Corso di Laboratorio di Biofotonica

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1 SAPIENZA Università di Roma Laurea magistrale in Ingegneria delle Nanotecnologie A.A Corso di Laboratorio di Biofotonica Prof. Francesco Michelotti SAPIENZA Università di Roma Facoltà di Ingegneria Civile e Industriale francesco.michelotti@uniroma1.it

2 LEZIONE 3 Spettroscopia di emissione di molecole organiche e Fluorofori più utilizzati nel campo biologico

3 Spettroscopia di luminescenza Studia l emissione di r.e.m. da parte del sistema molecolare in funzione della lunghezza d onda. Sorgente hn 2 E 2 E 1 d 0 (n) hn 1 hn 3 E 0 In emissione valgono le stesse regole di selezione dell assorbimento: Momento di dipolo di transizione non nullo Conservazione dello spin L eccitazione avviene normalmente ad una singola l (lampada+monocromatore, laser) e la rivelazione è ad un angolo diverso da quello di eccitazione.

4 Spettroscopia di luminescenza v =2 v =1 v =0 v =2 v =1 v =0 v=2 v=1 v=0 1) In generale il livello S e2 eccitato può decadere : S e2 S e1 Te1 v =2 v =1 v =0 S g non radiativamente sul livello di singoletto S e1 non radiativamente sul livello di tripletto T e1 2) Il livello S e1 può decadere radiativamente su S g 3) Il livello T e1 non potrebbe decadere su S g ma vi è una piccola probabilità introdotta dal fatto che la debole interazione spin-orbita mescola gli stati di spin. La transizione è molto poco intensa. La transizione S e1 S g dà luogo a FLUORESCENZA La transizione T e1 S g dà luogo a FOSFORESCENZA

5 Spettroscopia di luminescenza L intensità del processo di emissione viene caratterizzato dalla resa quantica di fluorescenza definita come: N N fot fot ( emessi) ( assorbiti) L intensità del processo di emissione dipenderà poi da: Assorbanza della specie alla l di eccitazione Intensità della r.em. Incidente alla l di eccitazione

6 Spettroscopia di luminescenza - Fluorescenza S e2 DE(S e2 -S e1 )<<DE(S e1 -S g ) S e1 T e1 S g Alexa Fluor 405 Per quasi tutte le molecole è possibile l assorbimento da S g a diversi stati eccitati S e1, S e2, L emissione radiativa ha luogo solo da S e1 a S g (regola di Kasha) dal momento che è tanto più probabile quanto maggiore è la distanza in energia tra i due stati elettronici di singoletto. Di conseguenza lo spettro di emissione non cambia in funzione della l di eccitazione.

7 Spettroscopia di luminescenza - Fluorescenza L assorbimento di r.e.m. porta la molecola in stati vibrazionali dello stesso stato elettronico eccitato. Il decadimento avviene con due processi sequenziali: 1) Rilassamento vibrazionale non radiativo con perdita di energia per decadimento termico 2) Emissione radiativa da S e1 a S g a partire dallo stato vibrazionale fondamentale di S e1.

8 Spettroscopia di luminescenza - Fluorescenza Il principio di Franc e Condon si riflette nella simmetria degli spettri di assorbimento e di emissione. Lo spostamento del picco di emissione rispetto a quello di assorbimento viene denominato Stoes shift, in analogia a quello osservato nella spettroscopia Raman. 648nm, 1.91eV 625nm, 1.98eV Ossazina 1

9 Altri meccanismi di transizione tra livelli molecolari I processi di assorbimento, fluorescenza, decadimento non radiativo che abbiamo descritto sono una parte di quelli possibili tra i livelli energetici di una molecola. Il Diagramma di Jablonsi li riassume, insieme ai seguenti altri processi: Conversione interna Intersystem crossing Fosforescenza Quenching I tempi caratteristici sono inversamente proporzionali alla probabilità dei vari fenomeni.

10 Altri meccanismi Conversione interna Processo in cui la molecola perde energia attraverso una catena di due processi che coinvolge il trasferimento di energia ai sottolivelli vibrazionali dello stato elettronico inferiore e la conseguente diseccitazione degli stessi. Avviene con cessione di calore all intorno della molecola. Si divide in due parti: E S e1 S e2 RV RV - Rilassamento vibrazionale Decadimento nei livelli vibrazionali dello stesso stato eccitato CI R CI - Conversione interna Decadimento nei livelli vibrazionali di un altro stato elettronico. Per avere conversione interna è necessario che vi sia una sovrapposizione tra le funzioni d onda vibrazionali nei due stati elettronici interessati

11 Altri meccanismi Inter system Crossing La regola di selezione che prevede che le transizioni possono avvenire solo tra stati con uguale momento di spin totale può essere violata se si ha un interazione spin orbita sufficientemente forti da accoppiare tali stati. Può allora avere luogo una transizione non radiativa tra stati S e stati T con variazione dello spin totale. S e2 S e1 T e1 S e0

12 Altri meccanismi Fosforescenza Lo stato eccitato di tripletto può decadere allo stato fondamentale di singoletto per emissione radiativa. Il processo è molto poco probabile quindi avviene in tempi molto lunghi ( secondi ). Dal momento che la distanza in energia tra lo stato T e1 e lo stato S eo è inferiore a quella tra S e1 e S e0 lo spettro di fosforescenza è spostato ad energie/lunghezze d onda minori/maggiori. S e2 S e1 T e1 S e0 Difluoroboron Dibenzoylmethane-Polylactide

13 Altri meccanismi Quenching La probabilità di avere emissione di fluorescenza dallo stato S e1 allo stato S e0 può essere influenzata da altri meccanismi che portano ad una diminuzione della resa quantica di fluorescenza dal momento che forniscono ulteriori canali non radiativi di diseccitazione. La resa di fluorescenza può essere espressa in termini di probabilità di transizione nel seguente modo: N N fot fot ( emessi) ( assorbiti) R R NR 1 con IFL In cui R e NR sono le probabilità di emissione radiativa e non radiativa rispettivamente. S e2 S e1 R NR T e1 Vi sono vari meccanismi che danno luogo a quenching: Reazioni nello stato eccitato Inter system crossing Formazione di complessi Collisioni Forster energy transfer S e0 Il meccanismo di quenching di gran lunga più importante per le applicazioni in imaging è il Forster Transfer.

14 Altri meccanismi Forster transfer (Quenching) Una molecola (M) può diseccitarsi trasferendo la propria energia ad una seconda molecola (Q) mediante il meccanismo non radiativo del Forster transfer. Il processo può dar luogo ad un intenso canale di diseccitazione e causare una forte diminuzione della resa quantica di fluorescenza. La seconda molecola viene detta quencher. Tipicamente avviene se la distanza tra le molecole scende sotto i 10nm. S e1 S e0 (M) (Q) S e1 S e0 Se il quencher (Q) è luminescente può riemettere con spettro diverso da quello della molecola M S e1 S e0 (M) (Q) S e1 S e0 Se il quencher è non luminescente può dissipare l energia in modo non radiativo

15 Altri meccanismi Forster transfer (Quenching) Il processo Forster transfer avviene attraverso lo scambio di un fotone virtuale tra la molecola fluorescente e il quencher, durante il quale i sistemi possono scambiare energia. Separando il meccanismo di Forster transfer dagli altri processi non radiativi si ha: FT N N fot fot ( emessi) ( assorbiti) R R NR FT con FT I FL FT Si ottiene quindi che il rapporto delle intensità di fluorescenza senza e con Forster transfer è dato da: I I FL FT FL R NR FT 1 FT R NR R FT NR

16 Altri meccanismi Forster transfer (Quenching) L efficienza FT dipende da alcuni fattori che si possono raggruppare in: Distanza donore-accettore Sovrapposizione dello spettro di emissione del donore e di quello di assorbimento dell accettore Orientazione relativa di donore e accettore FT dipende dalla distanza donore-accettore (interazione dipolo-dipolo) come: FT 1 FT R FT NR Dove la distanza R 0 di Forster dipende dall integrale di sovrapposizione degli spettri J, da un fattore di orientazione relativa dei dipoli, e dall indice di rifrazione del mezzo n (N A numero di Avogadro): FT 9(ln10) J 2 6 R n N A 1 1 ( r / R 0 ) 6

17 Spettri di fluorescenza di cromofori endogeni Esempio Amminoacidi Fenilalanina (Phe) Tirosina (Tyr) Triptofano (Trp)

18 Spettri di luninescenza di cromofori esogeni Esistono un gran numero di cromofori organici che vengono utilizzati per marcare i componenti biochimici di base. Essi hanno particolari proprietà di assorbimento e luminescenza. ESEMPIO Coloranti tradizionali

19 Spettri di luminescenza di cromofori esogeni ESEMPIO Cianine Basati sul gruppo indolo parzialmente saturo con due unità aromatiche. Connessione tramite un ponte alche-nico di lunghezza variabile Spettri di assorbimento ed emissione simili a quelli dei cromofori tradiziona-li Solubilità in acqua accresciuta Meno sensibili a ph ed ambiente organico Alta fotostabilità Alta resa quantica

20 Spettri di luminescenza di cromofori esogeni ESEMPIO Alexa Fluor Derivati dal colorante organico più diffuso, la Rodamina Maggiore resa quantica Ottima solubilità in acqua Insensibili a variazioni di ph Elevatissima fotostabilità

21 Spettri di luminescenza di cromofori esogeni ESEMPIO Green Fluorescent Protein (GFP) E una proteina espressa nella medusa Aequorea Victoria. Grazie alla sua proprietà di fluorescenza, alle sue modeste dimensioni e alla possibilità di modificarne entro certi limiti le caratteristiche spettroscopiche, la GFP è diventata negli ultimi decenni un diffuso strumento per esperimenti e tecniche di biologia molecolare. L'assorbimento ha dei picchi con radiazioni a lunghezze d'onda di 395 nm e 475 nm. L'emissione ha un picco intorno a 505 nm. In genere sono utilizzate per l'assorbimento radiazioni blu (475nm), per evitare i rischi legati all'uso di raggi UV. La GFP è costituita da 238 amminoacidi e ha un peso molecolare di Dalton. È costituita da 11 foglietti beta disposti in circolo a formare una struttura denominata barileβ (β-barrel o β-can). Sono poi presenti due segmenti ad alfa elica, uno alla base del barile, l'altro lungo il suo asse centrale. Quest'ultima elica contiene il fluoroforo (ovvero la porzione in grado di emettere fluorescenza), formato a partire dal tripeptide Ser 65-Tyr 66-Gly 67. La struttura, nel complesso, è molto compatta, in modo da proteggere il fluoroforo da reazioni con altre molecole che lo potrebbero inattivare.

22 Spettri di luminescenza di cromofori esogeni ESEMPIO Green Fluorescent Protein (GFP) A causa del suo potenziale per appicazioni a largo spettro e per venire incontro a nuove esigenze di ricerca sono stati sviluppati molti mutanti della GFP caratterizzati da spettri di luminescenza differenti. Nobel per la Chimica 2008, M.Chalfie, O.Shimomura, R.Y.Tsien

23 Decadimento temporale della luminescenza Tempo di vita - Il tempo per il quale una molecola rimane in uno stato eccitato prima di decadere radiativamente o non. Dipende dalle caratteristiche dei livelli e dall interazione con l intorno. E inversamente proporzionale alla somma delle probabilità di transizione. Sperimentalmente si misura seguendo l andamento temporale del segnale di luminescenza di un numero grande N di molecole in seguito ad un eccitazione molto veloce. Se si considera un sistema e due livelli (fondamente e eccitato) il numero di molecole nello stato eccitato viene descritto dall andamento: N e ( t) N e (0) e t / t e t e : tempo di vita

24 Decadimento temporale della luminescenza L intensità di fluorescenza è proporzionale alla variazione nel tempo del numero di molecole eccitate: I FL dn dt e( t) Ne(0) t / t t e e e S 1 t<0 S 1 t=0 S 1 t>0 hn hn S 0 S 0 S 0

25 Decadimento temporale della luminescenza Il tempo di vita dipende da tutti i possibili canali di decadimento dallo stato eccitato a quello fondamentale. In assenza di quenching si ha: NR Si definisce tempo di vita radiativo t R : t e t R 1 R 1 R Il tempo di vita radiativo si può ricavare dalla misura contemporanea di resa quantica e del tempo di vita: S 1 S 0 t>0 hn R R NR t e t R t R t e

26 Decadimento temporale della luminescenza I tempi di vita caratteristici per gli stati eccitati sono: S e2 10fs-10ps 1ns-1ms S e1 T e1 1ps-10ns 100ns-1s S e0 1ps-100ps

27 Decadimento temporale della luminescenza 1) In presenza di quenchers di fluorescenza il tempo di vita risulta funzione della concentrazione dei quenchers: t Q e 1 [ Q] Esso diminuisce all aumentare della concentrazione dei quenchers: R NR Q NR t t e Q e R NR R NR Q NR [ Q] 1 R Q NR NR [ Q] 2) Per un sistema più complesso del semplice sistema a due livelli l andamento del decadimento può essere multiesponenziale. Ad esempio se vi sono più specie molecolari che emettono, se I fenomeni di quenching influenzano solo alcuni siti fluorescenti, se vi sono fenomeni di aggregazione. I /, ) t t e i t A e t : FL( i e, i i tempo di vita della specie i - esima

28 Decadimento temporale della luminescenza ESEMPIO Decadimento esponenziale della luminescenza di Ossazina 1 data file: lum-sol.epl Luminescence Intensity a.u l exc =640nm OXA1/MAA Sol.N 3, data file: oxa-l-3.prf, t=1.2 ns OXA1/PMMA/MAA Sol.N 4, datafile: oxa-l-4.prf, t=1.4 ns OXA1/MAA Solution, data file: oxa-l-0.prf, t=1.4 ns t psec Ossazina 1

29 Decadimento temporale della luminescenza ESEMPIO Variazione del tempo di decadimento della GFP in funzione dell ambiente in cui si trova

30 Solvatocromismo Gli spettri di assorbimento ed emissione di una molecola cambiano a seconda della polarità del solvente. Dal momento che le polarità degli stati eccitato e fondamentale sono differenti, il cambiamento della polarità del solvente dà luogo ad un cambiamento della gap di energia HOMO-LUMO. La molecola nell eccitazione varia istantaneamente il suo momento di dipolo. Il solvente impiega un tempo breve ( ps) rispetto al tempo di vita di stato eccitato a riarrangiarsi attorno alla molecola eccitata. Le variazioni nella posizione, intensità e forma degli spettri possono essere una misura diretta dell interazione tra molecole del solvente e del soluto. + _ + _ hn A + _ e + _ Franc Condon R g costante g + _ + _ + _ + _ + _ + _ e g + _ hn E + _

31 Solvatocromismo

32 Photobleaching Il Photobleaching è la distruzione fotochimica di un fluoroforo. In microscopia può complicare l osservazione di molecole fluorescenti dal momento che queste possono essere distrutte dall elevata illuminazione necessaria per l osservazione. I fluorofori possono eseguire un numero finito di cicli di eccitazione/diseccitazione prima di distruggersi. A seconda dei materiali, I fluorofori possono assorbire/emettere un numero massimo di fotoni diverso da tipo a tipo e hanno un tempo di vita differente. ESEMPI (supponendo un rate di 10 5 fotoni/s) Green fluorescent protein: cicli; s Tipico colorante organico: ; 1-10 s CdSe/ZnS Quantum dot: 10 8 ; > 1000 min NOTA Il termine tempo di vita non deve essere confuso con il tempo di vita dei livelli molecolari misurato nel corso di esperimenti di luminescenza risolta in tempo.