1.INTRODUZIONE 1.1 FAMIGLIA DELLE NEUROTROFINE

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1 1.INTRODUZIONE 1.1 FAMIGLIA DELLE NEUROTROFINE Le neurotrofine rappresentano una famiglia di proteine che sembrano essere strutturalmente correlate. Esse sono richieste per lo sviluppo e in seguito la funzione del sistema nervoso dei vertebrati, agiscono direttamente sui neuroni dove sono in grado di controllare la sopravvivenza (prevengono la morte cellulare programmata), la differenziazione e la plasticità sinaptica di specifiche popolazione neuronali; inoltre hanno la capacità di aumentare la funzionalità neuronale in modelli animali con malattie neurologiche (Yuen, E. C., and Mobley, W. C. 1996), e potrebbero avere un ruolo nello sviluppo dei tumori neurali (Ryden, M., Sehgal, R., Dominici, C., Schilling, F. H., Ibanez, C. F., and Kogner, P. 1996). In figura: le neurotrofine controllano lo sviluppo di specifiche sottopopolazioni di neuroni sensoriali; NGF (linea nera) è necessaria essenzialmente per la sopravvivenza dei piccoli neuroni con assone amielinico o sottilmente mielinico, BDNF ha effetto sui meccano-recettori che terminano sulle cellule di Merkel (linea rossa), NT-4/5 è necessario per lo sviluppo delle cellule pilifere(linea verde), NT-3 supporta la sopravvivenza di molti neuroni DRG all inizio dello sviluppo(linea blu). 2

2 I geni che codificano per le neurotrofine presentano tutti un organizzazione comune, infatti questi geni codificano tutti per una pre-pro-proteina che viene trasportata al reticolo endoplasmatico, dove viene processata proteoliticamente a formare la proteina avente la struttura finale e matura della neurotrofina sintetizzata (Suter et al., 1991; Seidah et al., 1996). Le informazioni che ci vengono fornite dalla sequenza dei geni per le neurotrofine ci indicano come esse inizialmente vengano sintetizzate come precursori da kda.questi precursori presentano una sequenza segnale sulla parte N-Terminale idrofobica seguita da una regione contenente aminoacidi basici. Per formare quindi una neurotrofina matura viene effettuato un taglio proteolitico sulla proneurotrofina attraverso un sequenza consenso composta da coppie di aminoacidi basici che presentano questo motivo precursore (Bresnahan, 1990) Arg-Xaa-(Lys/Arg)-Arg, dove bisogna notare che Xaa sta per Ser per quanto riguarda pro-ngf e pro-nt-4/5, Val per quanto riguarda pro-bdnf e Arg per quanto riguarda pro-nt-3 (Seidah,1996). Il taglio proteolitico necessario per la formazione di neurotrofine mature e attive viene effettuato da enzimi facenti parte della famiglia delle serin proteasi chiamati convertasi. SIGNAL SEQUENCE PRO-SEQUENCE RXRR CC MATURE PROTEIN CCC C C AA AA ~120 AA 50% AMINO ACID IDENTITIES In figura la struttura lineare delle neurotrofine, dove la parte nera indica la sequenza segnale che contiene gli aa per la secrezione del fattore, la parte blu corrisponde alla pro sequenza e presenta il sito di taglio della pro-neurotrofina (RXRR) per la convertasi e infine la parte gialla corrisponde alla forma matura e attiva della proteina; le C indicano le cisteine che fanno parte del cystein knot motif. I monomeri di ogni neurotrofina condividono molte caratteristiche chimiche comuni: numero di basi simili ( aminoacidi) e anche grandezza molecolare simile (13,2-15,9 kda), sequenza primaria simile del 50% o anche di più, punto isoelettrico intorno a 9-10 e 6 cisteine conservate nelle stesse relative posizioni che permettono la formazioni di tre legami disolfuro intracatena. 3

3 Le neurotrofine, infatti, appartengono alla Cystine-Knot Superfamily, un grosso gruppo che ha in comune un core conservato contenente tre legami disolfuro intracatena. Tutti i fattori di crescita appartenenti a questo gruppo presentano β-sheet e mancano di un core idrofobico ben definito. Inoltre essi esistono tutti unicamente come dimeri; un ipotesi, infatti, afferma che la dimerizzazione di queste proteine è necessaria perché il protomero singolo non risulta abbastanza stabile, solo dopo la dimerizzazione si ha un core idrofobico sufficiente per la stabilizzazione della struttura proteica (White, F. A., Silos-Santiago, I., Molliver, D. C., Nishimura, M., Phillips, H., Barbacid, M., and Snider, W. D. 1996). I membri di questa famiglia sono: Nerve Growth Factor (NGF) Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) Neurotrophin-3 (NT-3) Neurotrophin-4/5 (NT-4/5) (Huang and Reichardt, 2001) Il segnale trasmesso da parte di queste neurotrofine e quindi la loro specifica attività dipende dall attivazione di tre differenti recettori tirosin-chinasici, più precisamente: TRK-A lega con alta specificità NGF (Kaplan et al.,1991) TRK-B lega maggiormente BDNF e NT-4/5 (Klein et al., 1991,1992) TRK-C lega con alta specificità NT-3 Inoltre tutte le neurotrofine sono in grado di legare con affinità simile il recettore p75ntr, un membro dei recettori TNF (Tumor Necrosis Factor). In figura la famiglia delle neurotrofine con i rispettivi recettori 4

4 1.2 FATTORE DI CRESCITA NERVOSO (NGF) L NGF è stata la prima molecola delle neurotrofine ad essere stata scoperta e ne è anche la più caratterizzata. Di seguito inizierò una breve descrizione della molecola, in questo modo, poiché tutte le molecole appartenenti alla famiglia delle neurotrofine sono strettamente correlate, avrò modo di parlare in generale anche degli altri membri delle neurotrofine. Storia Nel 1934 V. Hamburger descrisse gli effetti provocati dalla rimozione dell abbozzo di uno dei due arti inferiori in embrioni di pollo di tre giorni. L esame istologico alcuni giorni dopo l intervento rilevò una totale assenza di cellule motorie che al contrario in condizioni normali dovrebbero essere presenti. Hamburger interpretò i risultati come una mancata induzione da parte delle prime fibre nervose che avevano stabilito un contatto con i tessuti periferici sulle cellule indifferenziati del centro motorio. Nel 1940 Rita Levi Montalcini leggendo la ricerca di Hamburger riprese l esperimento analizzandolo con tecniche più precise e sofisticate. Dai risultati ottenuti da R. L. Montalcini si notò come in realtà la morte delle cellule motorie era dovuta a una mancanza di fattore trofico piuttosto che una mancanza di un fattore di tipo induttivo. Nel 1944 vennero pubblicati i risultati di queste ricerche in cui si prospettava l ipotesi che i tessuti periferici rilasciassero fattori umorali che servissero allo sviluppo delle cellule nervose preposte alla loro innervazione. Un ulteriore conferma di queste ipotesi avvenne nel 1952 con la scoperta che trapianti di Sarcoma 180 (tumore di tessuto connettivo di topo) nel pollo inducono un aumento dei gangli sensoriali e simpatici. Il tumore doveva rilasciare un fattore umorale che alterava i normali processi differenziativi delle cellule nervose simpatiche recettive alla sua azione, ora si trattava di riuscire a identificare il fattore stesso. Nel 1953 R. L. Montalcini con la collaborazione del chimico S. Cohen riuscì nell identificazione chimica della frazione tumorale attiva estratta dai tumori in una molecola nucleo-proteica che fu denominata Nerve Growth Factor; rimaneva da accertare se la funzione esplicata dalla molecole fosse effettuata dalla parte nucleica o proteica. Fu grazie agli esperimenti per l accertamento di quale delle due parti esplicasse la funzione attiva della molecola che si venne a scoprire una delle maggiori fonti di NGF. 5

5 Infatti per purificare la molecola dalla parte nucleica venne utilizzato del veleno di serpente che oltre alle numerose sostanze presenti in soluzione, contiene un enzima fosfodiesterasi che degrada gli acidi nucleici. L esperimento che utilizzava l estratto di tumore trattato con veleno di serpente mostrò come l alone di fibre nervose che irradiava dai gangli era centuplicato rispetto al solo utilizzo del fattore tumorale. Da questa nuova fonte di NGF venne ulteriormente isolato di nuovo il fattore di crescita in misura di gran lunga maggiore rispetto a quello estratto dal tumore. In seguito vennero effettuati anche studi sulle ghiandole salivari di topo come produttrici di NGF in quanto era l unico tessuto di topo che avesse un azione tossica simile a quella del veleno di serpente. Le ghiandole salivari di topo dimostrarono di essere la terza e più cospicua sorgente di NGF. Grazie alla scoperta di questa nuova sorgente di NGF facilmente reperibile (il topo per le sue minute dimensioni e la facilità di allevamento divenne l animale preferito per questo tipo di studi) si diede un forte impulso alle ricerche su questo fattore di crescita, si tratta ora di identificare la natura chimica e studiarne il meccanismo d azione. Funzioni Attività Neurotrofica: grazie alla scoperta di nuove fonti di NGF è stato possibile effettuare ricerche non solo su embrioni di pollo, ma anche su mammiferi neonati e adulti. Esperimenti effettuati su topi neonati per lo studio dell attività dell NGF hanno osservato che l iniezione sottocutanea di NGF purificato per un periodo di 10 giorni provoca un aumento dei gangli sinaptici para e prevertebrali più imponente di quello che avviene negli embrioni di pollo; si ha un aumento di volume pari a volte quello dei gangli di controllo dei topi neonati. Anche altre specie animali trattate con NGF confermano l ipertrofia e l iperplasia delle cellule sinaptiche con un imponente iperinnervazione degli organi e dei tessuti periferici. L esperimento chiave che servì a chiarire senza dubbi l attività neurotrofica del Nerve Growth Factor è stato effettuato nel L esperimento consisteva nel saggiare l azione di antisiero specifico diretto contro l NGF sullo strato di cellule nervose simpatiche. L antisiero preparato è stato iniettato in topolini tra il primo e il terzo giorno di vita; in seguito si è notato tramite ispezione istologica che i gangli sinaptici erano ridotti a noduli sclerotici consistenti di cellule gliali e di un numero esiguo di cellule nervose in avanzato stato atrofico. Quindi con l iniezione di anticorpo contro NGF si è ottenuta la distruzione di cellule nervose simpatiche. 6