B Cell Receptor: Attivazione del linfocita B maturo. Mauro Sbroggiò

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1 B Cell Receptor: Attivazione del linfocita B maturo Mauro Sbroggiò

2 T1 B Immaturo MZP GC FO Mem MZ MILZA PC

3 Attivazione del BCR B immaturo B maturo Proliferazione/ maturazione Apoptosi Proliferazione/ sopravvivenza apoptosi anergia Anergia Editing recettore L effetto dell attivazione dipende da: Stadio maturativo della cellula Microambiente in cui si trova le cellula durante la stimolazione Tipo di recettore espresso dal linfocita Antigene riconosciuto dal recettore

4 CD21 Syk Csk Lyn CD45 Lyn Igα/β Igα/β CD19 CD81 Linfocita B maturo - Assenza di Ag CD45: mantiene Lyn de-repressa Csk: Fosforilazione inibitoria delle PTKs Entrambe localizzate in prossimità dei BCR inattivi

5 Ag CD21 Csk CD45 CD22 FcγRIIB Vav CD19 CD81 SHP1 Lyn Syk PI3K Lyn Lyn Interazione con Ag - Inizio segnalazione Aggregazione dei BCR Attivazione di Lyn/Syk Fosforilazione dei domini ITAM di Igα/β Localizzazione dei BCR nei lipid rafts (corecettori e molecole accessorie) CD19: attiva Lyn, recluta PI3K e VAV CD21: recettore per la componente C3d del complemento CD81: tetraspannin CD22 e FcγRIIB: regolazione negativa del segnale

6 Ag Cbl PI3K Gab BCAP Syk Lyn PI(4,5)P2 CD19 PIP 3 PI3K Vav PI3K Lyn Attivazione di PI3K e produzione di PIP3

7 Ag Propagazione del segnale PIP 3 PI3K PI(4,5)P2 Lyn Syk Btk SOS Shc Grb2 Vav Rac BLNK SOS Nck Rho Grb2 BLNK SOS PLCγ2 PI(4,5)P2 DAG Akt IP3 [Ca ++ ]i Citoschel. Ras

8 Ag Integrazione del segnale PIP 3 PI3K PI(4,5)P2 Lyn Syk Btk SOS Shc Grb2 Vav Rac BLNK SOS Nck Rho Grb2 BLNK SOS PLCγ2 PI(4,5)P2 DAG Akt IP3 [Ca ++ ]i Bad Bcl-xL MEKKs Citoschel. Ras PKC CaM PKC p38 MKKs JNK Raf Mek Carma1 IKK CaMK NFAT Erk NFkB Proliferazione Class Switch Somatic Hypermutation

9 Linfocita B attivato B memoria (difesa a lungo termine) Plasmacellula (produzione Ab) Per ogni BCR finora selezionato, verrà prodotto una popolazione clonale di cellule con un recettore diverso da quello della cellula da cui originano

10 La diversità del repertorio anticorpale primario è generata da: Riarrangiamento VDJ delle catene pesanti Riarrangiamento VJ delle catene leggere Accoppiamento casuale di catene leggere e pesanti. Costituito da IgM a bassa affinità per l Ag. Stimolazione indotta dall Ag: Produzione di anticorpi ad alta affinità. Cambio di classe (switch isotipico). Ig Somatic Hypermutation (SHM) Class switch DNA recombination

11 Entrambe i processi avvengono in microambienti specializzati: Centri germinali. SHM CSR Diversificazione della forza di legame Cambiamento della regione costante della catena pesante Selezione clonale e maturazione dell affinità. Cambiamento della funzione effettrice dell Ab

12 Somatic Hypermutation Avviene nei centri germinali. Il linfocita B maturo incontra l Ag. Aggregazione dei BCR prolungata. È necessaria la presenza di linfociti T. Da origine: BCR ad affinità maggiore BCR autoreattivi o a bassa affinità Selezione positiva Selezione negativa B memoria Plasmacellula Apoptosi Anergia Receptor editing È necessaria l attività dell enzima AID (activation-induced deaminase)

13 Somatic HyperMutation Mutazioni puntiformi (sostituzioni): circa 1 mutazione ogni divisione cellulare Colpisce regione VDJ (1-2Kb) Richiede inizio della trascrizione Preferenza per sequenza target RGY(W) con R=A o G, Y=C o T, W=A o T Elevata frequenza mutazioni nella regione CDR Non è richiesta l attività di RAG1-RAG2

14 Somatic HyperMutation T CD40L CD28 B CD40 CD86/80 AID X Deaminazione diretta Double-Strand Breaks (DSB) Deaminazione da dc a du (AID) Generazione sito abasico (UGD) Introduzione nucleotide mismatch Rottura del doppio filamento Generazione estremità protruding (AID): - editing mrna endonucleasi - deaminazione diretta del DSB Riparazione DSB

15 HSM: Lesione del doppio filamento e riparazione del danno Lesione (blunt-end) DNA regioni VDJ (sequenze RGWY) AID genera resected-ends DNA polimerasi error-prone introduce mutazione DNA ligasi unisce le estrimità X X AID genera resected-ends Rad52 lega le estemità Rad52 recluta Rad51 che media HR DNA polimerasi error-prone introduce mutazione X X

16 Class-Switch Recombination Necessaria attivazione BCR Richiede attivazione della trascrizione nella regione bersaglio Dipendente dall attività di AID Indipendente da RAG1-RAG2 Non esistono sequenze consenso La ricombinazione avviene tra due regioni dette S region Chaundhuri and Alt, 2004 Nat. Rev. Immunol.

17 Attivazione della trascrizione lungo la regione S Indotta da stimoli di specifiche citochine Inizia a monte dell esone I Termina a valle del corrispondente gene C H Il trascritto primario è sottoposto a splicing Chaundhuri and Alt, 2004 Nat. Rev. Immunol.

18 Ruolo della trascrizione in CSR: Rende accessibile la cromatina in prossima della regione S Genera strutture di DNA che fungono da substrato per gli enzimi coinvolti Il trascritto si associa con il DNA stampo (ibrido DNA-RNA) Ibrido DNA-RNA forma strutture particolari che generano un filamento ssdna R-loops AID si associa al ssdna in queste regioni Stem loop (regioni palindromiche) G-quartet Deaminazione e lesione del DNA Chaundhuri and Alt, 2004 Nat. Rev. Immunol.

19 Double Strand Break in CSR L azione di AID, seguita da UNG, produce un sito abasico Vengono prodotte estremità protruding nel punto di DSB Una polimerasi error-prone ricostituisce le estermità blunt. Chaundhuri and Alt, 2004 Nat. Rev. Immunol.

20 Modello di Class Switch Recombination Trascrizione nelle regioni S coinvolte Produzione di strutture R-loop Deaminazione sul ssdna ad opera di AID Formazione di lesioni sul doppio filamento Sinapsi delle regioni S coinvolte Unione delle estremità attraverso NHEJ Chaundhuri and Alt, 2004 Nat. Rev. Immunol.

21 Bibliografia: Chaundhuri J and Alt F. Class-switch recombination: interplay of trancription, DNA deamination and DNA repair. Nat Rev Immunol. 4: (2004). Wu X et al. Immunoglobulin somatic hypermutation: doble strand DNA breaks, AID and error prone repair. J Clin Immunol. 23: (2003). Dal Porto JM et al. B cell antigen receptor signalling 101. Mol Immunol. 41: (2004). Cooper MD. Exploring lymphocyte differentiation pathways. Immunol Rev. 185: (2002). Cariappa A and Pillai S. Antigen-dependent B-cell development. Curr Opin Immunol. 14: (2002). Cancro MP and Kearney JF. B cell positive selection: road map to the primary repertoire? J Immunol. 173: (2004). Niiro H and Clark EA. Reulation of B-cell fate by antigen-receptor signals. Nat Rev Immunol. 2: