31/05/2007. Omologia. Evoluzione: Mutabilità e Selezione Naturale. Similarità. Sequenze omologhe sono sempre simili?

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1 . 31/05/2007 Evoluzione Molecolare e omologia Evoluzione Molecolare e omologia Evoluzione: Mutabilità e Selezione Naturale Le sequenze degli organismi attuali hanno avuto origine dall evoluzione di sequenze ancestrali Le sequenze genomiche cambiano continuamente in modo casuale L ambiente seleziona gli individui in base al loro fenotipo Se il prodotto del gene modificato non è funzionale (perde struttura o funzione) l individuo muore e la modifica non si trasmette Omologia Due sequenze sono dette omologhe se hanno un ancestore comune Ortologhe in due specie differenti Paraloghe all interno della stessa specie (duplicazione genica) Similarità Due sequenze sono dette simili se condividono buona parte della sequenza (molti amminoacidi uguali o simili): concetto NON evolutivo, ma di confronto tra sequenze NB. Le mutazioni sono casuali? Almeno la loro velocità, non sempre: SOS polimerasi di Radman Omologia e Similarità Sequenze omologhe sono sempre simili? Dipende dal grado di divergenza Identità di sequenza e identità strutturale Quando la similarità di sequenza implica similiarità strutturale? Sequenze simili sono sempre omologhe? Sequenze differenti possono essere evolute convergentemente verso sequenze simili (es., non su sequenze, ali di uccelli e ali di pipistrello sono evoluzioni convergenti, a partire da da rettili e da mammiferi) Di principio similarità e omologia non coincidono esattamente. Tuttavia se due sequenze sono molto simili sono probabilmente omologhe. Per ora misuriamo la similarità in termini di identità di sequenza Identità di sequenza e identità strutturale Identità di sequenza e identità strutturale Fino a quanto due sequenze simili danno strutture uguali? of backbone atoms in core Rmsd o Percent identical residues in core tion of residues in core with RMSD < 0.1 nm Fract Chothia, C. & Lesk, A. M. (1986). The relation between the divergence of sequence and structure in proteins. EMBO J. 5, Percent identical residues in core 2 proteine sono sovrapposte e si esamina la percentuale di identità nel nucleo sovrapposto Proteine con identità maggiore del 60% hanno il 90% dei residui sovrapposti a meno di 0.1 nm di sequenza (%) Identità d identity Identità di sequenza implica identità strutturale Identità di sequenza NON implica identità strutturale Numero di residui allineati Rost B (1999). The twilight zone of protein alignments. Protein Engineering 12,

2 . 31/05/2007 Identità di sequenza e identità strutturale Quindi due sequenze più lunghe di 100 residui, che condividano il 30 % dei residui, hanno struttura simile Identità di sequenza e identità strutturale Per sequenze più lunghe di 100 residui Per sequenze più corte la percentuale di identità deve essere più alta Questo NONN implica che sequenze con identità minore abbiano strutture differenti Esempio: Mioglobina di capodoglio e emoglobina batterica: RMSD = 0.19 nm, Identità: 14% Midnight zone: Twilight zone: alto numero di falsi contiene la maggior positivi i parte delle proteine (sequenza simile strutturalmente simili struttura diversa) Safe zone: nessun falso positivo tutte tt le sequenze simili hanno la stessa struttura 20% 30% Percentuale di identità Identità di sequenza e funzione Il limite di identità che determina la stessa funzione è più difficile da stabilire e dipende criticamente dalla definizione di funzione. Per enzimi, la classe funzionale maggiore (ossidoreduttasi, isomerasi, ligasi, liasi.) viene conervata per sequenze con più del 30% di identità. La funzione più specifica richiede il 60% di identità istidase [1B8F] Aspartase [1JSW] δ2-crystallin [1AUW] - CO 2 + N3 N N - CO 2 N N + N 3 - CO2 O C N3 + O - - O2C - CO2 + N3 Avian eye lens protein Dati: Torsten Schwede Università di Basilea Allineamento di sequenze Problema: date due sequenze, confrontarle in modo da rilevare la loro similarità Definire una distanza tra le sequenze Cercare un algoritmo per trovare l allineamento a minima distanza Studiare metodi per validare la significatività dell allineamento Qualieventiconsideriamo? Distanza tra sequenze Mutazione Va definito un punteggio per la sostituzione dell amminoacido i con l amminoacido j Matrici di sostituzione s(i,j) A: ALASVLIRLITRLYP B: ASAVLNRLITRLYP i i Score( A, B) = s( A, B ) La matrice di sostituzione riflette se una mutazione è mediamente compatibile col folding e col mantenimento della funzione 2

3 Identità e similarità Nucleotidi: identità AGGCTGACCTGGGAAGGGAAACTCTCAAAACCAT AGGATGAGCT-GGAAGGATA-CTCTCAAAAACAT *** *** ** ******* ** ******** *** Amminoacidi: identità + somiglianza VLSSADKTNVKAAWGKVGAAGEYGAEALERMFL VLSAADKANIKAAW-KVGGQAGDGAEALERMPL ***:*** *:**** ***: **: ******** * Derivazione degli score da allineamenti di sequenze omologhe Vogliamo misurare la probabilità di mutazione di ogni tipo di amminoacido in un insieme di sequenze omologhe Date (molte) coppie di sequenze correlate, misuriamo la frequenza della sostituzione i A ->j B o i B ->j A (indipendente dalla direzione): P ij Es: A: ALASVLIRAILRLYP B: ALAVLLNRLILRALP P(A,A)= N(A A,A B )/N = 2/15 P(A,L)= P(L,A)= [N(L A,A B )+N(A A,L B )]/N = 2/15 La sostituzione è significativa? Qual è la probabilità che la sostituzione i->j sia casuale (e quindi non significativa)? Es: 1 insieme di sequenze omologhe A: ALASVLIRAILRLYP B: ALAVLLNRLILRALP 2 insieme di sequenze omologhe A: LLLLAALLLALLALL B: LALLAALLAALLALL P(A,L)= 2/15 in entrambi i casi. Sono ugualmente significativi? La probabilità che questa sostituzione sia casuale dipende dalle frequenze di occorrenza dei singoli amminoacidi P i e P j Confronto con l ipotesi di indipendenza Sostituzione i A -> j B casuale significa che i 2 eventi: E 1 = (i in A) e E 2 = (j in B) sono INDIPENDENTI Per determinare il grado di non casualità della sostituzione bisogna confrontare P ij con il prodotto P i P j Es: 1 insieme di sequenze omologhe A: ALASVLIRAILRLYP B: ALAVLLNRLILRALP P(A)= 6/30, P(L) =10/30 P(A,L) = 2/15 > 1/15 = P(A)P(L): sostituzione FAVORITA 2 insieme di sequenze omologhe A: LLLLAALLLALLALL B: LALLAALLAALLALL P(A)= 10/30, P(L) =20/30 P(A,L) = 2/15 < 2/9 = P(A)P(L): sostituzione SFAVORITA Score di sostituzione Il rapporto r ij = P ij /P i P j determina se la sostituzione i -> j è più o meno frequente di quanto ci si aspetterebbe casualmente. Dato un allineamento tra due sequenze: A: SLDPIKTYRALMNVDSLRTFPIL B: SFGIKKTKLAKLPVDTIKSWPIL la probabilità di sostituzione A->B sarà data dal prodotto degli r ij : r SS r LF r DG r PI r IK (indipendenza delle posizioni) SCORE di SOSTITUZIONE: s(i,j) =int[k log(p ij /P i P j )] Il logaritmo rende la quantità additiva sulla sequenza Minima distanza = Massimo score (s) 3

4 ESERCIZIO Calcolare la matrice di sostituzione a partire dalle seguenti sequenze allineate ACAGGTGGACCT ACTGGTCGACTT CTATATGG CCGGATCG Matrici di sostituzione: PAM In base a questo concetto, differenti matrici possono essere derivate. La differenza fondamentale sta nell insieme di allineamenti considerati per costruire le matrici. PAMx: (Point Accepted Mutation). Numero di eventi mutazionali pari a x%. Si costruisce la matrice: A 1 ij = P(j i) =N(i,j)/N(i) per sequenze con 1% di mutazioni. PAM 1 = Log(A 1 ij /P i ) Matrici di sostituzione: PAM Relazione tra PAM e identità tra due sequenze Per derivare gli score relativi a sequenze in cui siano avvenuti n eventi mutazionali ogni 100 residui: Es: n=2 P(i j) = Π l P(i l) P(l j) A n ij=(a 1 ij) n NOTA BENE: n % eventi mutazionali: numero di mutazioni, NON di residui mutati. Possono essere rimutati posizioni già mutate. 100 eventi mutazionali indipendenti ogni 100 residui lasciano alcune posizioni invariate PAM n = Log(A n ij /P i ) Il numero di eventi mutazionali (PAM) è differente dal numero di residui differenti tra due sequenze, quando le mutazioni si accumulano. PAM10 PAM160 Matrice molto stringente: nessun valore positivo fuori diagonale Iniziano valori positivi fuori diagonale: residui con valori di sostituzione positivi sono detti SIMILI 4

5 PAM250 PAM500 Molto usata Matrici di sostituzione BLOSUM62 Le matrici PAM ricavano ipotesi sulle mutazioni in sequenze lontane a partire dalle mutazioni osservate in sequenze molto simili. Ipotesi molto stretta. BLOSUMx: Famiglia di matrici ricavate direttamente da blocchi di allineamenti di sequenze con identità maggiore al x%. Per sequenze molto relate vanno usate PAM basse o BLOSUM alte. Per sequenze lontane, viceversa. Molto usata BLOSUM90 BLOSUM30 5

6 Qualieventiconsideriamo? Distanza tra sequenze Mutazione Delezione e Inserzione Alcuni amminoacidi possono essere stati deleti o inseriti nel corso dell evoluzione A: ALASVLIRLIT--YP B: ASAVL---ITRLYP i i Score( A, B) = s( A, B ) +σ (3) + σ (2) Il punteggio (negativo) di un gap dipende solo dal numero di posizioni σ(n) =-nd lineare σ(n) =-d-(n-1)e affine (d: apertura,e: estensione) Allineamento tra sequenze Date due sequenze, qual è l allineamento a punteggio massimo? Soluzione naïf: provare tutti gli allineamenti possibili e scegliere quello a punteggio maggiore! Per ogni allineamento, possiamo infatti calcolare il punteggio tramite la formula i i Score( A, B) s( A, B ) σ ( ngap ) = + i gap N.B. Tutti i punteggi sono indipendenti dalla posizione lungo la sequenza Quanti sono i possibili allineamenti di due sequenze? Scrivere TUTTI i possibili allineamenti senza gap interni delle sequenze: A: tca B: ga Scrivere TUTTI i possibili allineamenti con gap delle medesime sequenze Quanti sono i possibili allineamenti di due sequenze? Caso senza Gap interni --tca -tca tca tca tca- tca-- ga--- ga-- ga- -ga --ga ---ga Uguale al primo Date due sequenze di lunghezza m e n, il numero dei possibili scorrimenti differenti è m +n Scrivere i punteggi di allineamento per ognuno degli allineamenti secondo la seguente matrice con penalità di gap LINEARE (d=2) A C T G A C T 2-1 G 2 Quanti sono i possibili allineamenti di due sequenze? Caso con gap interni --tca -tca -tca -tca t-ca ga--- ga-- g-a- g--a ga-- gatca gtaca gtcaa gtcaa tgaca tca tca tc-a tca tcaga- g-a -ga- -ga --ga tgcaa tgcaa tcgaa tcgaa tcaga I possibili allineamenti sono uguali ai possibili modi di intercalare le due sequenze, mantenendo l ordine Date due sequenze di lunghezze n e m, i possibili allineamenti sono (m+n)!/n!m! Per n=m=80 ho possibili allineamenti!!!!!!! Algoritmi di programmazione dinamica: idea base Il calcolo per intero di tutti gli allineamenti è sovrabbondante ALSKLASPALSAKDLDSPALS ALSKIADSLAPIKDLSPASLT ALSKLASPALSAKDLDSPAL-S ALSKIADSLAPIKDLSPASLT- I due allineamenti sono per la maggior parte uguali. Lo score è additivo lungo l allineamento. Col metodo naïf la prima parte dell allineamento viene ricalcolata! Si possono memorizzare i punteggi degli allineamenti parziali 6

7 Complessità computazionale Numero di operazioni necessario per ottenere un risultato seguendo un algoritmo Algoritmo naïf Date due sequenze di lunghezza n dobbiamo calcolare (2n)!/(n!) 2 punteggi di allineamento. Ognuno richiede dalle n alle 2n operazioni. Allineamenti globali e locali Algoritmi differenti, ma sostanzialmente simili, cercano similarità GLOBALI confrontando intere sequenze o similarità LOCALI, cercando i segmenti che meglio si allineano all interno di due sequenze L annotazione si basa spesso sulla ricerca di domini comuni e elementi funzionali conservati Poiché n! n n (2π n) 1/2 e -n Complessità O(2 2n n 1/2 ) Algoritmo Needleman-Wunsch Vanno calcolati (n +1) 2 valori della matrice. Ognuno richiede 4 operazioni: Complessità (n 2 ) Significatività di un allineamento Dato un allineamento (globale o locale) che abbia ottenuto un punteggio S, come valutare se è significativo? Come sono distribuiti i punteggi di allineamenti di sequenze casuali? Con 100,000 allineamenti di sequenze scorrelate e randomizzate: Z=(S-<S>)/σ s Z-score S=Punteggio di allineamento <S>=Media dei punteggi di allineamento su un insieme random σ s =Deviazione dei punteggi di allineamento su un insieme random Occorrenza Gli allinementi significativi sono qua! Accuratezza dell allineamento Z<3 non significativo Score Quanto è affidabile lo Z-score? E-value Lo Z-score di questo allineamento locale è 7.5 su 54 residui L identità è 25.9%. Le sequenze sono completamente differenti in struttura secondaria Citrate synthase (2cts) vs transthyritin (2paba) Numero atteso di allineamenti random con punteggio maggiore o uguale a un punteggio dato (s) E reso possibile dal calcoli statistici E=Kmn e -λs m, n: lunghezze delle due sequenze K, λ: Costantidi scaling Il numero di allineamenti random a punteggio maggiore di s cresce col crescere delle lunghezze delle sequenze (o dei data base con cui confrontiamo una sequenza) e cala esponenziamente al crecere di s 7

8 E-value La probabilità P di trovare un allineamento con score maggiore o uguale ad un certo valore S è data da: E ( S x ) = 1 e P S 1 Accuratezza dell allineamento La significatività dell E-value dipende dalla lunghezza della banca dati considerata. Per un numero di sequenze pari a quello di SwissProt E> 10-1 non significativo E < 10-3 significativo ifi Ricerca di similarità in Banche Dati Data una sequenza, cercare se esistono sequenze simili in una banca dati Di principio si potrebbero fare allineamenti tra la sequenza target e TUTTE le sequenze Le sequenze da allineare sono troppe, e il processo non è fattibile in tempi brevi nemmeno usando l algoritmo di NW Si utilizzano algoritmi euristici, che non assicurano il raggiungimento dell allineamento ottimo FASTA BLAST FASTA Data una sequenza (Query), viene divisa in parole lunghe k-tup (generalmente k-tup = 2 per proteine, 6 per DNA) ADKLPTLPLRLDPTNMVFGLRI Parole (indicizzate per posizione): AD, DK, KL, LP, PT, TL, LP, PR, RL,,, Lo stesso elenco di parole indicizzato è compilato per ogni sequenza (Subject) del data base in cui si cercano sequenze. E molto rapida la ricerca di parole uguali tra Query e Subject. La differenza degli indici determina la diagonale FASTA Query FASTA Query Identificazione delle identità di parole : identità consecutive danno origine a diagonali più lunghe Si selezionano le sequenze candidate I punteggi delle regioni più lunghe sono valutati con una matrice di score (PAM o BLOSUM) 8

9 FASTA Query FASTA Query Vengono cercate regioni ad alta similarità su diagonali vicine Si procede ad un allineamento esatto (Smith-Waterman) su una banda stretta attorno alla diagonale di maggior similarità (solitamente banda larga attorno ai 32 residui) Sequence similarity with FASTA BLAST Data un data base di sequenze, questo viene indicizzato: per ogni tripletta di residui consecutivi si memorizza in quali sequenze e in quali posizioni questa tripletta viene trovata. AAA AAC AAD ACA BLAST Data una sequenza (Query), viene divisa in parole lunghe W (generalmente W = 3 per proteine) LSLPTLPLRLDPTNMVFGLRI LS, SL, LP, LPT, PTL, TLR,,, Per ognuna vengono generate le parole affini secondo la BLOSUM62: parole con punteggio > T (T = ) 13) LS 16 IS 14 MS 14 VS 13 LA 13 LT 13 LN 13 The BLAST Algorithm: Seeding (W and T) Speed gained by minimizing search space Alignments require word hits Neighborhood words W and T modulate speed and sensitivity Sequence 1 word hits T=12 BLOSUM62 neighborhood of RGD RGD 17 KGD 14 QGD 13 RGE 13 EGD 12 GD 12 NGD 12 RGN 12 AGD 11 MGD 11 RAD 11 RGQ 11 RGS 11 RND 11 RSD 11 SGD 11 TGD 11 9

10 The BLAST Algorithm: 2-hit Seeding Alignments tend to have multiple word hits. Isolated word hits are frequently false leads. Most alignments have large ungapped regions. isolated words word clusters Requiring 2 word hits on the same diagonal (of 40 aa for example), greatly increases speed at a slight cost in sensitivity. BLAST Per ognuna delle parole affini vengono recuperate le sequenze del data base che la contengono (secondo l indicizzazione) The BLAST Algorithm: Extension Alignments are extended from seeds in each direction. Extension is terminated when the maximum score drops below X. alignment extension La corrispondenza viene estesa (senza gap) a destra e a sinistra fino a che lo score rimane superiore a una soglia S. Durante l estensione vengono tollerate perdite di score fino a una tolleranza X Query:83 Subject:48 LMVAISNVGTDTLSLEAQNKIKSASNLSLTLQKSK +++AIS GT+++S +AQ++IK+AS+ L L + ++ VILAISGFGTESMSADAQDRIKAASYQLCLKIDRAE SP Text example match +1 mismatch -1 no gaps The quick brown fox jumps over the lazy dog. The quiet brown cat purrs when she sees him. length of extension trim to max X = Sequence similarity with BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) >gi ref NP_ (NC_004193) 3-oxoacyl-(acyl carrier protein) reductase [Oceanobacillus iheyensis] Length = 253 Score = 38.9 bits (89), Expect = 3e-05 Identities = 17/40 (42%), Positives = 26/40 (64%) Frame = -1 Query: 4146 VTGAGGLGRAISLELAKKGCIAVVDINVSGAEDTVKQI 4027 VTGA G+G+AI+ A +G + V D+N GA+ V++I Sbjct: 10 VTGAASGMGKAIATLYASEGAKVIVADLNEEGAQSVVEEI 49 10

11 BLAST: i 4 parametri fondamentali W: word size, maggiore è il numero, minore è il numero di parole generate, minore è il tempo di esecuzione. Ma la sensibilità decresce sensibilmente. T: threshold, minore è il numero, maggiore è il numero di w-mers inclusi nella lista, maggiore è il tempo di esecuzione. Si ha però un incremento di sensibilità. S: score, minore è il numero, maggiore sarà la lunghezza degli SP X: maggiore è il numero, più estesamente sarà osservato l intorno di una SP, aumentando il tempo di esecuzione. Le versioni di BLAST blastp: cerca similarità in banche dati proteiche a partire da una query di amino acidi. blastn: cerca similarità in banche dati di nucleotidi a partire da una query di nucleotidi. blastx: cerca similarità in banche dati proteiche a partire da una query di nucleotidi che viene tradotta tt in tutti i frame. tblastn: cerca similarità in banche dati di nucleotidi a partire da una query di amino acidi, traducendo in amino acidi tutti i subject della banca dati, in tutti frame. tblastx: cerca similarità in banche dati di nucleotidi a partire da una query di nucleotidi, traducendo in amino acidi tutti i subject della banca dati The 5 Standard BLAST Programs Program Database Query Typical Uses BLASTN Nucleotide Nucleotide Mapping oligonucleotides, amplimers, ESTs, and repeats to a genome. Identifying related transcripts. BLASTP Protein Protein Identifying common regions between proteins. Collecting related proteins for phylogenetic analysis. BLASTX Protein Nucleotide Finding protein-coding genes in genomic DNA. TBLASTN Nucleotide Protein Identifying transcripts similar to a known protein (finding proteins not yet in GenBank). Mapping a protein to genomic DNA. TBLASTX Nucleotide Nucleotide Cross-species gene prediction. Searching for genes missed by traditional methods. gapped-blast: porta avanti la fase di estensione delle SP considerando la possibilità di inserzione dei gap. PSI-BLAST: effettua una ricerca iterativa utilizzando le SP per generare dei profili caratteristici della query. PI-BLAST: estensione di PSI-BLAST per la ricerca in banca dati di pattern proteici più che di query esatte. BL2SEQ: adattamento di blast per l allineamento a coppie MegaBLAST: può concatenare molte queries tra loro per minimizzare il tempo di esecuzione dovuto a sequenze query troppo lunghe (è adatto a sequenze nucleotidiche molto simili tra loro) FASTA vs BLAST FASTA vs BLAST simili in strategia, molto diversi nei contenuti Cerca parole esatte : può perdere similarità significative supera il problema grazie all introduzione dei w-mers N.B. i w-mers sono basati su una matrice quindi può accadere che match esatti score S inferiori rispetto a match non esatti Esempio, con Blosum62 - il match perfetto AIS-AIS dà score 12 - lo score inesatto LS-MS dà score 14 il mismatch è premiato più del match più tollerante per sequenze che presentano gaps, il loro inserimento è previsto già nelle prime fasi inserisce i gaps solo in fase di allungamento 11

12 60 Sequenze Low complexity La presenza nelle sequenze di regioni molto ripetitive (polyq, stratch idrofobici, ) può falsare i risultati della ricerca: si ritrovano altre regioni simili in proteine non imparentate: Di default viene utilizzato il filtro per le regioni low complexity: nell allineamento queste regioni vengono indicate come XXXXXX Query: 61 XXXXGVNLGISSELVNXXXXXXXXXXXXXXXXXRRKIERDPNAPKKPLTVFFAYSAYV 120 GVNLGISSELVN RRKIERDPNAPKKPLTVFFAYSAYV Sbjct: 61 TLTSGVNLGISSELVNPIDDDKDAIIAAPVKAVRRKIERDPNAPKKPLTVFFAYSAYV 120 Ricerca FASTA Lista score significatività The best scores are: opt bits E(787946) gi ref NP_ igh mobility group (MG)-like protein; ( 246) e-86 gi emb CAA (X59863) a xenopus upstream binding factor ( 701) gi pir S17196 transcription factor UBF2 - African clawed fro ( 701) gi sp P25980 UBF2_XENLA NUCLEOLAR TRANSCRIPTION FACTOR 2 (UPS ( 701) gi sp P40626 MGB_TETT IG-MOBILITY-GROUP PROTEIN B gi 1023 ( 143) gi pir T38936 non-histone chromosomal protein high mobility ( 108) gi pir S47596 MG1-like protein - fruit fly (Drosophila mel ( 216) gi sp P41848 SSRP_CAEEL PROBABLE STRUCTURE-SPECIFIC RECOGNIT ( 697) gi ref NP_ high mobility group protein (MG1), put ( 502) gi pir JC5112 ribosomal transcription factor UBF1 - Chinese ( 764) gi gb AAB (L42570) putative [Cricetulus griseus] ( 764) gi pir A24019 i A24019 nonhistone chromosomal protein MG-T - trout t (f ( 172) gi dbj BAB (AK004961) putative [Mus musculus] ( 752) gi pir B40439 UBF transcription factor, short form - rat ( 727) gi ref XP_ hypothetical protein XP_ [omo sa ( 727) gi ref XP_ high-mobility group 20A [omo sapiens] ( 313) gi sp Q04931 SSRP_RAT STRUCTURE-SPECIFIC RECOGNITION PROTEIN ( 561) gi ref NP_ high mobility group 20A [Mus musculus] ( 346) Allineamenti >>gi ref NP_ igh mobility group (MG)-like protein; mo1p (246 aa) QUERY MTTDPSVKLKSAKDSLVSSLFELSKAANQTASSIVDFYNAIGDDEEEKIEAFTTLTESLQTLTSGVNLGISSELVNPI :::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::: gi 632 MTTDPSVKLKSAKDSLVSSLFELSKAANQTASSIVDFYNAIGDDEEEKIEAFTTLTESLQTLTSGVNLGISSELVNPI Ricerca BLAST Score E Sequences producing significant alignments: (bits) Value gi ref NP_ igh mobility group (MG)-like e-90 gi pir T12113 transcription factor - fava bean >gi e-05 gi sp Q09390 YR44_CAEEL YPOTETICAL 23.8 KD PROTEI e-05 gi gb AAK U22831_8 (U22831) ypothetical pr e-04 gi ref NP_ structure specific recognition e-04 gi pir T43009 MG protein Caenorhabditis el e-04 gi gb AAK U22831_9 (U22831) ypothetical pr e-04 gi dbj BAB (AK017716) putative [Mus musculus] 46 2e-04 gi ref NP_ high mobility group 20A [Mus m e-04 gi ref NP_ high-mobility group 20A [omo s e-04 gi pir JC6179 dorsal switch protein 1 - fruit fly e-04 gi pir S50068 nonhistone chromosomal protein MG e-04 gi sp P25980 UBF2_XENLA NUCLEOLAR TRANSCRIPTION FACT e-04 gi emb CAA (X59863) a xenopus upstream bindi e-04 gi emb CAA (X81456) unnamed protein product e-04 gi sp Q91731 SX11_XENLA TRANSCRIPTION FACTOR SOX gi ref XP_ hypothetical protein XP_ gi pdb 1AAB Nmr Structure Of Rat mg1 mga Frag gi dbj BAB (AK004857) putative [Mus musculus] gi pdb 1ME igh Mobility Group Protein Fragment gi pir T03375 high mobility group protein MGd gi gb AAK (AC024859) ypothetical protein Allineamenti >gi ref NP_ igh mobility group (MG)-like protein; mo1p [Saccharomyces Length = 246 Score = 332 bits (850), Expect = 3e-90 Identities = 191/220 (86%), Positives = 191/220 (86%) Query: 1 MTTDPSVKLKSAKDSLVSSLFELSKAANQTASSIVDFYNAIGDDEEEKIEAFXXXXXXXX 60 MTTDPSVKLKSAKDSLVSSLFELSKAANQTASSIVDFYNAIGDDEEEKIEAF Sbjct: 1 MTTDPSVKLKSAKDSLVSSLFELSKAANQTASSIVDFYNAIGDDEEEKIEAFTTLTESLQ 60 Query: 61 XXXXGVNLGISSELVNXXXXXXXXXXXXXXXXXRRKIERDPNAPKKPLTVFFAYSAYV 120 GVNLGISSELVN RRKIERDPNAPKKPLTVFFAYSAYV Sbjct: 61 TLTSGVNLGISSELVNPIDDDKDAIIAAPVKAVRRKIERDPNAPKKPLTVFFAYSAYV Lambda K Gapped Lambda K Matrix: BLOSUM62 Gap Penalties: Existence: 11, Extension: 1 Statistiche basate su valori di λ e k precacolati per determinate matrici, composizione in residui e penalità per gap E(DNA) vs E(Proteine) Allineamento di tutte le sequenze Valori attesi con la sequenza di DNA [Score, E(DNA)] e la sequenza proteica [E(prot)] per una ricerca in bancadati effettuata con la glutatione transferasi (GST) di drosofila. La ricerca che utilizza la sequenza proteica fornisce risultati più significativi ed è in grado di individuare omologhi della GST al di fuori del gruppo degli insetti ATTENZIONE: Non è allineamento multiplo ottimale 12

13 1 Y K D Y S - D K K K G E L Y R D Y Q T - D Q K K G D L Y R D Y Q S - D K K G E L Y R D Y V S - D K K G E L Y R D Y Q F - D Q K K G S L Y K D Y N T - Q K K N E S Y R D Y Q T - D K K A D L G Y G F G - - L I K N T E T T K 9 T K G Y G F G L I K N T E T T K 10 T K G Y G F G L I K N T E T T K Position Profilo di sequenza A C D E F G K I L M N P Q R S T V W Y Utilità del profilo di sequenza Il profilo di sequenza dà una descrizione complessiva di tutte le sequenze: evidenzia le zone più conservate o le mutazioni più frequenti posizione per posizione Allineare una sequenza contro un profilo I parametri di un allineamento sono generalmente identici per tutte le posizioni. Allineare contro un profilo pesa differentemente le mutazioni nelle differenti posizioni Dal profilo di sequenza possiamo ricavare una matrice di score dipendente dalla posizione A C D E F G K I L M N P Q R S T V W Y Stimo se ogni residuo in ogni posizione è più o meno presente di quanto ci si aspetterebbe random: confronto la probabilità desunta dal profilo con la probabilità a priori di avere l amminoacido in questione Sequenza Profilo delle sequenze rintracciate PSI-BLAST Fino a convergenza BLAST PSI-BLAST Data Base S AA (pos) = int [K log (Prof AA (pos)/p AA ) ] The design of PSI-BLAST (1) PSI-BLAST takes as an input a single protein sequence and compares it to a protein database, using the gapped BLAST program (2) The program constructs a multiple alignment, and then a profile, from any significant local alignments found. The original query sequence serves as a template for the multiple alignment and profile, whose lengths are identical to that of the query. Different numbers of sequences can be aligned in different template positions (3) The profile is compared to the protein database, again seeking local alignments. After a few minor modifications, the BLAST algorithm can be used for this directly. (4) PSI-BLAST estimates the statistical significance of the local alignments found. Because profile substitution scores are constructed to a fixed scale, and gap scores remain independent of position, the statistical theory and parameters for gapped BLAST alignments remain applicable to profile alignments. (5) Finally, PSI-BLAST iterates, by returning to step (2), an arbitrary number of times or until convergence. 13