Siena, 24 febbraio 2011

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1 Siena, 24 febbraio Introduzione alle malattie da prioni 2. Genetica delle malattie da prioni 3. I piani di selezione genetica degli ovini 4. I ceppi 5. La sorveglianza sui ceppi 6. Il rischio per l uomo 7. Diagnosi Umberto Agrimi Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare, Istituto Superiore di Sanità 1. Introduzione alle malattie da prioni 2. Genetica delle malattie da prioni 3. I piani di selezione genetica degli ovini 4. I ceppi 5. La sorveglianza sui ceppi 6. Il rischio per l uomo 7. Diagnosi 1

2 PRIME OSSERVAZIONI SULLA SCRAPIE (XVIII - XIX secolo) Alcune greggi e razze sembrano colpite altre no L introduzione di un animale affetto in un gregge causa la comparsa della malattia negli altri animali Gli agnelli di pecore infette sono più a rischio per lo sviluppo della malattia Esistono forme cliniche diverse: - Traberkrankeit,, rida, tremblant - scrapie, prurigo lombaire STORIA NATURALE DELLE EST Prime descrizioni della scrapie nel 1700 Trasmissione sperimentale della scrapie (Cuillé e Chelle, 1936) Anni 30: trasmissione della scrapie attraverso incidente vaccinale (Gordon, 1946) Dimostrazione della resistenza ai trattamenti fisico-chimici (Wilson, anni 50) Sigurdsson conia il termine di virus lenti (1954) Descrizione della CJD (Creutzfeldt, 1920; Jakob, 1921; Kirschbaum, 1924) Descrizione del kuru (Gajduscek and Zigas, 1957) 2

3 Kuru region - Progressive degeneration of the brain s grey matter - Inability to control voluntary muscle movements - Tremors much like a shiver - One year after signs of disease - complete motor incapacity and death Gajdusek D.C., Zigas V. (1957). Degenerative disease of the central nervous system in New Guinea. The endemic occurrence of "kuru" in the native population. N. Engl. J. Med. 257: DECESSI PER KURU 150 Femmine Numero di casi Maschi Cannibalismo rituale vietato 3

4 Hadlow W.J. (1959). Scrapie and kuru. Lancet II: PRIME IPOTESI EZIOLOGICHE Infettiva IPOTESI Genetica 4

5 La scrapie ricade in una speciale categoria di disordini genetici in cui l azione di un gene è mediata da una particolare particella dotata di potere indipendente di auto-replicazione e patogenicità. Parry H.B. (1962). Scrapie: A transmissible and hereditary disease of sheep. Heredity 17: SCRAPIE ASSOCIATED FIBRILS (SAF) Merz P.A. et al. (1981). Abnormal fibrils from scrapie-infected brain. Acta Neuropathol. (Berl.) 54:

6 Diringer, H., Gelderblom H., Hilmert H., Ozel M., Edelbluth C., Kimberlin R.H. (1983). Scrapie infectivity, fibrils and low molecular weight protein. Nature 306: Prusiner S.B., McKinley M.P., Bowman K.A., Bolton D.C., Bendheim P.E., Groth D.F., Glenner G.G. (1983). Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods. Cell 35: Oesch B., Westaway D., Walchli M., McKinley M.P., Kent S.B., Aebersold R., Barry R.A., Tempst P., Teplow D.B., Hood L.E., Prusiner S.B., Weissmann C. (1985). A cellular gene encodes scrapie PrP protein. Cell 40:

7 Jackson & Clarke, 2000 Catene oligosaccaridiche Struttura proteica Glicosilfosfatidil inositolo Proteinasi K Proteinasi K ISS

8 PrP c PrP sc Differenze fra PrP C e PrP Sc PrP C PrP Sc Protease Resistance - + Solubility + - Propensity to aggregate - + Predominant Structure α-helix β-sheet 8

9 ISS

10 BSE Scrapie capra Scrapie pecora Scrapie capra 10

11 CARATTERISTICHE DELLE MALATTIE DA PRIONI MALATTIE NEURODEGENERATIVE NESSUN SEGNO DI INFIAMMAZIONE NESSUNA RISPOSTA IMMUNITARIA INVARIABILMENTE FATALI ACCUMULO DI PROTEINA AMILOIDEA (PrP) TRASMISSIBILI IN CONDIZIONI NATURALI E SPERIMENTALI ENCEFALOPATIE SPONGIFORMI TRASMISSIBILI DEGLI ANIMALI E DELL UOMO ANIMALI UOMO Scrapie (pecora, capra) Malattia di Creutzfeldt-Jakob Encefalopatia trasmissibile del visone Sindrome di Gerstmann- Straüssler-Sheinker Malattia del dimagrimento cronico del cervo Insonnia familiare fatale 11

12 ENCEFALOPATIE SPONGIFORMI TRASMISSIBILI DEGLI ANIMALI E DELL UOMO ANIMALI Scrapie (pecora, capra) Encefalopatia trasmissibile del visone Malattia del dimagrimento cronico del cervo Encefalopatia spongiforme bovina - Enc. spongiforme felina - Enc. spongiforme dei bovidi selvatici UOMO Malattia di Creutzfeldt-Jakob Sindrome di Gerstmann- Straüssler-Sheinker Insonnia familiare fatale Variante della malattia di Creutzfeldt-Jakob CASI DI vcjd NEL MONDO Casi primari Casi secondari Regno Unito Francia 25 (1) Irlanda 4 (2) USA 3 (2) Olanda 3 Italia 2 Canada 1 (1) Arabia Saudita 1 Giappone 1* Portogallo 2 Spagna 5 (1) Taiwan 1 TOT

13 EST DELL UOMO MCJ sporadica MCJ e altre forme familiari (GSS, FFI) legate a mutazioni del gene della PrP MCJ iatrogena dovuta a trasmissione accidentale attraverso procedure mediche vmcj (infettiva) causata dall agente della BSE MAJOR PrP GENE POLYMORPHISMS L T MOUSE F V A R Q SHEEP or 6 octarepeats V H R CATTLE HUMAN M 129 V 13

14 THE HUMAN PRNP GENE Signal peptide Octarepeat insersions P105L 129M/V P102L A117V Y145Stop V180I D178N F198S E200K V201I Q217R E219K M232R CREUTZFELDT-JAKOB DISEASE AND CODON 129 PRNP POLYMORPHISM DISTRIBUTION CONTROLS (n = 186) Val/Val (15%) SPORADIC CJD (n = 81) Val/Val (5%) Met/Met (45%) Met/Val (18.5%) Met/Val (40%) Fonte: Prof. M. Pocchiari, Registro Nazionale MCJ Met/Met (76.5%) 14

15 Prusiner suggerisce un modello nel quale i prioni sono responsabili di malattie la cui origine è alternativamente spontanea, genetica o infettiva. La MCJ sporadica sarebbe dovuta alla conversione occasionale e spontanea della PrP C in PrP Sc, ovvero a mutazioni somatiche del gene della PrP. Nelle forme genetiche (familiari) di MCJ tale conversione sarebbe facilitata dalla presenza di mutazioni del gene della PrP in grado di destabilizzare l'assetto conformazionale della proteina. La prima molecola di PrP Sc sarebbe a quel punto capace di interagire con altre molecole di PrP C inducendone il cambio conformazionale e innescando il processo patologico. Nelle forme infettive, infine, la PrP Sc deriverebbe da fonti esogene. Appartengono a questo gruppo la vmcj, la BSE e la scrapie nelle quali l infezione è acquisita per via alimentare. Riassumendo Caratteristiche inusuali ( a cavallo tra le malattie neurodegenerative e le malattie infettive) Descritte in molte specie di mammiferi Trasmissibili almeno in alcuni casi dagli animali all uomo Influenzate da una importante base genetica 15

16 CONTRO IL PRIONE DIVERSI CEPPI DI SCRAPIE NON ESISTE DIMOSTRAZIONE FORMALE DELLA TEORIA PRIONICA A FAVORE DEL PRIONE NESSUN ACIDO NUCLEICO VIRUS- SPECIFICO RESISTENZA ALLE NUCLEASI RESISTENZA ALLE RADIAZIONI U.V. NESSUNA STRUTTURA VIRUS- SIMILE AL M.E. L INFETTIVITA COPURIFICA CON LA PrPSc 16

17 TOPI KNOCKOUT 17

18 CONVERSIONE PrPc -> PrPsc PrPc PrPsc Aguzzi & Sigurdson Nat Rev

19 Riassumendo Caratteristiche inusuali ( a cavallo tra le malattie neurodegenerative e le malattie infettive) Descritte in molte specie di mammiferi Trasmissibili almeno in alcuni casi dagli animali all uomo Influenzate da una importante base genetica Non è nota la funzione della PrPC La stessa PrPSc sembra essere l agente patogeno Le modificazioni strutturali alla base della conversione della PrPC in PrPSc non sono chiare La ricerca della PrPSc è attualmente l unico test diagnostico 19

20 1. Introduzione alle malattie da prioni 2. Genetica delle malattie da prioni 3. I piani di selezione genetica degli ovini 4. I ceppi 5. La sorveglianza genetica e sui ceppi 6. Il rischio per l uomo 7. Diagnosi RAGIONI DELL INTERESSE DELLE AUTORITA SANITARIE DELL UE PER LE EST DEI PICCOLI RUMINANTI Esiste il rischio che l agente della BSE possa circolare, non riconosciuto, nelle popolazioni ovi-caprine E possibile che la BSE abbia avuto origine dalla scrapie Dopo la comparsa della BSE, la scrapie è diventata una presenza scomoda per i paesi che la registrano Il rischio delle EST animali per l uomo ha confini poco definiti Le guerre commerciali impiegano spesso leve sanitarie Esistono diversi ceppi di scrapie con caratteristiche di patogenicità verosimilmente diverse Anche rispetto alla scrapie le conoscenze sono limitate 20

21 21

22 1. Introduzione alle malattie da prioni 2. Genetica delle malattie da prioni 3. I piani di selezione genetica degli ovini 4. I ceppi 5. La sorveglianza sui ceppi 6. Il rischio per l uomo 7. Diagnosi Gorman et al., J. Virol.,

23 scrapie Ceppi di prioni (Pattison & Milson, 1961) Caratteristiche biologiche dei ceppi scrapie naturale Linee di topo BSE FSE vcjd Tempi di incubazione (in giorni) (Bruce et al., 1997) 23

24 PROFILI DELLE LESIONI CEREBRALI IN TOPI INOCULATI CON BSE, SCRAPIE E vcjd BSE SCRAPIE vcjd Aree Encefaliche 1-midollo 2-corteccia cerebellare 3-collicolo superiore 4-ipotalamo 5-talamo 6-ippocampo 7-setto 8-corteccia cerebrale posteriore 9-corteccia cerebrale anteriore Modello A Conversione PrP C PrP Sc mediante interazione diretta a stampo Template-directed refolding hypothesis Modello B Generazione di diversi ceppi mediante aggregazioni differenti della forma prionica monomerica Seeded nucleation hypothesis Sup35 PrP C PrP Sc Ceppo A PrP Sc Ceppo B Sup35 forma prionica Ceppo A Ceppo B 24

25 I PRIONI, MAESTRI DI ORIGAMI Tipizzazione dei ceppi di TSE Manca una definizione appropriata di ceppo Tipizzazione fenotipica Tipizzazione biologica Tipizzazione molecolare 25

26 Biological strain typing is based on the study and comparison of the disease phenotype after experimental transmission in animal models BSE FSE Isolate 1 Isolate 2 Isolate vcjd Bruce et al., 1997 Crozet et al., 2001 Tipizzazione molecolare Basata sull analisi della PrP Sc dopo digestione con proteinasi K Bessen and Marsh, J Vir

27 SCRAPIE OVINA 200 gg 90 gg BSE >1000 gg 360 gg La barriera di trasmissione non è assoluta 263K Una specie apparentemente resistente può replicare prioni senza avere sintomi 27

28 188 ± 22 CJD no disease no disease 188 ± 17 28

29 COMMISSION OF THE EUROPEAN COMMUNITIES SANCO/19/2003 WORKING DOCUMENT Jan 2003 CONTINGENCY PLANNING FOR THE CONFIRMATION OF BOVINE SPONGIFORM ENCEPHALOPATHY (BSE) IN SMALL RUMINANTS The Worst Case Scenario. omissis Member States should consider a worst-case scenario where: sheep meat is excluded from the food chain unless derived from: Heterozygous ARR sheep under the age of 6 months; Homozygous ARR sheep under the age of 18 months; sheep and goat milk is excluded from the food and feed chain. They should also make an inventory of their capacity in terms of TSE testing and in terms of flock certification on the basis of history, monitoring etc. Alternative Scenarios.. Reg 999/2001 ALLEGATO X LABORATORI DI RIFERIMENTO, PRELIEVO DI CAMPIONI E METODI DI LABORATORIO CAPITOLO C Campionamento e analisi di laboratorio Art 3.2 c) Ulteriore esame dei casi positivi di scrapie (Tipizzazione molecolare dei ceppi) i) sono inviati per ulteriori esami mediante un metodo di tipizzazione molecolare iniziale ad un laboratorio designato dall autorità competente che abbia partecipato con successo ai controlli di competenza organizzati dal laboratorio comunitario di riferimento quanto all uso di un metodo di tipizzazione molecolare ii) Prova interlaboratorio con ulteriori metodi di analisi molecolare I campioni prelevati da casi di scrapie, in cui la presenza della BSE non può essere esclusa devono essere inviati al CRL e vengono sottoposti a una prova interlaboratorio I risultati sono interpretati dal laboratorio comunitario di riferimento, assistito da un gruppo di esperti. I campioni che indicano la presenza di BSE in base a tre metodi differenti sono ulteriormente analizzati con prova biologica sui topi per ottenere una conferma definitiva. 29

30 Flusso Campioni Sorveglianza passiva Sorveglianza attiva IZS Test rapido CEA Conferma diagnostica Caratterizzazione neuropatologica ISS Determinazione del genotipo Caratterizzazione molecolare (e biologica) Test approvati per la discriminazione VLA (UK) AFFSA (Francia) CEA (Francia) FLI (Germania) CIDC (Olanda) ISS (Italia) WB M. Stack IHC M. Jeffrey WB T. Baron WB J.P. Deslys ELISA J. Grassi WB M. Groschup WB J. Langeveld WB U. Agrimi, R. Nonno Principi di funzionamento Differente sensibilità alla proteolisi in vitro (WB e ELISA) ed in vivo (IHC) 30

31 Schema di sorveglianza per la discriminazione scrapie/bse 1 Analisi con WB discriminatorio BSE non esclusa 2 CRL STEG ring trial Scrapie BSE-like 3 Tipizzazione biologica BSE Metodi discriminatori: WB (ELISA) mab SAF84 PrP Sc N-term mab P4 C-term Digestione con PK mab P4 PrP Scrapie BSE-Ov 31

32 WB discriminatorio: discriminazione con anticorpi N-terminali A R Q A R Q A R Q A A R R/H QBSE ovina Q A R Q SAF84 SAF84/P4 ratio P Scr Scr Scr Scr BSE Ov Scr Scr Atypical scrapie BSE Classical scrapie BSE-like BSE-like BSE Class. scrapie Nor98 Nor98 Small ruminant TSEs Analisi molecolare con WB discriminatorio permette di distinguere almeno 4 tipi di PrP Sc : kda scrapie (scrapie classica) kda/high glycoprofile (BSE) kda/low glycoprofile (CH1641-like) 4. 11/12 kda (Nor98) Ai fini della discriminazione scrapie/bse, nei casi 2 e 3 non si può escludere la BSE e bisogna fare il ring trial e/o la tipizzazione biologica 32

33 Scrapie - molecular strain typing PK-resistant core of PrP Sc in ARQ/ARQ sheep with Scrapie, BSE and Nor98 SAF32 P4 9A2 L42 SAF84 octarepeat 93/99102/ / / N N S S GPI Scrapie ~ N N S S GPI BSE ~ N N S S GPI Nor98 ~90 ~155 Small ruminant TSE official surveillance in Italy. Case n /1/4 Sheep Bergamasca breed 4.5 years old ARQ/ARQ 141L/F 52191/1/ Case n /1/4 shows a complex banding pattern with a triplet similar to classical scrapie and a prominent band of ~ 12 kda similar to Nor98 33

34 CTRL Class Scrapie ARQ/ARQ L/F /1/4 cortex ARQ/ARQ L/F /1/4 obex ARQ/ARQ L/F141 CTRL Nor98 (Norway) ARQ/ARQ F/F141 CTRL Nor98 (Italy) ARR/ARR Bank vole tg338 mice 52191/1/4 obex Bank voles and tg338 mice developed pure classical scrapie and Nor98 infections, respectively

35 52191/1/4 obex Bank voles CTRL Classical scrapie 52191/1/4 obex Tg338 mice Bank voles mean vacuolation score CTRL Nor98 (Italy) 4 CTRL Classical scrapie 52191/1/4 (obex) Tg338 mice mean vacuolation score scoring area in brain /1/4 (cortex) 52191/1/4 (obex) CTRL Nor98 (Italy) CTRL Nor98 (Norway) scoring area in brain 35

36 BARRIERA DI TRASMISSIONE OMOLOGIA SEQUENZA PrP TRA DONATORE E RICEVENTE (cd barriera di specie ) CEPPO DI AGENTE VIA DI ESPOSIZIONE TITOLO INFETTANTE TIPOLOGIA DI ESPOSIZIONE 263K 263K 263K TgHa TgHa L identità di sequenza PrP tra ricevente e donatore abroga la barriera di specie 36

37 Ma La BSE e la vcjd si trasmettono meglio in topi wild-type che non nei modelli TgBov e TgHu Topi wt TgHu vcjd scjd fcjd / La barriera di trasmissione non dipende solo dalle specie coinvolte, ma anche dal ceppo LA BARRIERA DI TRASMISSIONE Colinge and Hill,

38 Il gene della PrP è altamente conservato nei mammiferi. E stato suggerito che un limitato ma significativo numero di conformazioni della PrP Sc siano possibili dal punto di vista termodinamico; queste costituirebbero il range di ceppi di prioni osservabile. Nell ambito di una singola specie di mammifero, solo una parte di queste conformazioni sarebbe possibile. Qualora vi sia sostanziale analogia nelle conformazioni favorite della PrP Sc di due specie, la trasmissione interspecifica verrebbe facilitata. Al contrario, lì dove non vi siano conformazioni preferenziali in comune, la trasmissione incontrerebbe difficoltà. In accordo con tale ipotesi, la BSE rappresenterebbe un modello conformazionale particolarmente favorito dal punto di vista termodinamico, mostrandosi permissivo ad un vasto range di PrP di varie specie animali Collinge,

39 ISS (I) U. Agrimi R. Nonno, G. Vaccari M. Di Bari, GM Cosseddu, G.Scavia, L. Morelli, B. Chiappini, C.D Agostino, L. Pirisinu, C. Bucalossi, P. G. Antonucci, Fazzi, E. Esposito, M. Conte, S. Marcon, C. Parisi, N.Palazzini, S. Simson, P. Frassanito Collaborations: ISS (I) M. Pocchiari, F. Cardone VLA (UK) O. Windl, M. Jeffrey, L. Gonzalez LMU (D) H.A. Kretzschmar, U. Bertsch UZH (CH) H-P. Lipp, G. Dell Omo IAH (UK)M. Bruce AFSSA (F) T. Baron INRA (F) H. Laude INIA (E) J.M. Torres FLI (D) M. Groschup TSRI (USA) J. Castilla UTMB (USA) C. Soto CEA (I) M. Caramelli IZSLT (I) L. De Grossi EuroVolTE (QLRI-CT ) NoE NEUROPRION Italian Ministry of Health 39