La fluorescenza. fig.1. = hc proveniente da una sorgente esterna, come

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1 La fluorescenza Tutte le forme di issione di luce da parte di materiali sono chiamate luminescenza. Affinché il fenomeno avvenga, è necessario che una sorgente esterna fornisca al sista una quantità di energia sufficiente ad innescare l'issione luminosa. Differenti tipi di sorgente energetica definiscono, pertanto,differenti tipi di luminescenza.si può così parlare, ad espio, di elettroluminescenza, radioluminescenza, chiluminescenza e fotoluminescenza. In quest'ultima forma di luminescenza l'energia è fornita dall'assorbimento di radiazione elettromagnetica nello spettro compreso fra l'ultravioletto e l'infrarosso.nella fotoluminescenza vengono, infine, distinti due diversi processi: fluorescenza e fosforescenza.la fluorescenza è il risultato di un processo fisico in tre stadi successivi, che avviene in certe molecole(generalmente idrocarburi policiclici o eterocicli), chiamati per questo motivo fluorofori o fluorocromi. fig.1. Nel primo stadio del processo, un fotone di energia E = hc proveniente da una sorgente esterna, come una lampada a gas,un laser, ecc. viene assorbito dal fluoroforo in un tpo estramente breve, dell'ordine 15 di 10 ' secondi. La molecola viene così portata ad uno stato eccitato E, come risultato del trasferimento di un elettrone su di un'orbita di più alta energia. Questo processo distingue, ad espio, la fotoluminescenza dalla chiluminescenza, in cui lo stato eccitato della molecola chiluminescente è raggiunto grazie all'energia fornita da una reazione chimica. 9 8 Lo stato eccitato della molecola ha una vita media relativamente breve (tipicamente da secondi). In questo tpo il fluoroforo è soggetto ad un certo numero di possibili interazioni con l'ambiente circostante, che danno origine al secondo stadio del processo di fluorescenza: una parte dell'energia E' dello stato eccitato viene dissipata a causa di queste interazioni, portando l'elettrone su di un'orbita corrispondente ad un secondo stato eccitato di energia leggermente più bassa E. L'eccesso di energia corrispondente a questo secondo stato viene infine dissipato (terzo stadio del processo) tramite rilascio di un fotone di energia E = hc che riporta il fluoroforo allo stato fondamentale E 0. Questo fotone esso costituisce la luce di fluorescenza. Proprio a causa della dissipazione di energia che avviene durante la permanenza del fluoroforo nello stato eccitato,l'energia del fotone esso è più piccola di quella del fotone assorbito, e, di conseguenza, la lunghezza d'onda della luce di fluorescenza è più grande di quella della luce di eccitazione. La differenza fra l'energia del fotone di eccitazione e quella del fotone di issione è una delle proprietà fondamentali che caratterizzano un fluoroforo, è detto shift di Stokes. shift di Stokes = E - E e costituisce un parametro fondamentale soprattutto in relazione alla sensibilità della tecnica di fluorescenza, perchè un grande valore di esso consente la rivelazione della luce essa contro una luminosità di fondo molto più bassa, perchè più facilmente isolabile, con opportuni filtri ottici, dalla luce di eccitazione. Un'altra importante conseguenza di quei processi che fanno perdere energia al fluoroforo allo stato eccitato, è che alcuni degli elettroni che hanno assorbito un fotone ritornano direttamente allo stato fondamentale

2 attraverso processi non radianti, senza cioè ettere luce di fluorescenza. Fenomeni di questo tipo, come ad espio collisioni con altre molecole, portano quindi ad uno spopolamento dello stato eccitato. Una misura del peso relativo di questi processi è dato da un altro dei parametri fondamentali della fluorescenza che è il rapporto fra il numero dei fotoni di fluorescenza essi ed il numero di fotoni assorbiti. Questo parametro, che è evidentente un numero spre minore di uno, si chiama guadagno quantico. (quantum yield,qy in inglese) QY = N ( E ) / N ( E ) I fluorofori possono avere valori di QY compresi fra 0.1 e poco meno di 1. Un altro aspetto fondamentale del processo di fluorescenza consiste nella sua ciclicità. A meno che il fluoroforo non sia irreversibilmente deteriorato quando si trova allo stato eccitato lo stesso fluoroforo può essere ripetutamente eccitato, e ogni volta riettere fotoni di fluorescenza. Uno scha estramente splice come il diagramma di fig.1 potrebbe, in realtà, essere valido solamente se riferito ad un singolo atomo, mentre i fluorofori sono generalmente molecole poliatomiche. I livelli ' energetici discreti E ed E devono pertanto essere sostituiti da bande energetiche più o meno larghe, e le transizioni elettroniche discrete rappresentate da E ed E rimpiazzate rispettivamente da uno spettro di eccitazione ed uno spettro di issione della fluorescenza (fig.2). In generale lo spettro di issione della fluorescenza è indipendente dalla lunghezza d'onda di eccitazione, ma l'intensità di issione è proporzionale all'ampiezza dello spettro di eccitazione alla lunghezza d'onda di eccitazione. L 'utilizzo di lunghezze d'onda d eccitazione diverse (che diano comunque fenomeno di fluorescenza ), influisce quindi solamente sull ampiezza dello spettro di fluorescenza,ma non sulla lunghezza d onda caratteristica. Fig.2 Scha del passaggio da uno stato fondamentale (S0) ad uno stato eccitato (S1) e da questo di nuovo allo stato fondamentale. Ogni stato è rappresentato da un gruppo di linee orizzontali, ognuna delle quali rappresenta un livello vibrazionale.t1 è lo stato di tripletto. La distanza fra le linee orizzontali è proporzionale alla differenza di energia tra i livelli. I segmenti terminanti con una freccia rappresentano le transizioni, quelli ondulati rappresentano le transizioni che non producono issione di luce (Cantor and Schimmel, Biophysical Chistry). Altre importanti caratteristiche sono: La larghezza dello spettro è un altra delle caratteristiche di grande importanza delle molecole fluorescenti,

3 soprattutto nelle marcature multiple, cioè in quelle applicazioni in cui due o più fluorofori diversi sono utilizzati contporaneamente. Una combinazione ideale di fluorofori per marcatura multipla dovrebbe comunque avere, oltre a spettri di issione ben separati, anche un forte assorbimento alla stessa lunghezza d'onda di eccitazione. Abbiamo visto che l'efficienza del processo di issione è misurata dal guadagno quantico, QY. Dalla legge che descrive l'assorbimento delle sostanze in soluzione (Legge di Lambert-Beer), si ricava che l'efficienza del processo di assorbimento è generalmente misurata dal coefficiente di estinzione molare (a) del soluto. Ebbene, l'intensità di fluorescenza essa da ogni molecola del fluoroforo è proporzionale al prodotto delle due 3 5 grandezze QY ed a. I valori tipici di queste grandezze variano fra 5 10 e 2 10 cm 1 M 1 per a, e fra 0.05 e 1.0 per QY. Photobleaching: In condizioni di forte intensità della luce di stimolazione, la distruzione irreversibile del fluoroforo eccitato diventa il fattore limitante per la rivelazione della fluorescenza. Il rimedio più efficace contro il photobleaching è quello di massimizzare la sensibilità del sista di rivelazione, consentendo così la riduzione della potenza della sorgente della luce di eccitazione. Sensibilità della fluorescenza all'ambiente: interazioni fluoroforo-fluoroforo: Le interazioni tra fluorofori vicini o tra fluorofori e altre specie molecolari che li circondano rendono la fluorescenza sensibile all'ambiente. Si usa solitamente distinguere le interazioni delle molecole di fluoroforo fra loro dalle interazioni con gli altri componenti dell'ambiente,in particolare nel nostro caso dalle molecole del solvente. Self quenching: è uno dei fenomeni di interazione fra fluorofori legati alla concentrazione dei fluorofori stessi: è un processo bimolecolare che consiste nella riduzione del guadagno quantico, senza modificazioni dello spettro di issione, per effetto d interazioni transienti nello stato eccitato fra molecole dello stesso ionoforo (collisional quenching). Esso può anche portare alla formazione di specie non fluorescenti allo stato fondamentele. Un secondo fenomeno di questo tipo è costituito dalla formazione di eccimeri. Sono chiamati in questo modo dimeri del fluoroforo che si formano solamente allo stato eccitato, e che ettono con uno spettro diverso da quello del singolo fluoroforo.in genere compaiono ad elevate concentrazioni,ove si evidenzia la presenza di un secondo picco a maggior lunghezza d onda. Un terzo fenomeno di interazione fra fluorofori è costituito dalla cosidetta FRET, Fluorescence Resonance Energy Transfer, che consiste in un accoppiamento diretto fra l'issione di un fluoroforo e l'eccitazione di un secondo fluoroforo. E un'interazione fra gli stati eccitati di due molecole di fluoroforo, in cui l'eccitazione di una molecola donatore è trasferita ad una molecola accettore,senza issione di fotoni. La FRET dipende dall'inverso della sesta potenza della separazione intermolecolare, diventando molto evidente a distanze fra donatore e accettore dell'ordine di Å. Condizioni essenziali perchè possa avvenire la FRET sono: a) lo spettro di assorbimento dell'accettore deve essere in buona parte sovrapponibile allo spettro di issione del donatore. b) i dipoli di transizione del donatore e dell'accettore devono avere orientamento parallelo. Sensibilità della fluorescenza all'ambiente: interazioni fluoroforo-solvente: Per quanto riguarda le interazioni fluoroforo-solvente, sono due i fattori ambientali principali che influiscono fortente sulle caratteristiche della luce di fluorescenza. 1) Polarità del solvente. Lo spettro di issione di alcuni fluorofori,in particolare quelli che presentano un alto valore del momento di dipolo nello stato eccitato, può essere fortente influenzato dalla polarità del solvente, spostandosi verso lunghezze d'onda spre maggiori all'aumentare del grado di polarità del solvente. 2) PH del solvente. La sensibilità dei fluorofori al ph dipende da una alterazione della struttura dei livelli eccitati causata dalla protonazione della molecola. Altri effetti di concentrazione, dovuti all assorbimento (Lambert-Beer)

4 intensità ridotta-concentrazione intensità a 350 nm di ecc intensità a 466nm di ecc L intensità di issione di fluorescenza dipende dalla concentrazione, ma non sarà in genere ad essa proporzionale, a differenza dell assorbanza, in quanto dipende anche dal QY che a sua volta è influenzato dal contorno chimico, in particolare dalla distanza di ogni molecola fluorescente dalle altre e quindi in ultima analisi dalla concentrazione. Infatti se all aumentare della concentrazione aumenta la radiazione assorbita, è anche vero che aumentano contporaneamente le interazioni mutue, così che molti fotoni di fluorescenza essi, vengono riassorbiti all interno della soluzione stessa. L intensità di issione di fluorescenza sarà dunque data da entrambi questi fattori. Lo spettrofluorimetro Gli spettri di fluorescenza si ottengono con lo spettrofluorimetro. Il principio di funzionamento di uno spettrofluorimetro è mostrato in fig.3. La luce prodotta dalla lampada ad ultravioletti (L) viene focalizzata sull ingresso di un monocromatore (M1) che seleziona la lunghezza d onda desiderata.il fascio monocromatico colpisce il campione (S) posto nel comparto celle.la composizione cromatica della luce essa viene analizzata dal secondo monocromatore (M2) e l intensità dal fotomoltiplicatore (PM).Il secondo monocromatore è posto a 90 rispetto al primo,per minimizzare l entrata della luce diretta della sorgente. fig.3 Sorgente

5 La sorgente è costituita da una lampada, la quale deve ettere una radiazione più possibile costante e riproducibile. Per lavorare nella regione UV si usano lampade al deuterio le quali ettono in modo continuo al di sotto dei 400 nm. Monocromatori Eccitazione (M1): la luce policromatica essa dalla lampada entra da una fessura; tramite un sista ottico viene inviata su di un reticolo di diffrazione o ad un prisma che scompone il fascio. Una seconda fenditura raccoglie poi il fascio di una determinata lunghezza d'onda ed invia la radiazione verso il campione. Emissione (M2): Un anologo monocromatore ci permetterà di selezionare, tra la luce essa dal campione, l intervallo di lunghezze d onda da inviare all acquisizione. Vano portacampione Qui mettero il campione. Generalmente la luce di fluorescenza sarà raccolta a 90 rispetto all eccitazione. Fotomoltiplicatore e sista di elaborazione Trasforma il segnale luminoso in un segnale elettrico. Lo strumento elabora quindi i dati ottenuti. E possibile scegliere fra varie modalità di gestione dello spettrofluorimetro, quali: modalità in issione ed in eccitazione.nella prima,fissata la lunghezza d onda di eccitazione,si analizza lo spettro di issione.nella seconda si fissa la lunghezza d onda in cui si osserva l issione e si fa variare quella di eccitazione.in ogni modalità è possibile intervenire su diversi parametri,come: banda passante del monocromatore, la risoluzione, il tpo di risposta,l amplificazione del segnale,la scala e l intervallo di lunghezze d onda da analizzare.lo spettro viene poi graficato da un plotter. MATERIALI: Cuvette rettangolari di lato di 1 cm pipette graduate acqua distillata Rodamina La sostanza fluorecente utilizzata per tutte le prove è la rodamina 6G,di formula molecolare C28H31N2O3Cl e peso molecolare g/mol,la cui formula di struttura è la seguente: A tperatura e pressione ambiente si presenta allo stato solido e non presenta fluorescenza,è solubile in solventi come l acqua ed etanolo. A concentrazione non troppo elevate si ha un picco di assorbimento in corrispondenza di λ=530 nm ed un picco di fluorescenza in un range compreso tra 555nm e 585nm,con valore massimo d intensità per 566nm. Esistono altre forme di rodamina(b,123,ecc) aventi la stessa formula bruta,ma diversa disposizione spaziale della struttura,e range di fluorescenza ed assorbimento leggermente diversi.