INTRODUZIONE AI METODI SPETTROSCOPICI DI ANALISI. University of Messina, Italy. Analitica 24 16/17
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1 24 INTRODUZIONE AI METODI SPETTROSCOPICI DI ANALISI 1
2 Metodi spettroscopici d analisi I metodi spettroscopici di analisi si basano sulla misura della radiazione elettromagnetica prodotta o assorbita dalle specie molecolari o atomiche di interesse. I metodi spettroscopici possono essere classificati a seconda della regione dello spettro elettromagnetico. Queste regioni sono quelle dei raggi γ, dei raggi X, dell ultravioletto (UV), del visibile, dell infrarosso (IR), delle microonde e delle radio frequenze (RF). La spettroscopia include oggi anche tecniche che non coinvolgono la radiazione elettromagnetica, quali la spettroscopia acustica, di massa ed elettronica. 2
3 Metodi spettroscopici d analisi Si distinguono due tipi di metodi spettroscopici : Metodi di emissione: fanno uso di radiazione emessa quando l analita è esposto ad energia termica o elettrica. Metodi di assorbimento: si basano sulla diminuzione in potenza (attenuazione) di un fascio di radiazione elettromagnetica come conseguenza della sua interazione con l analita. 3
4 Proprietà della radiazione elettromagnetica La radiazione elettromagnetica è una forma di energia trasmessa attraverso lo spazio ad enorme velocità. La luce è solo parte della radiazione elettromagnetica nella regione visibile ma alcune volte comprende anche la radiazione UV e IR. Le radiazioni elettromagnetiche sono convenientemente descritte trattando le radiazioni come onde sinusoidali con proprietà come: lunghezza d onda, frequenza, velocità e ampiezza. Il modello ondulatorio fallisce nel rendere conto dei fenomeni associati con l assorbimento e l emissione di energia radiante 4
5 Parametri d onda ampiezza A = lunghezza del vettore elettrico al massimo dell onda periodo p = tempo richiesto per il passaggio di massimi (o minimi) successivi attraverso un punto fisso frequenza ν = numero di oscillazioni del campo per secondo; è uguale a 1/p lunghezza d onda λ = distanza lineare fra massimi o minimi successivi di un onda velocità c = è il prodotto della frequenza per la lunghezza d onda 5
6 Velocità della radiazione Nel vuoto la velocità alla quale la radiazione si propaga è indipendente dalla lunghezza d onda ed è massima. Tale velocità è indicata con c ed è stata misurata in x10 10 cm/s. La velocità della radiazione nell aria differisce leggermente da c (è circa lo 0.03% in meno). La velocità approssimata della luce nell aria e nel vuoto è espressa dalla formula: c = ν x λ = 3.00x10 10 cm/s = 3.00x10 8 m/s Il numero d onda v è il numero d onde per centimetro ed è uguale a 1/λ e ha unità di misura di cm -1 6
7 Velocità della radiazione La radiazione si propaga ad una velocità minore di c in un mezzo contenente materia perché il campo elettromagnetico della radiazione interagisce con gli elettroni negli atomi o molecole del mezzo ed è così rallentata. 7
8 Proprietà particellari della radiazione elettromagnetica Il modello ondulatorio fallisce quando intervengono fenomeni associati con l assorbimento o l emissione di energia radiante; in questo caso la radiazione elettromagnetica deve essere trattata come una corrente di particelle discrete o pacchetti d onde di energia chiamati fotoni o quanti. 8
9 Proprietà particellari della radiazione elettromagnetica L energia di un fotone dipende dalla frequenza della radiazione ed è data da: E= h xν = hc/λ = hcv dove h è la costante di Planck (6.63 x Js). 9
10 Lo spettro elettromagnetico In questo grafico sono mostrate le regioni dello spettro magnetico che sono utilizzate per le analisi spettroscopiche nonché le transizioni atomiche e molecolari responsabili dell assorbimento e dell emissione di ciascuna regione. 10
11 Misure spettroscopiche GLI SPETTROSCOPISTI USANO LE INTERAZIONI CON LA MATERIA PER OTTENERE INFORMAZIONI SU I CAMPIONI. Il campione viene stimolato mediante l uso di energia sotto forma di CALORE, DI ENERGIA ELETTRICA, DI LUCE, DI PARTICELLE O DI REAZIONE CHIMICA. Prima della stimolazione, l analita si trova prevalentemente nel suo livello di energia più basso o STATO FONDAMENTALE. L applicazione dello stimolo fa sì che alcune specie dell analita passino ad uno stato energetico più alto o STATO ECCITATO. 11
12 SPETTROSCOPIA DI EMISSIONE e CHEMILUMINISCENZA L analita viene stimolato mediante calore, energia elettrica o mediante una reazione chimica. SPETTROSCOPIA DI EMISSIONE: comprende I metodi nei quali lo stimolo è costituito dal calore o dall energia elettrica. SPETTROSCOPIA DI CHEMILUMINESCENZA: l eccetizione dell analita avviene mediante una reazione chimica. In entrambi casi si misura l intensità emessa quando l analita torna allo stato fondamentale. E termica, elettrica o chimica 2 RADIAZIONE EMESSA
13 SPETTROSCOPIA DI ASSORBIMENTO L analita viene stimolato mediante l applicazione di un campo elettromagnetico esterno Nella spettroscopia di assorbimento si misura la quantità di luce assorbita in funzione della lunghezza d onda. Radiazione incidente P 0 Radiazione trasmessa P
14 SPETTROSCOPIA DI FOTOLUMINESCENZA Viene misurata l emissione dei fotoni a seguito dell assorbimento di una radiazione elettromagnetica. L analita può perdere il suo eccesso di energia mediante emissione di un fotone (luminescenza) o mediante processi non radiativi. Luminescenza Radiazione incidente P
15 Assorbimento della radiazione Ogni specie molecolare è in grado di assorbire frequenze caratteristiche della radiazione elettromagnetica. Tale processo trasferisce l energia alla molecola producendo un adiminuzione nell intensità della radiazione elettromagnetica. La legge dell Assorbimento nota come legge di Lambert Beer o soltanto legge di Beer ci dice come la quantità di radiazione attenuata dipende dalla concentrazione delle molecole che assorbono e dal cammino ottico nel quale avviene l assorbimento. Maggiore è la distanza maggiore sarà l attenuazione A parità di cammino più elevata è la concentrazione maggiore sarà l attenuazione P 0 P b 15
16 Trasmittanza La trasmittanza T di una soluzione è definita come la frazione di radiazione incidente trasmessa dalla soluzione: oppure T = P/P 0 %T = P/P 0 x 100 P 0 P b 16
17 Trasmittanza La figura mostra l attenuazione di un raggio collimato di radiazione monocromatica dopo il suo passaggio attraverso uno strato di soluzione con uno spessore di b cm e una concentrazione c di una specie assorbente. L interazione tra i fotoni e le specie assorbenti provocano una riduzione della potenza del raggio da P 0 a P. 17
18 Assorbanza L assorbanza A di una soluzione è definita dall equazione: A = -log 10 T = log P 0 /P E evidente dall equazione sopra indicata che quando l assorbanza di una soluzione aumenta, la trasmittanza diminuisce. Calcolo tramite foglio di Excel 18
19 Trasmittanze ed assorbanze sperimentali L interazione fra la radiazione e le pareti del contenitore è inevitabile, con perdite in potenza che si hanno ad ogni interfase come risultato della riflessione e dell assorbimento; le perdite per riflessione sono sostanziali. Ad esempio, circa l 8.5 % del fascio di luce gialla viene perso per riflessione in seguito all attraversamento di una celletta di vetro. La luce può anche essere dispersa in tutte le direzioni dalla superficie di grosse molecle o particelle (polvere). 19
20 Trasmittanze ed assorbanze sperimentali Per compensare questi perdite, la potenza del raggio trasmesso attraverso una celletta è comparata con quella di un raggio che attraversa una celletta identica contenente soltanto il solvente del campione in esame. Si ottiene così un assorbanza sperimentale che approssima l assorbanza vera per la soluzione: A = log P 0 /P = log P solvente /P soluzione 20
21 La legge di Beer Secondo la legge di Beer, l assorbanza è linearmente legata alla concentrazione delle specie assorbenti, c, e alla lunghezza del cammino ottico, b, della radiazione del mezzo assorbente. Cioè: A = log (P 0 /P) = abc a = costante di proporzionalità detta assorbanza specifica 21
22 La legge di Beer Quando c è espressa in moli per litro e b in cm la costante di proporzionalità è chiamata assorbanza specifica molare ed ha il simbolo speciale ε. L equazione che esprime la legge di Beer diventa: A = log (P 0 /P) = εbc 22
23 Termini utilizzatii n spettroscopia di assorbimento 23
24 Applicazione della legge di Beer a miscele La legge di Beer si applica anche a soluzioni contenenti più di una specie di sostanze assorbenti. Se non si verifica interazione fra le varie specie, l assorbanza totale per un sistema multicomponente è la somma delle assorbanze individuali: A totale = A 1 + A A n = ε 1 bc 1 + ε 2 bc ε n bc n 24
25 Spettri di assorbimento Uno spettro di assorbimento è un grafico dell assorbanza in funzione della lunghezza d onda. L assorbanza potrebbe essere diagrammata anche in funzione del numero d onda o della frequenza. Si possono usare grafici anche in funzione di log A (che però porta a una perdita spettrale). Un grafico dell assorbanza specifica molare in funzione della lunghezza d onda è indipendente dalla concentrazione e caratteristico per una determinata molecola. Permanganato di potassio 25
26 Assorbimento atomico L assorbimento atomico avviene quando un fascio di radiazione policromatica ultravioletta o visibile passa attraverso un mezzo contenente atomi gassosi, solo poche frequenze sono attenuate dall assorbimento. Lo spettro consiste di un numero di righe di assorbimento molto strette. Gli spettri di assorbimento atomico di solito non vengono registrati si misura invece l assorbimento atomico ad una singola lunghezza d onda usando un aosrgente monocromatica con una riga stretta. Energia, elettronvolt Na 5p 4p nm 3p nm 3s 26
27 Teoria dell assorbimento molecolare Secondo la teoria quantica ogni specie molecolare ha un set unico di stati energetici il più basso dei quali è lo stato fondamentale (M). Quando un fotone di radiazione passa vicino ad una molecola l assorbimento avverrà se (e solo se) l energia del fotone è esattamente uguale alla differenza di energia tra lo stato fondamentale e uno degli stati energetici più alti della molecola. 27
28 Teoria dell assorbimento molecolare Nella situazione precedentemente esposta l energia del fotone è trasferita alla molecola convertendola allo stato energetico più alto che è chiamato stato eccitato (M*). Il tutto può essere rappresentato dall equazione: M + hν M* 28
29 Teoria dell assorbimento molecolare Trascorso un brevissimo lasso di tempo ( da 10-8 a 10-9 s) la specie eccitata (M*) si rilassa al suo stato fondamentale (M) trasferendo il suo eccesso di energia ad altri atomi o molecole del mezzo. Il tutto può essere rappresentato dall equazione: M* M + calore 29
30 Teoria dell assorbimento molecolare Il rilassamento può anche avvenire per decomposizione fotochimica di M* per formare nuove specie o per riemissione di radiazione fosforescente o fluorescente. E importante sottolineare che la vita media di M* è talmente breve che la sua concentrazione a qualunque istante è trascurabile. 30
31 Tipi di transizioni molecolari Le molecole subiscono tre tipi di transizioni quantizzate quando vengono eccitate dall assorbimento di radiazione ultravioletta, visibile e infrarossa: transizioni elettroniche transizioni vibrazionali transizioni rotazionali 31
32 Transizioni elettroniche La transizione elettronica comporta la promozione di elettroni residenti in orbitali atomici o molecolari a bassa energia su orbitali ad energia più alta. Perché tale transizione abbia luogo, l energia del fotone hν, deve essere esattamente uguale alla differenza di energia fra i due orbitali. 32
33 Transizioni vibrazionali Le transizioni vibrazionali hanno luogo in quanto le molecole hanno molteplici livelli energetici quantizzati ( o stati vibrazionali) associati ai legami che tengono insieme la molecola. 33
34 Transizioni rotazionali Oltre agli stati vibrazionali quantizzati una molecola ha una quantità di stati rotazionali quantizzati associati al moto rotazionale di una molecola intorno al suo centro di massa. 34
35 Energia totale L energia totale associata ad un orbitale e ad una molecola è quindi la risultante di: E totale = E elettronica + E vibrazionale + E rotazionale dove E elettronica è l energia associata agli elettroni nei vari orbitali esterni della molecola, E vibrazionale è l energia della molecola dovuta alle vibrazioni interatomiche ed E rotazionale è l energia associata alla rotazione della molecola intorno al suo centro di massa. 35
36 Assorbimento infrarosso La radiazione infrarossa generalmente non è sufficiente a provocare transizioni elettroniche, ma può indurre transizioni negli stati vibrazionali e rotazionali dello stato elettronico fondamentale di una molecola. 36
37 Assorbimento di radiazione visibile e ultravioletta Nel diagramma qui a fianco riportato le frecce centrali suggeriscono che le molecole in esame assorbono radiazione visibile di cinque lunghezze d onda promuovendo gli elettroni ai cinque livelli vibrazionali del livello elettronico E 1 eccitato. I fotoni ultravioletti che sono più energetici sono richiesti per produrre l assorbimento indicato dalle cinque frecce alla destra. 37
38 Spettri di assorbimento nel visibile per la 1,2,4,5-tetrazina in diverse condizioni Per il composto allo stato vapore (a) l e molecole sono sufficientemente separate da vibrare e ruotare liberamente e i picchi sono chiaramente osservabili. Nello stato condensato ed in soluzione la libertà di ruotare è in gran parte persa. Si evidenziano in (b) e (c) i differenti comportamenti spettrali a seconda del solvente utilizzato. 38
39 Limitazioni all applicabilità della legge di Beer Si osservano frequentemente deviazioni dalla proporzionalità diretta fra assorbanza e concentrazione (per b costante). Si parla a seconda dei casi di: limitazioni reali deviazioni strumentali deviazioni chimiche 39
40 Limitazioni reali alla legge di Beer La legge di Beer ha successo nel descrivere il comportamento in assorbimento solo di soluzioni diluite ed in questo senso è una legge limite. Ad alte concentrazioni (>0.01 M), le distanze medie fra gli ioni o le molecole delle specie assorbenti sono diminuite al punto tale che ogni particella influisce sulla distribuzione di carica dei suoi vicini. 40
41 Limitazioni reali alla legge di Beer Questa interazione può modificare la capacità di assorbire una data lunghezza d onda di radiazione. Poiché la misura dell interazione dipende dalla concentrazione, il verificarsi di questo fenomeno causa deviazioni dalla relazione lineare fra assorbanza e concentrazione. 41
42 Deviazioni chimiche Le deviazioni chimiche dalla legge di Beer appaiono quando le specie assorbenti subiscono associazione, dissociazione o reazione con il solvente per dare prodotti che assorbono differentemente dall analita. 42
43 Deviazioni strumentali con radiazioni policromatiche La legge di Beer è applicabile soltanto a misure di assorbanza con radiazione monocromatica. Le sorgenti realmente monocromatiche come i laser non sono tuttavia pratiche per misure analitiche di routine mentre la sorgente continua policromatica con l impiego di opportuni selettori di lunghezza d onda sembra offrire ottimi risultati. 43
44 Deviazioni strumentali con radiazioni policromatiche Le deviazioni dalla legge di Beer che derivano dall uso di un raggio policromatico non sono apprezzabili se la radiazione utilizzata non copre una regione spettrale in cui l assorbitore mostra grosse variazioni nell assorbanza come funzione della lunghezza d onda. 44
45 Deviazioni strumentali con radiazioni policromatiche I picchi di assorbimento molecolare nella regione spettrale UV/Vis sono sufficientemente ampi che una stretta aderenza alla legge di Beer può essere rivelata se le misure sono effettuate sul massimo del picco. Nella regione infrarossa i picchi sono generalmente così stretti che le deviazioni dalla legge di Beer sono la regola. 45
46 Deviazioni strumentali in presenza di radiazione spuria La radiazione impiegata per misure di assorbanza è generalmente contaminata da piccole quantità di radiazione spuria dovuta ad imperfezioni strumentali. La radiazione spuria è il risultato della dispersione e della riflessione delle superfici dei reticoli, lenti, filtri e finestre. 46
47 Deviazioni strumentali in presenza di radiazione spuria Per le misurazioni fatte in presenza di radiazione spuria l assorbanza osservata è data da: A = log (P 0 + P s )/(P + P s ) Dove P s sta ad indicare la radiazione spuria. 47
48 Deviazioni strumentali in presenza di radiazione spuria La figura accanto riporta il grafico dell assorbanza contro la concentrazione per vari livelli di P s rispetto a P 0. 48
49 Diseguaglianza tra le cellette Un altra importante deviazione della legge di Beer è causata dalla diseguaglianza delle cellette. Se le cellette della soluzione dell analita e del bianco non sono uguali per cammino e per caratteristiche ottiche. Nella curva di calibrazione sarà presente una intercetta e avremo una equazione del tipo A = εbc + k Questo errore può essere evitato scegliendo accuratamente delle cellette uguali oppure usando una procedura di regressione lineare per calcolare sia la pendenza che l intercetta della curva di calibrazione. 49
50 Emissione di radiazione elettromagnetica Gli atomi, gli ioni, le molecole possono essere eccitati ad uno o più livelli energetici superiori mediante numerosi processi, inclusi il bombardamento con elettroni o con altre particelle elementari, l esposizione al plasma ad elevata temperatura, alla fiamma, all arco elettrico, o l esposizione ad una sorgente di radiazione elettromagnetica. La vita media di una specie eccitata è generalmente variabile (da 10-9 fino a 10-6 s) e il rilassamneto ad un livello energetico più basso o allo stato fondamentale ha luogo con ilascio dell energia in eccesso nella forma di radiazione elettromagnetica, calore, o forse entrambi. 50
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