Listeria monocytogenes Metodi di campionamento, analisi e sistemi di tipizzazione. Esperienze nel settore del prosciutto nella AUSL di Parma.

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1 Listeria monocytogenes Metodi di campionamento, analisi e sistemi di tipizzazione. Esperienze nel settore del prosciutto nella AUSL di Parma. Langhirano, 10 aprile 2014 Pongolini Stefano Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell Emilia-Romagna Bruno Ubertini

2 Listeria monocytogenes e prodotti carnei I prodotti a base di carne della tradizione italiana non sono esenti dal problema Listeria monocytogenes tra questi i prosciutti crudi di maggior rilevanza economica in Europa è imposto un limite massimo di contaminazione per questi prodotti durante la vita commerciale in diversi altri paesi (es. USA e Giappone) si richiede un limite più basso, corrispondente allo zero analitico con metodi analitici definiti

3 Metodi di campionamento Prodotto Ambiente (spugnette)

4 Metodi di campionamento Diversi ambienti e impianti

5 Metodi di campionamento PRODOTTO Materiali sterili: forbici, coltelli, bisturi, pinze, guanti, sacchetti Disinfettanti: acqua ossigenata-etanolo o equivalente prodotti iodati per gli insaccati Disinfettare l involucro esterno (se doppio) o l unico involucro Prelevare almeno 100 gr per LM a 0-4 C -> analisi entro 24h

6 Metodi di campionamento SUPERFICI Spugnette di cellulosa sterili (min 3,5x7,5 cm) e reidratante Sacchetti e guanti sterili Delimitatori per superficie (30x30 cm) Lavare e disinfettare mani ed avambracci Reidratare la spugna (9-10 ml) eliminare l eccesso Indossare il guanto sterile e strofinare (10x10 volte) Riporre la spugna in contenitore eliminando l aria in eccesso. Inviare al lab a 0-4 C -> analisi entro 24h

7 Metodi di campionamento SUPERFICI quali prelievi? Il piano prevede di massimizzare la sensibilità A contatto (10): In fase operativa (in lavorazioni post-letali) 70% dei campioni In fase pre-operativa (per raggiungere punti difficili) 30% Non a contatto (5): Ovunque c è il prodotto Zone non comunemente sanitizzate (es. zone aeree) Punti difficili o sensibili (scarichi, condense ecc.) Zone di passaggio o di incrocio con aree di lavorazione

8 Analisi F.S.I.S. Microbiology Laboratory Guidebook (MLG) 8.09 rev.9 (2013)

9 Analisi Trapianto in Fraser broth Piastratura in MOX

10 Analisi Test dell emolisi Prove biochimiche

11 Analisi Prove biochimiche

12 Analisi PREARRICCHIMENTO in UVM data esecuzione data trapianto positivo da HL(UVM) positivo da HL(F) data ARRICCHIMENTO in F trapianto in MOX a C a C esito a 24-28h pos neg se positivo esito a 24-28h pos neg esito a 46-50h pos neg esito a 46-50h pos neg data lettura semina diretta in MOX a C se positivo trapianto in HL esito a 24-28h pos neg a C per 18-26h esito a 46-50h pos neg da mox (UVM) pos neg data data lettura lettura trapianto in- BHI a C per 16-48h esito del test della mobilità negativo da HL(UVM) negativo da HL(F) lettura data lettura da mox (F) pos neg data lettura se positivo positivo da HL(UVM) positivo da HL(F) data trapianto in-tsyea a C per 18-26h negativo da HL(UVM) negativo da HL(F) lettura TEST BIOCHIMICI: API LISTERIA DA UVM DA FRASER N. data/operatore codice esito N. data/operatore codice 1 listeria 1 2 listeria 2 3 listeria 3 esito listeria listeria listeria ESITO: Listeria SP ESITO: Listeria monocytogenes lettura data pos neg pos neg

13 Analisi È possibile fare pool di campioni? Sì, adeguando i volumi di pre-arricchimento (5x25 gr) 100 ml/spugna se in pool di spugnette (max 5)

14 Listeria monocytogenes e prosciutto Da un decennio esiste uno specifico piano di controllo per Listeria monocytogenes sui prodotti carnei destinati all export USA Dati relativi al prosciutto crudo di Parma (diverse tipologie) per USA n. campioni positivi

15 Quanti positivi sono normali?

16 Listeria monocytogenes e prosciutto Dati relativi al prosciutto crudo di Parma (diverse tipologie) per USA n. campioni positivi

17 Epidemiologia molecolare - Identificazione e indagine di focolai - Tracciare il permanere e il diffondersi dei ceppi batterici

18 Presupposto Ceppi epidemici: espansione clonale di un singolo precursore

19 PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) Listeria monocytogenes (Apa I)

20 PFGE Process Patient Specimen Collection Specimen Grow isolated colony = + Cell Lysis and Plug Washing US Dime coin Cells Trapped in Plug Agarose Cell Suspension Universal Standard Restriction Electrophoresis Imaging Each gel that cont with a kn pattern. lanes mu CDC glo compute can com other ge well as t labs. Th normaliz Standard Bacteria Standard Bacteria Standard Bacteria

21 ain... il risultato! Gel Properly De-Stained n e

22 comparison

23 Listeria monocytogenes ITA-USA 2012 associazione tra caso umano US e prosciutti da ITA [stesso genotipo PFGE] CDC USDA/FSIS -> chiedono informazioni UE e ITA su PFGE Ceppo da disosso corrisponde al ceppo US Indagine approfondita sul disosso ritrova diverse positività per quello specifico genotipo PFGE dopo settimane dalla prima segnalazione

24 marker Asc I PR in doppio Asc I USA Apa I USA Apa I PR in doppio marker

25 Listeria monocytogenes esame superfici Piano di controllo per Listeria monocytogenes su prosciuttifici Parma attivi nell export USA esame delle superfici in lavorazione 24 prelievi da superfici sia a contatto che non, suddivisi in 4 categorie fondamentali: spogliatoi salatura lavaggio-stuccatura spedizione

26 Listeria monocytogenes esame superfici Risultati relativi a 19 prosciuttifici 25/447 campioni totali di superficie positivi (5,6%) 15/19 almeno una positività (79%) 0/19 spogliatoi 14/19 salatura 2/14 spedizione

27 Listeria monocytogenes esame superfici dei 25 positivi 20/25 (80%) nel reparto del fresco di salagione, (8 di queste 20 sulla macchina massaggiatrice in lavorazione). 3/25 (12%) nell area della macchina lava prosciutti (pozzetto) 2/25 (8%) nella zona di spedizione

28 Listeria monocytogenes esame superfici

29 100 Listeria monocytogenes ITA-USA disossato il positività segnalata a febbraio da FSIS tracciato US ricevuto a marzo, confrontato con 3 ceppi del da (1) scarpe del disosso (2) pavimento del disosso [uguali US] (3) scarico [diverso] PFGE-A PFGE-AscI-LIST 28 sugna salumificio sugna salumificio LMAS_PR.0025 enti spugnetta Martini Stagionatura E07N _14 alimenti spugnetta POE Martini LMAS_PR.0025 Stagionatura E07N 64 Spugnetta AUSL Reverberi 2013/143044_7 (Cozzolino DR7) 5364 Spugnetta AutocontrolloAUSLMAS_PR.0025 Reve 12 spugnetta Langhiraanese Prosciutti S.r.l /82197_2 Inviato da Lachiver Alimenti 5412 S.r.l. spugnetta FSIS Langhiraanese LMAS_PR.0025 Prosciutti S.r.l spugnetta Langhiraanese Prosciutti S.r.l /82197_3 Inviato da Lachiver Alimenti 5413 S.r.l. spugnetta FSIS Langhiraanese LMAS_PR.0025 Prosciutti S.r.l prosciutto Tracciato ricevuto 02/04/2014 Stabilimento USA I44 - IT 0758L prosciutto Tracciato LMAS_PR.0025 ricevuto 02/04/2014 Stab

30 Listeria monocytogenes ITA-USA Marzo dal prosciutto 2 diverse LM su 2 colonie testate dal pavimento 2 diverse LM [le stesse del prosciutto] su 4 colonie testate 1 sola LM su 6 colonie testate in apparecchiature [3 pre-operative e 3 post-operative] PFGE-AscI-L PFGE-AscI-LIST Isolato in US 11/2013 da stesso disosso 5402 spugnetta preoperativa San Francesco Prosciuttificio 2014/60550_2 S.P.A S spugnetta preoperativa - AUSL Parma San LMAS_PR.0031 Francesco Prosciuttificio A 5404 spugnetta preoperativa San Francesco Prosciuttificio 2014/60550_2 S.P.A A S spugnetta preoperativa - AUSL Parma San LMAS_PR.0031 Francesco Prosciuttificio B 5405 spugnetta preoperativa San Francesco Prosciuttificio 2014/60550_2 S.P.A B S spugnetta preoperativa - AUSL Parma San LMAS_PR.0031 Francesco Prosciuttificio 5399 spugnetta San Francesco Prosciuttificio 2014/60573_2 S.P.A S spugnetta - AUSL ParmaSan LMAS_PR.0031 Francesco Prosciuttificio A 5406 spugnetta San Francesco Prosciuttificio 2014/60573_2 S.P.A A S spugnetta - AUSL ParmaSan LMAS_PR.0031 Francesco Prosciuttificio B 5407 spugnetta San Francesco Prosciuttificio 2014/60573_2 S.P.A B S spugnetta - AUSL ParmaSan LMAS_PR.0031 Francesco Prosciuttificio 5400 prosciutto crudo San Francesco Prosciuttificio 2014/60519 S.P.A P prosciutto crudo - AUSL ParmaSan LMAS_PR.0008 Francesco Prosciuttificio 5401 spugnetta San Francesco Prosciuttificio 2014/60580_2 S.P.A S spugnetta - AUSL ParmaSan LMAS_PR.0008 Francesco Prosciuttificio A 5408 spugnetta San Francesco Prosciuttificio 2014/60580_2 S.P.A A S spugnetta - AUSL ParmaSan LMAS_PR.0008 Francesco Prosciuttificio B 5409 spugnetta San Francesco Prosciuttificio 2014/60580_2 S.P.A B S spugnetta - AUSL ParmaSan LMAS_PR.0008 Francesco Prosciuttificio 5403 prosciutto crudo San Francesco Prosciuttificio 2014/60519 S.P.A A P prosciutto crudo - AUSL ParmaSan LMAS_PR.0083 Francesco Prosciuttificio C 5410 spugnetta San Francesco Prosciuttificio 2014/60580_2 S.P.A C S spugnetta - AUSL ParmaSan LMAS_PR.0083 Francesco Prosciuttificio

31 Obblighi per la genotipizzazione Esportazione prodotti a base di carne verso USA piano di sorveglianza ufficiale per L. monocytogenes e Salmonella spp I ceppi di L. monocytogenes isolati da prodotti e superfici dovranno essere inviati agli IZS competenti per la genotipizzazione È responsabilità dello stabilimento assicurarsi che il laboratorio che ha eseguito l autocontrollo effettui la spedizione negli stabilimenti che non dovessero inviare i ceppi, l attività di esportazione verso gli USA verrà sospesa fino al ripristino delle condizioni di affidabilità dell autocontrollo e comunque non meno di 90 giorni

32 conclusioni Il problema sanitario posto da Listeria monocytogenes è ostico Listeria monocytogenes, si introduce frequentemente è molto facile disseminarla facilmente diviene persistente occorre gestire correttamente i flussi, gli ambienti e le disinfezioni essenziale non ricontaminare a fine stagionatura lo studio degli episodi di contaminazione è possibile e utile per capire e prevenire prima che dagli USA ci segnalino il problema