Terapia fagica. Selezione del fago fd2 specifico per l E. coli O157:H7

Transcript

1 Terapia fagica Selezione del fago fd2 specifico per l E. coli O157:H7

2 Ruolo dei fagi nella ecologia microbica I fagi sono gli organismi più diffusi sul pianeta. Il loro numero è stato stimato intorno a Il numero dei batteri è di poco più piccolo. I fagi controllano la moltiplicazione dei batteri e quindi il riciclo di una enorme massa organica.

3 Terapia fagica I fagi Twort (1915) d Herelle (1918) La resistenza agli antibiotici Il ritorno della terapia fagica

4 Terapia fagica: il contesto 2001 Loeffler et al., Science, 294, 2170 Nelson et al., Proc Ntl Acad Sci, USA, 98, 4107 Lisina fagica attiva contro lo Streptococcus pnemoniae 2002 Schuck et al., Nature, 418, 884 Lisina fagica attiva contro il Bacillus antracis

5 Terapia fagica: il contesto 2002 Cerveny et al., Inf. Immun., 70, 625 Fago attivo contro il Vibrio vulnificus Biswas et al., Inf. Imm, 70, 204 Fago attivo contro l Enterococcus faecium 2003 Merril et al., Nature Review Drug Discov, June 2, 489. Loeffler et al. Inf. Immun. 71, 6199 Lisina fagica attiva contro lo Streptococcus pneumoniae Campbell A. Nature Review Genetics, 4, 471.

6 Terapia fagica: il contesto 2004 Schoolnick G., Summers W. J. Watson. Nature Biotechnology 22, 506 Projan S. Nature Biotechnology 22, 167 Thiel K. Nature Biotechnology, 22, 31 Fischetti V. Lancet, The Lancet Infectious Diseases, 4, 246. Dixon B. The Lancet Infectious Diseases 4, 186.

7 Fagi attivi contro batteri intracellulari Broxmeyer et al (J. Inf.Dis. 2002, 186, 1155) hanno dimostrato che è possibile usare il Mycobacterium smegmatis, un micobatterio avirulento, come vettore per trasferire all interno dei macrofagi il fago litico TM4. Il metodo è risultato efficace in vitro nel ridurre il numero dei micobatteri M. avium o M. tuberculosis intracellulari.

8 Terapia fagica. Vantaggi rispetto agli antibiotici. I fagi sono attivi contro ceppi batterici antibioticoresistenti Ceppi vancomicina-resistenti di Enterococcus faecium (Biswas et al., Infect. Immun. 2002, 70, 204). Ceppi meticillina-resistenti di Staphylococcus aureus (Matsuzaki et al., J. Infect. Dis. 2003, 187, 613).

9 Limiti della terapia fagica. I batteri sviluppano resistenza contro i fagi Il tasso con cui i batteri sviluppano resistenza ai fagi è circa 10 volte più basso del tasso con cui compare la resistenza agli antibiotici (Sulakvelidze et al., Antimicrobial. Agents and Chem., 2001, 45, 649). Nelson et al. (PNAS 98, 4107, 2001), Schuck et al. (Nature, 418, 884, 2002) non sono riusciti ad isolare batteri fago-resistenti; sono però riusciti ad isolare facilmente batteri antibiotico-resistenti.

10 Diverse tossine batteriche sono prodotte da fagi La tossina del Corynebacterium diphteriae. La tossina del Vibrio cholerae. La tossina Shiga dell E. coli. Gli Streptococchi del gruppo A sono molto eterogenei dal punto di vista genetico e della virulenza. Gran parte di queste differenze sono dovute alla presenza di batteriofagi.

11 Limiti della terapia fagica I fagi vengono riconosciuti dal sistema immune innato ed eliminati entro poche ore dalla somministrazione

12 I fagi hanno un host-range ristretto. Non danneggiano la normale flora intestinale (vantaggio) Impiego limitato nella pratica clinica (svantaggio). L ingegneria genetica ha però sviluppato fagi modulari (che esprimono non uno, ma diversi recettori) in grado di infettare diverse specie batteriche (Merril et al., Nature Reviews, 2003, 2, 489)

13 Terapia fagica Ceppo non patogeno di E.coli E. coli O157:H7 Data la straordinaria diversità dei fagi, non è difficile isolare il fago con l host range desiderato.

14 Terapia fagica: selezione per 10 2 PFU fw /tubo l attività litica in vitro 10 2 PFU fw /tubo 2h 10 6 CFU ceppo E. coli non patogeno 10 7 CFU ceppo E. coli non patogeno Dopo 10 cicli di selezione: 10 2 PFU fw in 2h lisano 10 2 CFU E. coli 10 2 PFU fd1 in 2h lisano 10 9 CFU E. coli

15 Terapia fagica: selezione del fago fd1 per la persistenza nel sangue Protocollo PFU fd1 Titolo fagico 8h: 5x10 3 PFU/ml 24h: 0 Titolo del fago fd1 dopo 5 cicli di selezione: 18 h: 4x10 3 PFU/ml

16 Terapia fagica. Selezione del fago fd1 per la persistenza nel sangue Protocollo 2 G1: 10 8 PFU fd1/topo G1: 10 8 PFU fd1/topo G1: 10 9 CFU E. coli non pat/topo Titolo fd2 nel sangue al G 38: 4x10 8 PFU/ml G1: 2.5x10 8 CFU E. coli non pat/topo G2: 2.5x10 8 CFU E. coli non pat/topo G3: 2.5x10 8 CFU E. coli non pat/topo G4: 2.5x10 8 CFU E. coli non pat/topo Titolo fd2 nel sangue al G 38: 7x10 9 PFU/ml Merril et al. (Proc Ntl Acad Sci, USA, 1996, 93, 3188): 2x10 3 PFU/ml a 24h (inoculo iniziale: 5x10 7 PFU)

17 L efficacia della selezione è il risultato della: Brevità delle generazioni (di fagi e batteri) Elevata densità delle popolazioni (di fagi e batteri) Aploidia (che consente ad una mutazione di esprimersi anche se in copia singola) Somministrazione ai topi del ceppo non patogeno di Escherichia coli (che ha consentito alla popolazione fagica di espandersi esponenzialmente)

18 Terapia fagica. Storia naturale del fago fw. fw (il fago selvaggio, isolato dal letame) fd1 (fw selezionato rispetto alla virulenza) fd2 (fd1 selezionato rispetto alla persistenza nel sangue)

19 Distribution of phage fw and fd2 in vivo a Titer (PFU/gr) Titer (PFU/ml) Phage Time (h) Liver Spleen Blood fw b x 10 7 ± 1.1 x 10 7 ± 2.6 x 10 7 ± 1.0 x x x 10 fd2 b x 10 6 ± 1.0 x a Values are means ± s.d. of three replicas. b Phage number inoculated at time 0: 10 8 PFU/mouse.

20 Distribution of phage fw and fd2 in vivo a Titer (PFU/gr) Titer (PFU/ml) Phage b Time (h) Liver Spleen Blood fw x x 10 0 ± 1.5 x 10 6 ± 1.5 x 10 6 fd x 10 7 ± 0.6 x a Values are means ± s.d. of three replicas. b Phage number inoculated at time 0: 10 8 PFU/mouse.

21 Distribution of phage fw and fd2 in vivo a Titer (PFU/gr) Titer (PFU/ml) Phage Time (h) Liver Spleen Blood fw x x 10 0 ± 1.2 x 10 8c ± 1.3 x 10 8c fd x 10 8 ± 0.5 x 10 8c 8 a Values are means ± s.d. of three replicas. b Phage number inoculated at time 0: 10 8 PFU/mouse. c Phage replicate in vivo, presumably infecting E.coli bacteria present in the intestinal tract.

22 Terapia fagica. Stabilità del fago fd2. fd2 ha conservato per oltre 8 mesi il livello di virulenza e persistenza acquisiti attraverso la selezione. Nel corso di questi mesi è stato amplificato e congelato infinite volte.

23 Terapia fagica. Caratterizzazione del fago fd2.

24 Terapia fagica. Caratterizzazione del fago fd2.

25 Terapia fagica. fw ed fd2 sono imparentati tra loro. M M fw fw fw fw fw fw fd2 fd2 fd2 fd2 fd2 fd2 fw e fd2 analizzati con 6 diversi random primers

26 PCR gene msp dei fagi fw e fd2 fw = a, c fd2 = b, d M = marker

27 Terapia fagica. Selezione del fago fd1 per la persistenza nel sangue Protocollo 2 G1: 10 8 PFU fd1/topo G1: 10 8 PFU fd1/topo G1: 10 9 CFU E. coli non pat/topo Titolo fd2 nel sangue al G 38: 4x10 8 PFU/ml G1: 2.5x10 8 CFU E. coli non pat/topo G2: 2.5x10 8 CFU E. coli non pat/topo G3: 2.5x10 8 CFU E. coli non pat/topo G4: 2.5x10 8 CFU E. coli non pat/topo Titolo fd2 nel sangue al G 38: 7x10 9 PFU/ml Merril et al. (Proc Ntl Acad Sci, USA, 1996, 93, 3188): 2x10 3 PFU/ml a 24h (inoculo iniziale: 5x10 7 PFU)

28 Il fago mutante fd2 è diventato rapidamente dominante M fw fd2 fw fd2

29 Antibacterial activity of phage fw and fd2 in vivo a Bacterial titer (CFU/gr) Treatment Time (h) Liver Spleen Kidney Faeces E. coli O157:H7 b x ± 1.2 x 10 8 ± 1.2 x 10 8 ± 1.7 x 10 8 ± 2.4 x x x x E. coli O157:H7 b x x x x 10 + fw c ± 2.1 x 10 7 ± 0.6 x 10 7 ± 1.7 x ± 1.5 x 10 7 E. coli O157:H7 b x x x x 10 + fd2 c ± 2.1 x 10 6 ± 1.5 x 10 6 ± 1.5 x ± 1.9 x 10 6 a Values are means ± s.d. of three replicas. b 10 7 CFU/mouse. c 10 8 PFU/mouse.

30 Antibacterial activity of phage fw and fd2 in vivo a Bacterial titer (CFU/gr) Treatment Time (h) Liver Spleen Kidney Faeces E. coli O157:H7 b x x x x 10 ± 1.5 x 10 8 ± 1.2 x 10 8 ± 1.3 x ± 2.1 x 10 9 E. coli O157:H7 b x x x x 10 + fw c ± 0.3 x 10 5 ± 0.8 x 10 5 ± 0.2 x ± 1.5 x 10 5 E. coli O157:H7 b x x x x 10 + fd2 c ± 2.5 x 10 2 ± 3.0 x 10 2 ± 1.5 x ± 3.0 x 10 2 a Values are means ± s.d. of three replicas. b 10 7 CFU/mouse. c 10 8 PFU/mouse.

31 Antibacterial activity of phage fw and fd2 in vivo a Bacterial titer (CFU/gr) Treatment Time (h) Liver Spleen Kidney Faeces E. coli O157:H7 b x ± 2.5 x 10 8 ± 1.8 x 10 8 ± 2.5 x 10 9 ± 2.2 x x x x E. coli O157:H7 b x x x x 10 + fw c ± 1.7 x 10 4 ± 0.5 x 10 4 ± 2.0 x ± 0.9 x 10 5 E. coli O157:H7 b + fd2 c a Values are means ± s.d. of three replicas. b 10 7 CFU/mouse. c 10 8 PFU/mouse.

32 Terapia fagica. Attività terapeutica del fago fd2. Gruppo di controllo Gruppo sperimentale G1-40 topi: 10 7 CFU E.coli patogeno G5 n topi morti: 39/40 G1-40 topi: 10 7 CFU E.coli pat PFU fd2 G10 n topi morti: 16/40

33 Curve di sopravvivenza dei topi trattati con il fago fd2 (A) e non (B).