Il challenge test su Clostridium botulinum

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1 Il challenge test su Clostridium botulinum Un caso studio sul comportamento di Clostridium botulinum in prodotti RTE Chiara Romani 21 maggio 2014, Chelab Silliker Symposium

2 C. botulinum, generalità Gram +, anaerobio, sporigeno, ubiquitario it i Conserve casalinghe Prodotti ittici refrigerati fi Journal of Food Microbiology ISSN

3 Condizioni di crescita C. botulinum Gruppo I C. botulinum Gruppo II Proteolitico Tossine A, B, F Non proteolitico Tossine B, E, F Minimo C Minimo 3 C ph > 4,6 ph > 5,0 Aw > 0,94 Aw > 0,97 NaCl 10% NaCl 5% Spore termoresistenti Spore media termoresistenza 50 ng di neurotossina intossicazione, morte 3

4 Botulismo in Italia Mascarpone (tossina A) no microflora antagonista, ph >6, abuso termico Epicentro 4

5 Botulismo in Europa e in USA EU: Francia: tapenade (2011) tossina A Est Europa conserve casalinghe USA: Skordalia (1994), tossina A 110 casi all anno: 25% alimenti cibi preparati e non idonea conservazione Canned chili sauce (tossina A), 2007 mortalità ridotta da 50% a 8%, ma elevati costi Epicentro e CDC 5

6 Caso studio 6

7 Caratteristiche del prodotto RTE Crudo, non trattato termicamente Shelf life: 30 giorni Condizioni di stoccaggio: 4 C Potenz. redox: mv condizioni anaerobiche olio ph: 4,8 4,9 Aw: 0,93-0,94 C. botulinum mesofilo (gruppo I) 7

8 Caso studio 1 Step Obiettivo: determinare la stabilità di un lotto di pesto Challenge test con C. botulinum mesofilo Condizioni di abuso termico 8

9 Challenge test Numero di lotti analizzati: 1 Scelta dei ceppi: mix di 2 ceppi NCTC3815 e NCTC 751 Preparazione dell inoculo: coltivare i ceppi in RCM broth in anaerobiosi a 37 C per 3 gg mix Determinazione della caratteristiche chimico-fisiche al tempo 0 Preparazione delle unità campionarie: 3 campioni inoculati (A,B e C) e 3 non inoculati (D, E e F) per ogni step analitico 9

10 Challenge test Concentrazione inoculo: UFC/g di prodotto Procedura di inoculo: inoculare le unità campionarie con il mix di ceppi Condizioni di stoccaggio: 20 C per 15 gg abuso termico Analisi microbiologiche: Conta t=0 + 6 step analitici: - Cl. Botulinum mesofilo (Shahidi-Fergusson-Perfringens agar mod.) - flora lattica naturalmente presente (ISO15214:1998) 10

11 Challenge test Risultati : ph aw 4,84 ±0,10 0,931± 0,005 C. botulinum (Log UFC/g) Tempo (gg) A B C 0 1,70 1,78 1,70 2 1,60 1,70 1,85 4 1,30 1,70 1,60 6 1,30 1,30 1,30 8 1,90 1,85 2, ,60 1,30 1, ,60 1,85 GP +0,20 +0,07 +0,34 Batteri lattici (Log UFC/g) tempo (gg) D E F 0 5,41 5,32 5,32 2 5,18 4,96 5,20 4 4,89 6,04 4,85 6 5,57 5,38 5,04 8 6,15 6,18 6, ,86 6,87 6, ,87 6,26 5,99 Growth potential <05 0,5 no crescita 11

12 Conclusioni 1 Step C. botulinum (Gruppo I) non cresce nel lotto aw e ph ostacolano la crescita di C. botulinum Effetto sinergico 12

13 Considerazioni Risk assessment = garantire Sicurezza del prodotto Fattori controllo crescita C. botulinum Aw variabile da lotto a lotto 2 Step 13

14 2 Step Implementare Challenge test per trovare parametro aw permissivo a C. Botulinum (gruppo I e II) 5% H2O 10% H2O 15% H2O 20% H2O 25% H2O 30% H2O 14

15 Challenge test Numero di lotti analizzati: 1 Scelta dei ceppi: mix di 4 ceppi NCTC3815, NCTC 751 (Gruppo I) NCTC8266, NCTC6550 (Gruppo II) Preparazione dell inoculo: coltivare i ceppi in RCM broth in anaerobiosi a 30 C - 37 C mix Preparazione delle unità campionarie: 6 campioni i diluiti iti con acqua distillata t sterile al 5, 10, 15, 20, 25, 30 % Determinazione della caratteristiche chimico-fisiche al tempo 0 15

16 Challenge test Concentrazione inoculo: 100 UFC/g di prodotto Procedura di inoculo: inoculare i 6 campioni con il mix di ceppi Condizioni di stoccaggio: 20 C per 15 gg Analisi microbiologiche: Conta t=0 + 6 step analitici: - Cl. Botulinum (Shahidi-Fergusson-Perfringens agar mod.) - Flora lattica naturalmente presente (ISO15214:1998) negli ultimi 3 step analitici 16

17 Challenge test Risultati Caratteristiche chimico-fisiche: Campione % di H2O aggiunta Growth rate * Growth rate* ph aw (20 C) (20 C) predittivo predittivo Mesofilo Psicrofilo 1 5 4,94 0,935 ND ND ,95 0,950 ND ND ,97 0,954 0, ND ,93 0,960 0,002 ND ,86 0,963 0, ND ,87 0,970 0,004 ND aw è f (% H2O aggiunta) *dati estrapolati da Combase predictive model 17

18 Challenge test C. Botulinum Log UFC/g Campione 1 Campione 2 Campione 3 Campione 4 Campione 5 Campione 6 Tempo (gg) 5% 10% 15% 20% 25% 30% , , , , , ,95 3 2,15 1,90 2,15 1,85 2,08 2,11 6 1,90 1,85 1,95 2,00 2,00 1,90 9 1,95 2,04 2,08 2,04 1,95 2, ,23 2,11 2,08 2,32 1,90 1, ,04 1,85 1,90 2,00 1,70 2,18 GP +0,33 +0,07 +0,13 +0,24 +0,08 +0,25 No crescita GP < 0,5 Batteri lattici Log UFC/g Campione 1 Campione 2 Campione 3 Campione 4 Campione 5 Campione 6 tempo (gg) 5% 10% 15% 20% 25% 30% 9 8,18 8,20 8,08 8,65 8,38 8, ,48 8,61 8,74 8,78 8,54 8, , , , , , ,65 Effetto antimicrobico della flora lattica 18

19 Agar well test 2 colonie di LAB (x e y) x e y in MRSB a 30 C per 48 h Agar sangue inoculo C.botulinum (2 step) 50 microlitri per pozzetto 30 C per 24 h x x y y 19

20 Conclusioni 2 Step C. botulinum gruppo I e II non crescono nel pesto alla genovese con 0,935 < aw < 0,970 LAB effetto antimicrobico: - elevata concentrazione - Agar well test t + Azienda deve monitorare periodicamente l aw 20

21 Riassumendo Processo Condizioni stoccaggio Crescita C.botulinun ph e aw Microflora indigena 21

22 Bibliografia Journal of Food Microbiology ISSN Clostridium botulinum and the safety of minimally heated chilled foods:an emergencing issue?. Mike Peck The EFSA Journal (2005) 199, 1-65 Clostridium spp. in foodstuffs. Food Standard d Agency Guidance on the Safety and Shelf life of Vacuum and Modified Atmosphere Packed Chilled Foods with Respect to Nonproteolytic Clostridium botulinum. November 2007 Clostridium botulinum Challenge Testing of Ready to eat Foods. Food Directorate, Health Canada, Essentials of the microbiology of foods, David A. A. Mossel 22

23 Grazie per l attenzione 23