Listeria monocytogenes e delle tossine botuliniche

Transcript

1 Caratterizzazione dei fattori di virulenza di Listeria monocytogenes e delle tossine botuliniche Giovanna Franciosa francios@iss.it Workshop: Focus su Sicurezza d Uso e Nutrizionale degli Alimenti Roma novembre 2005, ISS

2 Listeria monocytogenes Asporigeno Microaerofilo Produce fattori di virulenza Clostridium botulinum Sporigeno Anaerobio obbligato Neurotossigeno

3 Patogenesi della listeriosi umana

4 Meccanismo infettivo di L. monocytogenes

5 Principali fattori di virulenza che governano il meccanismo infettivo di L. monocytogenes Fattore Ruolo InlA InlB Hly PI-PLC PLC ActA Mpl PC-PLC PLC PrfA Adesione epitelio GI e placentare Adesione epatociti ed altre cellule Citolisina; ; lisi vacuolo Fattore accessorio lisi vacuolo I Movimento intra- ed inter-cellulare Attivazione PC-PLC PLC Fattore accessorio lisi vacuolo II Regolatore positivo trascrizione GENI VIRULENZA

6 Listeriosi invasiva e gastroenterica Invasiva Gastroenterica SNC e placenta Popolazione ad alto rischio (immuno-compromessi,, anziani, donne in gravidanza, neonati) Dose infettiva: bassa Tempo medio d incubazione 2-33 settimane Tratto Gastrointestinale Persone che non presentano fattori di predisposizione Dose infettiva: alta Tempo medio d incubazione ore

7 Episodi di gastroenterite associati a L. monocytogenes Luogo Anno Numero di casi Veicolo Rif. Giappone Formaggio Kawamoto et al., 2004 Svezia Latticini Carrique-Mas et al., 2003 USA Sandwich tacchino Frye et al., 2002 Australia Carni ready-to-eat Sim et al., 2002 Finlandia Trota Miettinen, 1999 Italia Insalata di mais Aureli et al., 2000 Canada Polpa di granchio Farber et al., 2000 Danimarca Sconosciuto Heitmann et al., 1997 USA Latte al cioccolato Dalton et al., 1997 Italia Insalata di riso Salamina et al., 1996 USA Gamberi Riedo et al., 1994

8 Ceppi di L. monocytogenes paragonati per caratteristiche di virulenza 30 CEPPI TOTALI 27 CLINICI 3 NON-UMANI 9 di sierotipo 1/2b 18 di sierotipo 4b ATCC 15313, n.s., avirulento 6 INVASIVI 1 da un outbreak 5 da casi sporadici 3 GASTROENTERICI 16 INVASIVI Ceppo ScottA 15 da casi sporadici 2 GASTROENTERICI ATCC 43248, 1/2a avirulento L 254 (Italia) L 90 (Italia) L 285, n.s. G6006 (USA) F60594 (Danimarca) C1340 (Canada)

9 Valutazione della virulenza dei ceppi di L. monocytogenes Approccio molecolare PCR-RFLP RFLP di 8 principali geni associati alla virulenza (VAG) Test di virulenza in vivo su topini inoculo (i.p.) intra-peritoneale tipizzazione PFGE inoculo (i.g.) intra-gastrico

10 Prodotti PCR di ActA ristretti con DraI M ScottA L439 L66 L67 L335 L337 L339 L340 L344 L349 L448 L599 L645 L864 L958 L959 L90 F60594 M Ceppi 4b 4b 700 bp 400 bp 800 bp 300 bp M L2818 L310 L312 L330 L364 L941 L254 G6006 C1340 L285 ATCC43248 Ceppi 1/2b 500 bp Ceppi avirulenti

11 Profili PFGE con ApaI M ScottA C134 0 L439 L66 L67 L335 L337 L339 L340 L344 L349 L448 L599 L645 L864 L958 L959 L90 F60594 L285 ATCC43 ATCC15 M M L2818 L310 L312 L330 L364 L941 L254 G M Ceppi 4b Ceppi Ceppi 1/2b avirulenti

12 Conte batteriche recuperate negli organi dei topi inoculati i.g p < 0.05 intestine liver spleen Log10 CFU/g organ Scott A (4b) L 90 (4b) L 2818 (1/2b) L 254 (1/2b) Scott A (4b) L 90 (4b) L 2818 (1/2b) L 254 (1/2b) Scott A (4b) L 90 (4b) L 2818 (1/2b) L 254 (1/2b)

13 Listeria monocytogenes sierotipo 4b CLONI EPIDEMICI (EC) Markers per ECI 17B 17B M 85M ECI Altri ECI 4b ECII Altri 4b ECII Markers per ECII

14 Markers specifici dei cloni epidemici M M M bp A ECI-specific markers B ECII-specific markers

15 Distribuzione dei markers epidemici fra i ceppi di L. monocytogenes 4b isolati in Italia 81 ceppi analizzati 14 ECI 14 ECII 34.6% 6/32 clinici (18.7%) 7/32 clinici (28%) 7/44 alimentari (15.9%) 6/44 alimentari (13.6%) 1/5 ambientale (20%) 1/5 ambientale (20%)

16 Studio del fattore di virulenza Internalina (InlA) Internalin-mediated Listeria invasion

17 Internalina: : forma intera e forma troncata InlA intera InlA troncata

18 Internalina dei ceppi clinici di L. monocytogenes isolati in Italia 65 ceppi analizzati mediante Western blotting 7 producono internalina troncata

19 FARMACO BOTULISMO Beauty TOSSINA TOSSINA BOTULINICA BOTULINICA the Beast and COSMETICO ARMA BIOLOGICA

20 Struttura e meccanismo d azione della tossina botulinica

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22 Tossine botuliniche e targets

23 Cluster genici codificanti per i complessi tossici

24 Struttura del cluster genico per la tossina botulinica di tipo A (bont/a) Tipo A1 ha70 ha17 ha33 botr/a ntnh bont/a1 Tipo A2 orfx2 orfx1 botr/a p47 ntnh bont/a2

25 Prodotti PCR di ha33 e p47 da C. botulinum tipo A bp A CL91 CL130 CL29 62A CL91 CL130 CL ha33 (774 bp) p47 (1236 bp)

26 Pattern di restrizione con XbaI dei prodotti PCR di bont/a bp 62A CL91 S157CL130 CL186 CL127 CL29 CL104 bp Tipo A1 Tipo A2 800

27 Cluster genico di bont/a Strains ha33 gene p47gene bont/a RFLP type bont/a gene cluster C. botulinum type A 10 (U.S.) + A (Italy) + A2 2 2 (U.S.) + A1 3 C. botulinum type Ab 4 (Italy) + + A2 2 1 (U.S.) + + A1 3 C. botulinum type A(B) 5 (U.S.) + + A1 3 1 (U.S.) + + A2 2

28 Strategia di Sequenziamento Cluster genico di BoNT/A (CEPPO C. botulinum MASCARPONE ) K2 Frammento 1: ~ 5Kb NT1 K33 Frammento 2: ~ 5Kb K6 K2 2 1 NT K K6

29 Orfs individuati nella sequenza del ceppo Mascarpone (10,6 Kb) ORF Nucleotidi Aminoacidi % identità ceppo Kyoto-F (A2) % omologia ceppo Kyoto-F (A2) % identità ceppo NCTC2916 (A1) % omologia ceppo NCTC2916 (A1) ORFX2 (parziale) ORFX botr p NTNH bont/a

30 Ruoli delle proteine accessorie Protezione della tossina nel tratto gastrointestinale Legame alle pareti intestinali Interazione con i residui di carboidrati sui globuli rossi Ruolo nella stabilità dell agente terapeutico Differenze nella sequenza aminoacidica della tossina botulinica tipo A Diverse proprietà antigeniche Diversità nel riconoscimento del recettore?

31 Ringraziamenti Paolo Aureli Laura Toti Francesca Floridi Antonella Maugliani Concetta Scalfaro