti Vetrini ANCA con substrato di neutrofili umani fissati in etanolo 1 15 ml Coniugato anti-igg umano 2 25 ml Concentrato PBS II (40x) 1 20 Coprivetrini pozzetti ANCA Vetrini con substrato di neutrofili umani fissati in etanolo 1 15 ml Coniugato anti-igg umano 2 25 ml Concentrato PBS II (40x) 1 20 Coprivetrini pozzetti Vetrini ANCA con substrato di neutrofili umani fissati in etanolo 1 4 ml Coniugato anti-igg umano 1 25 ml Concentrato PBS II (40x) 1 10 Coprivetrini Materiali forniti (vetrini) x 6-pozzetti ANCA Vetrini con substrato di neutrofili umani fissati in etanolo x 12-pozzetti ANCA Vetrini con substrato di neutrofili umani fissati in etanolo x 12-pozzetti ANCA Vetrini con substrato di neutrofili umani fissati in etanolo x 6-pozzetti ANCA Vetrini con substrato di neutrofili umani fissati in etanolo Materiali richiesti ma non forniti Micropipette in grando di erogare volume di µl Acqua distillata o deionizzata Bottiglie di plastica a spruzzo o pipette Pasteur Camera umida Beuta da 1l per diluire il PBS II Vaschette Coplin Microscopio a fluorescenza con eccitatore a 495 nm e filtro barriera 515 nm Materiale supplementare disponibile separatamente ANCA (Neutrofili umani fissati in formalina) Vetrino-6 pozzetti, Catalogo INOVA # ANCA (Neutrofili umani fissati in formalina) Vetrino-12 pozzetti, Catalogo INOVA # Metodica Prima di incominciare 1. Portare tutti i reagenti ed i campioni a temperatura ambiente (20-26 o C) e mescolarli bene. 2. Diluire il concentrato PBS II: IMPORTANTE: diluire il concentrato PBS II 1:40 aggiungendo il contenuto del flacone contenente il concentrato PBS II in 975 ml di acqua distillata o deionizzata e mescolare accuratamente. Il tampone PBS II viene utilizzato per diluire i campioni dei pazienti e come tampone di lavaggio. Il tampone diluito può essere conservato al massimo per 4 settimane 2-8 C. 3. Diluire i campioni del paziente: a. Screening iniziale: diluire i campioni 1:20 con il tampone PBS II diluito (ovvero, aggiungere 50 µl di siero a 950 µl di tampone PBS II). b. Titolazione: preparare delle diluizioni seriali doppie dalla diluizione di screening iniziale per tutti i campioni positivi con il tampone PBS II diluito (ovvero 1:40, 1:80,... 1:1280). Esecuzione del test 1. Preparare i vetrini del substrato: lasciare raggiungere la temperatura ambiente al vetrino del substrato prima di toglierlo dal sacchetto. Contrassegnarlo con una matita e porlo in una camera umida adeguata. Aggiungere 1 goccia (20-25 µl) dei controlli positivi e negativi non diluiti rispettivamente nei pozzetti 1 e 2. Aggiungere 1 goccia (20-25 µl) del campione diluito del paziente nei rimanenti pozzetti. 2. Incubazione dei vetrini: incubare il vetrino per minuti in una camera umida (un tovagliolo di carta inumidito disteso sul fondo di un contenitore in plastica o vetro manterrà le condizioni di umidità adeguate). Non lasciare asciugare il substrato durante la procedura d esame. 3

4 3. Lavare i vetrini: dopo l incubazione utilizzare una bottiglia di plastica a spruzzo o una pipetta per lavare via delicatamente il siero utilizzando il tampone PBS II diluito. Orientare il vetrino e la direzione del flusso del tampone PBS II in modo da impedire il più possibile al tampone di scavalcare i vari pozzetti. Evitare di dirigere il flusso direttamente nei pozzetti per evitare danni al substrato. Se voluto, disponga gli vetrini i in un vaso di Coplin dell'amplificatore diluito di PBS II per fino a 5 minuti. 4. Aggiunta del coniugato fluorescente eliminare il tampone PBS II in eccesso. Porre nuovamente il vetrino nella camera umida ed immediatamente coprire tutti i pozzetti con una goccia di coniugato fluorescente. Incubare i vetrini per ulteriori 30 ± 5 minuti. 5. Lavare i vetrini: ripetere la fase Coprire i vetrini: le procedure per coprire i vetrini variano da laboratorio a laboratorio. Le seguenti procedure sono raccomandate: a. Porre un coprivetrino su un tovagliolo di carta. b. Applicare il liquido di montaggio in una linea continua lungo il bordo inferiore del coprivetrino. c. Eliminare il tampone PBS II in eccesso e fare combaciare il bordo inferiore del vetrino con il bordo del coprivetrino. Abbassare con delicatezza il vetrino sul coprivetrino in modo che il collante scorra fino al bordo superiore del vetrino senza formare bolle d aria. Controllo di qualità Il Positivo canca ed il Controllo negativo sistema IFA dovrebbero essere effettuati su ogni vetrino in modo da assicurarsi che tutti i reagenti e le procedure siano state eseguite nel modo corretto. Si può preparare dell ulteriore siero di controllo formando ed aliquotando un pool di siero umano e conservandolo a < -70 o C. I risultati dell analisi devono soddisfare tutti i criteri elencati qui di seguito per essere considerati validi. Se uno qualunque non viene soddisfatto, si dovrebbe considerare non valido il risultato dell esame e si dovrebbe ripetere il test. 1. Il Positivo canca non diluito deve essere > Il Controllo negativo sistema IFA deve risultare negativo. Interpretazione dei risultati Reazione negativa. Un campione viene considerato negativo se la colorazione nucleare o citoplasmatica specifica è uguale o inferiore al Controllo negativo sistema IFA. I campioni possono mostrare differenti gradi di colorazioni di fondo per via di anticorpi eterofili o livelli bassi di autoanticorpi contro costituenti citoplasmatici come le proteine contrattili. Reazione positiva. Un campione viene considerato positivo se si osserva una colorazione specifica nucleare e/o citoplasmatica come quelle descritte qui di seguito maggiore rispetto al controllo negativo e la intensità di colorazione è di 1+ o maggiore. Determinare il grado o l intensità di fluorescenza utilizzando questi criteri: 4+ Fluorescenza verde chiaro brillante 3+ Fluorescenza verde chiara accesa 2+ Fluorescenza positiva chiaramente distinguibile 1+ La fluorescenza specifica più bassa che permette di distinguere chiaramente la colorazione nucleare e/o citoplasmatica rispetto alla fluorescenza di fondo Interpretazione dei pattern. In base al tipo ed alla quantità relativa degli autoanticorpi presenti nel campione si possono ottenere differenti pattern nucleari e citoplasmatici. Si possono riscontrare i seguenti tipi di pattern: canca o colorazione citoplasmatica: questo pattern presenta generalmente una fluorescenza citoplasmatica a granuli grossolani, spesso con una fluorescenza accentuata all interno ed attorno ai lobi del nucleo. Questo pattern si riscontra in genere in presenza di anticorpi che reagiscono con la Proteasi della Serina 3 dell enzima dei granuli primari (PR3). panca o colorazione perinucleare: questo pattern appare in genere come una colorazione omogenea dei lobi nucleari, spesso con un accentuazione perinucleare. Dato che alcuni anticorpi antinucleo (ANA) possono reagire anche con i nuclei di neutrofili umani fissati in etanolo, si raccomanda di analizzare questi campioni anche per gli ANA. Inoltre questi campioni possono essere analizzati su neutrofili umani fissati in formalina invece che in etanolo. La formalina, essendo un fissativo a legami crociati, distrugge la maggior parte degli antigeni nucleari e modifica il pattern di colorazione da perinucleare in citoplasmatica se il campione contiene dei panca. Sono disponibili separatamente vetrini fissati in formalina adatti a questo scopo. Limitazioni del test 1. Campioni inattivati con calore, emolizzati, contaminati da microrganismi o non completamente defibrinati possono causare una intensa colorazione di fondo e rendere difficile l interpretazione. Procurarsi un nuovo campione e ripetere l analisi. L aggiunta di albumina o siero bovino al 2% al tampone PBS II utilizzato per diluire i campioni può ridurre la colorazione di fondo nei campioni che presentano questo problema. 2. I campioni ANA positivi possono reagire con i neutrofili fissati in alcool. I campioni positivi alle componenti nucleari dovrebbero essere analizzati per gli ANA e/o analizzati su vetrini di neutrofili fissati in formalina. 3. Dato che i neutrofili umani fissati in etanolo contengono molti antigeni dei granuli primari come l elastasi, la lattoferrina, la catepsina G, la proteina cationica 57 e probabilmente altri antigeni dei neutrofili ancora non identificati, i campioni che risultano p o canca positivi potrebbero non sempre risultare positivi per anticorpi specifici contro la mieloperossidasi (MPO) o la serina proteasi 3 (PR3). 4

5 4. Certi altri autoanticorpi, oltre agli ANA, potrebbero reagire con i neutrofili umani fissati in alcool. Questi anticorpi includono gli anti-muscolo liscio (actina) ed alcuni alloanticorpi come il Mart o l NB1. 15 Gli anticorpi anti-actina o anti-muscolo liscio reagiscono con il citoplasma dei neutrofili, ma dando un pattern della colorazione omogeneo piuttosto che a granuli grossolani, come normalmente accade con i canca. Gli alloanticorpi danno anche un pattern citoplasmatico, ma con una granulazione molto più fine se comparati ai canca e solo una percentuale esigua di cellule (in genere il 40% o meno) darà fluorescenza. 5. Occasionalmente i campioni possono risultare positivi a più di un solo autoanticorpo. Ad esempio ai c e p ANCA o agli ANCA più gli ANA. 6. Alcuni pazienti affetti da malattie infiammatorie intestinali o da colite ulcerosa presentano anticorpi reattivi ai neutrofili. 16 Questi campioni presentano un pattern panca su neutrofili fissati in etanolo con colorazione perinucleare molto accentuata. Se si utilizzano vetrini di neutrofili fissati in formalina, questi campioni appaiono generalmente negativi o presentano una fluorescenza citoplasmatica omogenea debole. 7. Se i vetrini non vengono maneggiati con cura durante la fase di colorazione, specialmente se vengono lasciati seccare, si può ottenere un pattern sbiadito ed una colorazione di fondo molto accentuata. 8. L utilizzo di reagenti provenienti da altri tipi di kit anticorpi alla fluorescenza (soprattutto i coniugati) potrebbe influenzare negativamente la sensibilità e la specificità dei vetrini di substrato di neutrofili fissati ad etanolo. 9. La sensibilità del test è influenzata da una serie di fattori esterni fra cui il tipo di microscopio a fluorescenza utilizzato, la forza e l età della lampadina, l ingrandimento utilizzato, il filtro utilizzato e l osservatore. 10. Se viene utilizzato un filtro a banda invece di un filtro barriera 515, si può osservare un numero maggiore di artefatti di colorazione. 11. Si dovrebbe utilizzare solamente una matita per marcare i vetrini. Qualunque altro tipo di materiale per scrivere può causare artefatti. 12. Le vaschette Coplin utilizzate per lavare i vetrini non dovrebbero contenere residui di colorante. L utilizzo di vaschette Coplin che contengono residui di colorante può causare artefatti. 13. I risultati di questo test devono essere valutati dal medico curante alla luce del quadro clinico del paziente e del risultato degli altri test sierologici. 14. Le prestazioni caratteristiche del test non sono state valutate per campioni diversi dal siero. 15. I vetrini venduti separatamente vengono classificati come Reagenti analita-specifici. Ad eccezione di un componente del kit NOVA Lite ANCA Kit, le caratteristiche analitiche e prestazionali non sono stabilite. Valori attesi Sono stati analizzati 115 campioni normali scelti in maniera casuale tramite i vetrini fissati ad etanolo NOVA Lite ANCA. Questi campioni non includevano soggetti pediatrici né soggetti anziani per via del fatto che si trattava di esami di soggetti in fase di assunzione al lavoro o test di dipendenti. I campioni provenivano da una combinazione casuale di soggetti maschili e femminili. Tutti e i 115 campioni sono risultati negativi ad una diluizione di screening di 1:20. Sono stati analizzati anche 45 pazienti affetti da Wegener, 39 da poliarterite microscopica, 20 da glomerulonefrite crescentica e pazienti affetti da una varietà di malattie del tessuto connettivo. I risultati sono riassunti nella seguente tabella: Gruppo di pazienti Numero di pazienti % positivi Normali scelti a caso Wegener (tutti canca) Poliarterite microscopica (tutti panca) Glomerulonefrite Crescentica (tutti panca) LES 27 7 (sia panca che canca) Sindrome di Sjögren 21 0 Sclerodermia 15 0 Polimiosite 6 0 I v e t r i n i N O V A L i t e ANCA sono stati comparati fianco a fianco con preparazioni di neutrofili citocentrifugate utilizzate di routine in un centro universitario di riferimento per gli ANCA. Sono stati analizzati 55 campioni di sieri positivi (23 canca, 28 panca, 4 atipici) e 14 ANCA negativi. Dei 55 campioni positivi, 54 hanno prodotto una configurazione di colorazione identica sui vetrini NOVA Lite ANCA. Un campione canca che presentava un titolo basso ha dato un risultato negativo sul vetrino INOVA. Tutti i 14 campioni ANCA negativi sono risultati negativi anche con i vetrini NOVA Lite ANCA. La titolazione dei 55 campioni positivi su entrambi i substrati ha prodotto lo stesso risultato oppure una differenza di doppia diluizione con 53 dei campioni analizzati. Gli altri 2 campioni differivano per 2 doppie diluizioni. Quarantotto campioni di siero scelti in maniera casuale sono stati inviati ad uno dei principali laboratori di riferimento americani per l analisi degli ANCA ed analizzati simultaneamente per gli ANCA utilizzando i vetrini NOVA Lite ANCA ed anche per anticorpi specifici MPO e PR-3 utilizzando i kit INOVA QUANTA Lite ELISA. I risultati sono riassunti nella seguente tabella. 5

6 Risultato IFA N. Campioni % ELISA Positivi MPO PR3 negativi panca canca c e panca atipici Otto campioni sono risultati negativi agli ANCA con l immunofluorescenza. Tutti e otto sono risultati negativi sia per gli MPO che per i PR-3 con l ELISA. I risultati agli MPO ed agli PR-3 variavano fra 1 e 5 unità, nettamente al di sotto della soglia di positività di 20 unità. Tredici campioni sono risultati panca positivi all IFA. Undici di questi sono risultati MPO positivi e nessuno è risultato PR-3 positivo. Ventuno campioni sono risultati canca positivi alla immunofluorescenza. Nessuno di questi campioni è risultato MPO positivo, mentre 20 dei 21 campioni sono risultati PR-3 positivi. Cinque campioni hanno dato entrambi i pattern p e c ANCA alla IFA. Quattro di questi sono risultati MPO positivi e nessuno PR3 positivo. Un campione ha dato risultato panca atipico. Questo campione era risultato negativo sia con il kit MPO che con il PR3. Conformità dei risultati ANCA ELISA rispetto a. IFA Malgrado gli MPO ed i PR3 siano antigeni principali che includono quelli che possono essere identificati come p e c ANCA, l utente dovrebbe essere a conoscenza del fatto che gli anticorpi diretti contro altri enzimi dei granuli primari dei neutrofili possano produrre pattern c e p ANCA alla immunofluorescenza su neutrofili fissati in alcool. Ciò vale soprattutto per gli anticorpi panca, dove almeno 3 altri autoanticorpi diretti contro antigeni diversi dal MPO possono produrre il pattern tipico dei panca all IFA. Per chiarire questo punto sono stati raggruppati i campioni provenienti dai pazienti affetti da Wegener, poliarterite microscopica e glomerulonefrite crescentica menzionati in precedenza, ed anche 48 campioni sottoposti ad indagine sierologica di routine per vasculite. I risultati derivati dalle analisi all immunofluorescenza con neutrofili umani fissati ad etanolo e con l ELISA appaiono qui di sotto. QUANTA Lite PR-3 IgG Sensibilità relativa 90,9% canca IFA Specificità relativa 98,8% Concordanza 95,4% QUANTA Lite MPO IgG Sensibilità relativa 61,0% panca IFA Specificità relativa 100% Concordanza 80,3% Dei 66 campioni positivi ai canca con l IFA, 6 sono risultati negativi ai PR3 ed 1è risultato positivo con l ELISA ma negativo con l IFA. Dei 77 campioni positivi ai panca con l IFA, 30 sono risultati negativi all esame ELISA specifico per gli MPO. Nessun campione risultato negativo ai panca con l IFA è risultato positivo all analisi ELISA per gli MPO. 6

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