Diagnostica batterica

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1 Diagnostica batterica Dott.ssa Mariateresa Vitiello Dipartimento di Medicina Sperimentale Seconda Università degli Studi di Napoli Identificazione dei batteri 1. esame microscopico diretto del materiale in esame 2. Caratteristiche morfologiche Colorazione di Gram Colorazione di Ziehl-Neelsen 3. Caratteristiche colturali 4. Caratteristiche biochimiche 5. Tipizzazione fagica 6. Caratteristiche antigeniche (ID sierologica) 7. Antibiogramma 1

2 Identificazione dei batteri esame microscopico diretto del materiale in esame TIPO DI MICROSCOPIO MASSIMO INGRANDIME NTO UTILIZZAZIONE VANTAGGI SVANTAGGI OTTICO IN CAMPO ILLUMINATO 1000X OSSERVAZIONE PREPARATI COLORATI. CONTA MICROBICA DI FACILE USO E POCO COSTOSO; PERMETTE DI DISTINGUERE I MICRORGANISMI DOPO COLORAZIONE DIFFERENZIALE MANCANZA DI CONTRASTO; INCAPACITA' A VISUALIZZARE VIRUS E ALCUNI BATTERI MOLTO PICCOLI; LA MAGGIOR PARTE DELLE STRUTTURE DEVE ESSERE COLORATA PER ESSERE OSSERVABILE; A SEGUITO DELLE COLORAZIONI SI FORMANO ARTEFATTI OTTICO IN CAMPO OSCURO 1000X OSSERVAZIONE DI MICRORGANISMI VIVI, NON COLORATI E CON STRUTTURE MORFOLOGICHE DIFFICILMENTE VISIBILI IN CAMPO ILLUMINATO PERMETTE DI OSSERVARE MICRORGANISMI VIVENTI, NON E' RICHIESTA COLORAZIONE PER CUI NON COMPAIONO ARTEFATTI NON E' POSSIBILE VALUTARE PREPARATI COLORATI. I PARTICOLARI SUBCELLULARI NON SONO FACILMENTE INDIVIDUABILI OTTICO CONTRASTO DI FASE 1000 X OSSERVAZIONE DI MICRORGANISMI VIVI, NON COLORATI E DI STRUTTURE INTRACELLULARI PERMETTE L'OSSERVAZIONE DI STRUTTURE INTRACELLULARI, EVIDENZIANDONE I DETTAGLI NON E' POSSIBILE VALUTARE PREPARATI COLORATI OTTICO FLUORESCENZ A 1000 X USATO IN MOLTE PROCEDURE DIAGNOSTICHE, IMPIEGANDO REAGENTI FLUORESCENTI, PER IDENTIFICARE I MICRORGANISMI E PER SVELARE REAZIONI IMMUNOLOGICHE PERMETTE UNA RAPIDA IDENTIFICAZIONE DEGLI AGENTI INFETTIVI CONSENTE SOLO L'OSSERVAZIONE DI PREPARATI NATURALMENTE FLUORESCENTI O MARCATI CON SOSTANZE FLUORESCENTI ELETTRONICO TRASMISSIO NE (TEM) X OSSERVAZIONE DELL'ULTRASTRUTTURA DEI MICRORGANISMI, VIRUS. DIAGNOSI DI MALATTIE VIRALI. OSSERVAZIONE DI MACROMOLECOLE PERMETTE L'OSSERVAZIONE DI MICRORGANISMI E STRUTTURE INVISIBILI AL MICROSCOPIO OTTICO MOLTO COSTOSO. CONSENTE L'OSSERVAZIONE SOLO DI MICRORGANISMI UCCISI, FISSATI, DISIDRATATI E COLORATI: TALI PROCEDURE FAVORISCONO GLI ARTEFATTI. I PREPARATI NON DEVONO SUPERARE I nm DI SPESSORE ELETTRONICO SCANSIONE (SEM) X OSSERVAZIONI DETTAGLIATE DELLE STRUTTURE SUPERFICIALI DEI MICRORGANISMI: PRODUCE IMMAGINI TRIDIMENSIONALI VISIONE TRIDIMENSIONALE MOLTO REALISTICA. PERMETTE DI AGEVOLMENTE DI VARIARE L'INGRANDIMENTO DEL CAMPIONE DA 1 A X MOLTO COSTOSO. CONSENTE DI OSSERVARE SOLO STRUTTURE DI SUPERFICIE. L'INGRANDIMENTO MASSIMO E' INFERIORE A QUELLO DEL MICROSCOPIO ELETTRONICO A TRASMISSIONE 2

3 IL MICROSCOPIO Antonie van Leeuwenhoek ( ) Microscopio Ottico Composto in Campo Chiaro IL MICROSCOPIO LIMITE DI RISOLUZIONE: imposto dalle proprietà fisiche della luce (0,2 µm) PER OSSERVARE I BATTERI SENZA COLORARLI: - IN CAMPO CHIARO - OBIETTIVO 100X -OCULARE 10X - IN IMMERSIONE - CONTRASTO DI FASE Obiettivo a contrasto di fase e ad immersione 3

4 MICROSCOPIO A FLUORESCENZA Vengono utilizzate sostanze dette FLUORESCENTI: Sostanze che se irradiate con luce di una determinata lunghezza d onda, la riemettono con lunghezza d onda maggiore I fluorocromi più usati sono: la FLUORESCEINA che ha un massimo di assorbimento a nm ed emette una luce giallo-verde e la RODAMINA che ha un massimo di assorbimento a 550 nm ed emette luce rossa-arancio Pneumocystis carinii al microscopio a fluorescenza. Anticorpi specifici per questo patogeno, coniugati con fluoresceina, hanno ricoperto la superficie della cisti, che appare colorata in giallo-verde. 4

5 MICROSCOPIO ELETTRONICO MICROSCOPIA ELETTRONICA: basata sul principio che un campo elettromagnetico agisce su un fascio di elettroni in modo analogo ad una lente su un fascio di fotoni Microscopio elettronico a trasmissione (TEM). Questo microscopio viene utilizzato per osservare sezioni di cellule molto sottili per rilevare le strutture interne. Il TEM viene anche utilizzato per studiare i virus. 5

6 Microscopio elettronico a scansione (SEM). Questo microscopio serve per fornire immagini tridimensionali delle cellule. Salmonella typhimurium osservata al microscopio elettronico a scansione. 6

7 esame microscopico TECNICA PER L'ESAME A FRESCO DA COLTURA L'esame microscopico può essere praticato a fresco ( osservazione diretta dei microrganismi solitamente in condizioni di vitalità) o su preparati colorati (osservazione dei microrganismi dopo che sono stati essiccati, fissati e colorati). L'esame a fresco permette di studiare la forma, la disposizione, le dimensioni, la rifrangenza, la mobilità e la riproduzione dei microbi. Viene compiuto sempre in mezzo liquido per cui nel caso si abbia materiale solido o semisolido, esso va stemperato in un liquido. I preparati a fresco sono allestiti in vario modo: 7

8 esame microscopico Preparati su vetrini porta-oggetto con copri-oggetto: 1) sterilizzare arroventando sulla fiamma l'ago o l'ansa fino al raggiungimento del colore rosso, si usa l'ansa per prelievi di maggiore quantità, l'ago per prelievi di piccole quantità; 2) raffreddare l'ansa o l'ago; 3) prelevare il materiale in esame con l'ansa o l'ago se da una coltura o con un tampone sterile se da materiale patologico; 4) allestire la sospensione microbica: per l'esame è necessario un mezzo liquido, ed è preferibile utilizzare un numero limitato di microrganismi; a tal scopo si può sospendere una ansata in 5ml di soluzione fisiologica sterile ma ci si regolerà di volta in volta a seconda se il materiale iniziale è in terreno solido o liquido, se è abbondante o meno, o se il tampone è ricco di materiale oppure no; esame microscopico 5) dispensare sul vetrino portaoggetti 2-3 gocce della sospensione microbica; 6) con un lato del vetrino coprioggetto lambire lateralmente il liquido posto sul portaoggetti e depositare il coprioggetto cercando di non formare bolle. Per osservazioni lunghe sigillare i margini del coprioggetto con un mastice (paraffina); 7) porre il vetrino preparato sul tavolino traslatore del microscopio; 8) osservare al microscopio composto o a contrasto di fase con obiettivo a secco oppure ad immersione. 8

9 Identificazione dei microrganismi esame microscopico diretto del materiale in esame Caratteristiche morfologiche Colorazione di Gram Colorazione di Ziehl-Neelsen Le colorazioni in Microbiologia. Perché colorare? La cellula batterica è trasparente contrasto insufficiente tra cellula batterica ed ambiente circostante. I coloranti debbono consentire: forte contrasto tra i microrganismi ed il fondo differenziazione di vari tipi morfologici (forma, organizzazione, colorazione Gram) evidenziazione di alcune strutture (flagelli, capsule, endospore) 9

10 Le colorazioni in Microbiologia I coloranti I coloranti constano di ioni (positivi o negativi). Al riguardo, essi possono essere suddivisi in: Coloranti basici (blu di metilene, fucsina basica, violetto di genziana, cristalvioletto, tionina): Carica positiva Affinità per le strutture acide (superficie cellulare, proteine, acidi nucleici) colorazione diretta Coloranti acidi (eosina, negrosina, rosso Congo): Carica negativa Affinità per le strutture basiche, si depositano attorno al microrganismo colorazione indiretta o negativa Le colorazioni in Microbiologia Tecniche di colorazione Colorazioni SEMPLICI: un colorante basico (blu di metilene, fucsina fenicata) viene applicato al campione fissato per un tempo variabile. L eccesso di colorante viene eliminato tramite risciacquo con acqua Consente di rilevare la morfologia e l organizzazione cellulare Colorazioni DIFFERENZIALI: due o più coloranti ed altri reagenti (mordenzanti, differenziatori) consente di distinguere due differenti tipologie di microrganismi o 2 differenti strutture di un microrganismo 10

11 Le colorazioni in Microbiologia Preparativa Preparazione di soluzioni coloranti Soluzione alcoolica (colorante come sale): 10 g sostanza colorante ml alcool assoluto Soluzione idroalcoolica 10% (colorante subisce dissociazione elettrolitica): 10 ml soluzione alcoolica madre colorante + 90 ml H 2 O distillata Reagenti per colorazioni Mordenzanti, sostanze che fissano il colorante od amplificano l ingombro del campione: fenolo, soluzione iodo-iodurata Differenziatori, sostanze decoloranti: alcoolacetone, acido solforico al 20% Le colorazioni in Microbiologia Tipologie di colorazione Colorazioni PROGRESSIVE: si esegue con soluzioni molto diluite di colorante, interrompendo tempestivamente la colorazione Colorazioni REGRESSIVE: si esegue una ipercolorazione e si usa poi un differenziatore la cui azione decolorante va interrotta tempestivamente 11

12 Tecniche di colorazione Colorazioni DIFFERENZIALI Colorazione di Gram Colorazione per bacilli acido-resistenti: Metodo di Ziehl-Neelsen Metodo a freddo di Kinyoun Metodo della fluorescenza con auramina Colorazione della capsula (inchiostro di china) Colorazione di flagelli (Leifson) Colorazione di spore Hans Christian Joachim Gram Batteriologo danese ed inventore della colorazione di Gram (nel tentativo di differenziare Klebsiella pneumoniae dagli pneumococchi) 12

13 Colorazione di Gram Tecnica Colorazione di Gram Osservazione microscopica I batteri Gram+ appaiono blu (Staphylococcus epidermidis) I batteri Gram- appaiono rossi (Escherichia coli) 13

14 The Cell Envelope Gram Positive Gram Negative Parete batterica: Confronto delle superfici DUNQUE PERCHÉ I BATTERI G PERDONO LA COLORAZIONE CON CRISTALVIOLETTO? 14

15 LA PARETE BATTERICA DEI GRAM + Gli acidi teicoici sono legati covalentemente al gruppo 6-ossidrile dell acido muramico LEGAME FOSFODIESTERE LA PARETE BATTERICA DEI GRAM - Antigene flagellare Escherichia coli O157 O157:H7 Antigene somatico 15

16 Colorazione di Gram Principio Nei batteri Gram+ il cristalvioletto e lo iodio si combinano a formare un complesso (CV-I) di grosse dimensioni che precipita all interno della cellula. Il decolorante condensa per disidratazione la struttura petidoglicanica. In questo modo, il complesso CV-I viene catturato dalla parete cellulare Nei batteri Gram- il decolorante, agendo come solvente lipidico, dissolve la membrana esterna della parete cellulare così permettendo il rilascio del complesso CV-I e, quindi, la decolorazione della cellula batterica. Colorazione di Gram: l eccezione La colorazione di Gram non è applicabile a tutti i batteri. Esempi consistono nel Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium leprae Incapacità di colorare per la natura cerosa dell involucro esterno, altamente impermeabile ai coloranti Colorazione di Ziehl-Nielsen 16

17 Mycobacterium spp. Parete cellulare Composizione: Grosse quantità di glicolipidi: acido micolico (60%) complessi lipidiarabinogalattani lipoarabinomannani Scarso petidoglicano Mycobacterium spp. Parete cellulare Funzioni: Forma e prevenzione lisi osmotica (peptidoglicano) Inibizione ingresso composti chimici Crescita lenta Maggiore resistenza agli agenti chimici Maggiore resistenza alla fagocitosi Induzione sintesi citochine (TNF-α) da parte dell acido micolico 17

18 Le colorazioni in microbiologia Colorazione di Ziehl-Neelsen Presenza caratteristica di ceramidi e fosfolipidi alla superficie cellulare di Mycobacterium spp. e Nocardia spp. I coloranti ordinari non possono superare lo strato cerato. Colorazioni con la tecnica per l acido-resistenza: Kinyoun Ziehl-Neelsen Colorazione di Ziehl-Neelsen Tecnica (1 di 2) Step 1: Versare la fucsina basica Step 2: Fare evaporare scaldando il colorante alla fiamma per 5 min Lavare con acqua 18

19 Colorazione di Ziehl-Neelsen Tecnica (2 di 2) Step 3: Decolorare con alcool-acido fino alla scomparsa del colorante (circa 2 min) Lavare con acqua Step 4: Contrastare con blu di metilene per 1-2 min Lavare con acqua Colorazione di Ziehl-Neelsen Osservazione microscopica Gli organismi acido-resistenti (AFB) appaiono colorati in rosso Gli organismi non acido-resistenti risulteranno colorati in blu 19

20 Ziehl-Neelsen 1000x Le colorazioni in Microbiologia Colorazioni speciali La colorazione negativa viene usata quando un organismo od una sua struttura non viene colorata facilmente come, ad esempio, in presenza di capsula. La colorazione delle spore richiede calore per facilitare la penetrazione del colorante La colorazione dei flagelli richiede un mordenzante per ispessire la struttura flagellare 20

21 Le colorazioni in Microbiologia Colorazione di flagelli Colorazione di Leifson. Cellule politriche di Helicobacter pylori Le colorazioni in Microbiologia Colorazione di spore Le spore batteriche per la presenza di uno spesso involucro costituito da più strati vengono difficilmente colorate, viceversa una volta che hanno assunto una colorazione si decolorano con estrema difficoltà.le tecniche di colorazione prevedono una energica fissazione, trattamenti preliminari del preparato che modificano l impermeabilità delle spore (cloroformio e acido cromico), facilitano l attraversamento del colorante, l utilizzo di mordenzanti fisici (calore) o chimici (acido fenico, FeCl 2, borato), utilizzo di decoloranti (acidi, sostanze riducenti,, alcool assoluto) che evidenziano la resistenza della spora alla decolorazione. 21

22 Le colorazioni in Microbiologia Colorazione di spore 1) distensione,essiccazione ed energica fissazione del preparato batterico; 2) distendere sul preparato blu borace (blu di metilene 2% + 5gr borato di sodio in acqua distillata); con la fiamma del becco bunsen riscaldare per 2-3 min. direttamente il vetrino nella parte sottostante fino a che non si ottiene la comparsa di vapori; 3) decolorare con acido nitrico (10%) per 20 sec.; 4) allontanare l'eccesso di decolorante; 5) lavare e trattare per 1 min. con una soluzione acquosa di cosina 1%; 6) lavare ed asciugare con carta bibula; 7) osservare con obiettivo ad immersione 22

23 Identificazione dei microrganismi 1. esame microscopico diretto del materiale in esame 2. Caratteristiche morfologiche Colorazione di Gram Colorazione di Ziehl-Neelsen 3. Caratteristiche colturali 23

24 Coltivazione dei batteri COLTIVAZIONE DEI BATTERI: processo mediante il quale si cerca di ottenere la riproduzione dei microrganismi in un ambiente artificiale fornendo loro le sostanze nutritizie necessarie e adatte condizioni ambientali: -Temperatura -Acidità (ph) -Pressione osmotica -Luce ecc. La coltivazione dei batteri ci permette di: -studiarne le caratteristiche biologiche -isolarli ed identificarli da un campione biologico a scopo diagnostico Terreni di coltura Terreno di coltura: mezzo nel quale o sul quale può avvenire lo sviluppo e la crescita in vitro di un microrganismo Classificazione dei terreni di coltura 24

25 Terreni selettivi: sono terreni di crescita adatti alla moltiplicazione di uno specifico microrganismo o di un numero ristretto di microrganismi e che sfavoriscono la crescita di altri microrganismi. 25

26 Terreni selettivi: esempi Cetrimide Agar: Terreno selettivo per l isolamento e l identificazione presuntiva di Pseudomonas aeruginosa. Magnesio cloruro e potassio solfato per stimolare la produzione di pigmento. Cetrimide inibisce la crescita di gran parte dei microrganismi. MacConkey agar: evidenziazione, isolamento e conta dei coliformi e degli Enterobatteri (E. coli, Klebsiella, Salmonella, Shigella). La presenza di cristalvioletto e dei sali biliari inibisce la crescita di Gram+. Terreni differenziali: rendono possibile alle colonie di un dato microrganismo di svilupparsi assumendo un aspetto tale da essere riconosciuto a prima vista Esempi Mannitol Salt Agar: Terreno selettivo e differenziale per l isolamento di stafilococchi presunti patogeni. Azione selettiva dell elevata [NaCl]. Indicatore: rosso fenolo. S. aureus produce colonie con alone giallo-brillante; gli stafilococchi coagulasi-negativi formano colonie di colore rosso porpora. Salmonella-Shigella Agar (Agar SS): Terreno selettivo (Sali biliari) e differenziale per l isolamento di Salmonella e Shigella dalle feci. Zucchero: lattosio. Indicatore: rosso neutro. Tiosolfato di sodio e citrato ferrico. 26

27 TERRENI DI ARRICCHIMENTO: sono terreni selettivi liquidi. La presenza di particolari sostanze o di particolari condizioni fisiche favorisce la crescita in numero delle specie da arricchire, mentre allunga la fase di latenza delle specie competitrici. Preparazione dei terreni di coltura 27

28 La semina dei terreni di coltura Inoculo in terreno liquido Semina di terreno solido Trasferimento in sterilità di cellule nel terreno liquido con ansa o pipetta Striscio Spatolamento Inclusione Lavorare in Sterilità Pipette Spatola Ansa Becco Bunsen Si lavora con fiamma ossidante (azzurra, più calda, più stabile), NON riducente (gialla) 28

29 Tecniche di semina per isolamento Semina per isolamento 29

30 Tecniche di semina per isolamento Incubazione dei microrganismi I brodi o i terreni agarizzati seminati devono essere posti ad una TEMPERATURA, per un TEMPO e nelle CONDIZIONI ottimali per permettere la crescita del microrganismo con sui si sta lavorando Bacillus stearothermophilus G+, anaerobio facoltativo, termofilo Incubazione a 60 C per 8-12 h Bifidobacterium bifidum G+, anaerobio stretto, mesofilo Incubazione a 37 C per h Giara per anaerobiosi 30

31 Anaerobiosi Cappa (camera) anaerobica Figure 6.6 Anaerobiosi Giara per anaerbiosi Figure

32 Carbossifilia Candle jar CO 2 -packet Figure 6.7 Concetto di Sterilità Sterilizzazione: Impiego di procedure chimiche e/o fisiche per la completa eliminazione o distruzione di qualsiasi forma di vita microbica, incluse le spore (forme di resistenza). Disinfezione: Processo che riduce o elimina completamente tutti i microrganismi patogeni unicellulari (solo allo stato vegetativo) presenti nell ambiente. 32

33 Aree in cui il controllo dei microrganismi è necessario (a differenti livelli) MICROBIOTA Ambiente Industria NORMAL HUMAN MICROBIOTA Agricoltura Animali Microbiota capace di causare malattie nell uomo Perché è necessario il controllo dei microrganismi: alcuni esempi Sanitizzazione delle aree Ambiente Industria MICROBIOTA NORMAL HUMAN MICROBIOTA Prevenzione di infezioni iatrogene, infezioni chirurgiche, infezioni crociate, diffusione di microrganismi e geni associati ad antibiotico-r, etc Cibo, farmaceutici, carburante, cosmetici, etc Agricoltura Malattie di alberi, raccolto, piante, etc Animali Animali, pollame, (conservazione, produzione), etc 33

34 Quali sono i mezzi a nostra disposizione? Disinfezione metodi chimici Sterilizzazione metodi fisici metodi chimici metodi chimico-fisici Tecniche di sterilizzazione From: PR Murray et al Medical Microbiology 3rd edition, Mosby,

35 Sterilizzazione Tecniche FISICHE Calore Umido Secco Filtrazione Radiazioni UV Radiazioni ionizzanti Ultrasuoni Sterilizzazione fisica CALORE SECCO - Esposizione diretta alla fiamma (flambaggio) - Incenerimento -Stufa a secco UMIDO - Vapore fluente* - Vapore sotto pressione - Tindalizzazione - Pasteurizzazione *L impiego di acqua in ebollizione e di vapore fluente sono da proscrivere: a t <110 C non si ha una sterilizzazione efficace 35

36 TRAMITE CALORE UMIDO TEMPERATURA TEMPO 100 C oltre 1200 min. 108 C 420 min. 110 C 120 min. 113 C 30 min. 125 C 1 min. 135 C 30 sec. Si definisce sterilizzazione a calore umido il procedimento che utilizza vapore acqueo saturo a T non minore di 110 C TRAMITE CALORE UMIDO TEMPERATURA TEMPI PRESSIONE 115 C 20 min. 0,7 atm 121 C 15 min. 1,0 atm 134 C 3 min. 2,0 atm VANTAGGI Rapidità di penetrazione del calore nei materiali Distruzione dei microrganismi in breve tempo Facile controllo della sterilità Atossicità Economia di esercizio SVANTAGGI Degradazione del materiale termolabile Corrosione dei metalli Impossibilità di sterilizzare grassi e polveri anidre 36

37 Sterilizzazione fisica Calore umido (autoclave) Tecnica più comunemente impiegata Materiali termostabili,, terreni di coltura, rifiuti infettivi Non adatta per: chimici tox e/o volatili, radioisotopi Camera a pressione che utilizza vapore saturo per ottenere elevate temperature. L aria viene rimossa dalla camera per gravità o tramite prevuoto Ciclo classico :: 121 C, 15 min,, 1 atm Diversi cicli in base alla tipologia di materiale Calore umido - Autoclave 37

38 Autoclave From: AD Russell et al. Principles & Practice of Disinfection, Preservation & Sterilization, Blackwell, 1999 Killing takes time 1 log reduction Note: Uccisione richiede tempo Sterilità non è assoluta I protocolli si basano su overkill calcolate 38

39 TINDALIZZAZIONE Tindalizzazione o sterilizzazione frazionata (calore umido) viene utilizzata per sterilizzare terreni contenenti sostanze termolabili C per 30 - raffreddare a temperatura ambiente - ripetere il trattamento dopo 24 h a C per 30 - raffreddare a temperatura ambiente - ripetere il trattamento dopo 24 h a C per 30 PASTORIZZAZIONE Tecnica utilizzata per la bonifica e la conservazione di alimenti C per 30 (pastorizzazione bassa) - 72 C per 15 (pastorizzazione alta) - 90 C per 1 (pastorizzazione ultra alta UHT) 39

40 TRAMITE CALORE SECCO Materiale sterilizzabile -Vetreria -Strumentazione metallica -Polveri farmaceutiche -Preparazioni non acquose di sostanze termostabili (olii) -Materiale termoresistente Materiale non sterilizzabile -Tessuti -Soluzioni acquose -Farmaci organici -Oggetti smaltati -Materiale termosensibile VANTAGGI Apparecchiatura ubiquitaria Sterilizzazione strumenti all interno dei contenitori, se metallici Non corrode i metalli SVANTAGGI Deterioramento materiale termosensibile Durata eccessiva del processo Caldo secco Forno Pasteur 40

41 Sterilizzazione fisica Calore secco (forno Pasteur) Utilizzato per materiali danneggiati dal vapore o perché impermeabili al vapore Olii,, polveri, oggetti taglienti, vetreria, rifiuti infettivi (alternativa al calore umido) Meno efficace del calore umido e richiede tempi e temperature maggiori Distruzione ossidativa Sterilizzazione fisica Calore secco TEMPERATURA TEMPO 180 C 30 min. 170 C 60 min. 160 C 120 min. 150 C 150 min. 140 C 180 min. 120 C 360 min. Il tempo di sterilizzazione deve essere conteggiato a partire dal momento in cui il materiale ha raggiunto la temperatura prefissata 41

42 Sterilizzazione Tecniche FISICHE Calore Umido Secco Filtrazione Radiazioni UV Radiazioni ionizzanti Ultrasuoni Sterilizzazione fisica Filtrazione Rimozione di microrganismi e particelle microscopiche dalle soluzioni, aria ed altri gas Filtri a membrana (nitrato di cellulosa, acetato di cellulosa) Filtri 1.2 µm: prefiltro per chiarificare la soluzione Filtri 0.45 µm: rimozione batteri, lieviti e funghi da liquidi biologici e farmaceutici Filtri 0.22 µm: rimozione pseudomonadi ed altri casi particolari 42

43 Filtrazione Sistemi filtranti Microfotografia filtro Filtrazione Enterococchi su membrana 43

44 Sterilizzazione Tecniche FISICHE Calore Umido Secco Filtrazione Radiazioni UV Radiazioni ionizzanti Ultrasuoni Sterilizzazione fisica Radiazione ultravioletta (U.V( U.V.).) Agiscono efficacemente sugli acidi nucleici cellulari per diretta esposizione a 254 nm Applicazioni: decontaminazione aria, acqua, superfici sterilizzazione fredda di composti chimici e plastiche per uso farmaceutico, siero per TC 44

45 Sterilizzazione fisica Radiazione ultravioletta (U.V( U.V.).) Fattori critici: Capacità di penetrazione (generalmente scarsa) Distanza della sorgente UV dal materiale esposto a trattamento Intensità della luce (sostituzione dopo h) Umidità relativa Specie microbica Radiazione U.V. 45

46 Sterilizzazione Tecniche FISICHE Calore Umido Secco Filtrazione Radiazioni UV Radiazioni ionizzanti Ultrasuoni Sterilizzazione fisica Radiazioni ionizzanti Radiazioni dello spettro elettromagnetico (microonde, raggi γ,, raggi X, elettroni) Sterilizzazione fredda (a basse temperature) Effetto letale risultante da un azione diretta (trasferimento di energia alle molecole bersaglio) ed indiretta (diffusione di radicali) sulla molecola bersaglio (DNA) 46

47 MICROONDE Onde elettromagnetiche a bassa frequenza (3x108-3x1010 Hz) - Meccanismo d azione: Aumento della temperatura per attrito interno P. aeruginosa, E. coli, S. aureus distrutti dopo 90 secondi B. subtilis, B. stearothermophilus distrutti dopo 150 secondi VANTAGGI Velocità Mancanza di vapori o gas tossici Economia di esercizio Elevata sterilizzazione Non scalda i materiali plastici Bassa T a fine ciclo Maneggevolezza SVANTAGGI Difficoltà controllo T Impossibile sterilizzare metalli Sterilizzazione fisica Radiazioni ionizzanti Applicazioni: microonde: Sterilizzazione flashing di terreni di coltura raggi γ: prodotti da cobalto-60 alto potere di penetrazione non applicabile (costi elevati) in laboratorio dispositivi medici, (siringhe ipodermiche, suture, terreni di coltura, contenitori) fascio elettronico: Trattamento di rifiuti infettivi Non applicabile in laboratorio (scarso potere di penetrazione) 47

48 Sterilizzazione Tecniche FISICHE Calore Umido Secco Filtrazione Radiazioni UV Radiazioni ionizzanti Ultrasuoni Sterilizzazione fisica Ultrasuoni Energia ultrasonica a bassa frequenza inattiva per cavitazione i microrganismi in sospensioni acquose Sonicatori usati per pulizia di strumenti ma non vengono considerati sterilizzatori, tuttavia: Combinazione ultrasuoni + trattamento chimico può avere effetto letale 48

49 Sterilizzazione Tecniche CHIMICHE Acido peracetico Glutaraldeide Sterilizzazione chimica Acido peracetico, glutaraldeide Acido peracetico immersione (0.2% per 20 - acqua sterile - aria sterile) industrie alimentari, strumenti chirurgici (micronizzato) efficace in presenza di materiale organico e produce prodotti finali non tox (ac. acetico + O 2 ) Glutaraldeide 2% per materiale medico e chirurgico, in alternativa a trattamento termico o irraggiamento preparazione di vaccini 49

50 Sterilizzazione Tecniche CHIMICO-FISICHE Ossido di etilene (ETO) Formaldeide (vapori) Sterilizzazione chimico-fisica Ossido di etilene (ETO) Tecnica più usata nelle strutture sanitarie per sterilizzare materiale termosensibile Alchilazione di gruppi funzionali (amminici, carbossilici, fenolici, idrossilici) 12% ETO + 88% Freon (oppure CO 2, N 2 ) Fattori critici: Concentrazione ETO Temperatura Umidità relativa Tempo di esposizione Natura del materiale ETO è carcinogeno,, mutageno. Impiego regolamentato. 50

51 Sterilizzazione Tecniche CHIMICO-FISICHE Ossido di etilene (ETO) Formaldeide (vapori) Sterilizzazione chimico-fisica Formaldeide (vapori) Reagisce con proteine cellulari, DNA, RNA Vaporizzazione 2-5% 2 formaldeide in presenza di vapor acqueo a C Formaldeide è carcinogena,, residui trovati in materiale polimerico (cellulosa, gomma) 51

52 Scelta della tecnica di sterilizzazione Attività: battericida, tubercolicida,, fungicida, sporicida, virucida Rapidità di azione: sterilizzazione raggiunta in breve tempo Penetrazione: forte penetrazione all interno del confezionamento e della strumentazione Compatibilità: non causa rilevanti cambiamenti strutturali o funzionali del materiale in seguito a ripetuti cicli di sterilizzazione Atossicità: non produce rischi per l operatore l e per l ambiente Resistenza a materiale organico: efficacia invariata in presenza di materiale organico Costo-efficacia efficacia: costi ragionevoli per attrezzatura, installazione e operazioni in altre parole: non esiste una tecnica di sterilizzazione IDEALE! 52

53 DISINFEZIONE ANTISETTICO sostanza che, applicata sui tessuti umani, espleta azione batteriostatica o battericida sulle forme vegetative di molti patogeni (e alcuni virus) DISINFETTANTE composto chimico antimicrobico ad azione aspecifica e non selettiva in grado di agire su superfici ed oggetti inanimati con effetto decontaminante sulle forme vegetative (e alcuni virus) fino a livello di sicurezza Tecniche di disinfezione From: PR Murray et al Medical Microbiology 3rd edition, Mosby,

54 DISINFEZIONE Aldeidi Formaldeide, glutaraldeide Alchilazione dei gruppi polari (aminici, idrossilici, fenolici) delle proteine Formaldeide 37%, formalina (sterilizzazione) 3-8%, disinfenzione (tox, carcinogenico) Glutaraldeide 2%, battericida, fungicida, virucida No disinfezione superfici (vapori irritativi) Disinfezione per immersione di strumentazione ospedaliera: 2% glutaraldeide per 2-10 min (3-10 h per sporicidia) DISINFEZIONE Agenti ossidanti Perossido d idrogeno d (H 2 O 2 ), acido peracetico Battericidi, fungicidi, virucidi Formazione di radicali ossidrilici in grado di ossidare sistemi enzimatici critici per il microrganismo Utilizzo principalmente industriale, per la disinfezione di apparecchiature e materiali 54

55 DISINFEZIONE Alcooli Etanolo, isopropanolo (60-85%) Danneggiano membrana citoplasmatica: denaturazione (coagulazione) proteine solubilizzazione lipidi Battericidi, fungicidi, tubercolicidi Etanolo esibisce ampio spettro virucida (HIV, adenovirus, herpesvirus, virus influenzale, coxsachie B1 virus, poliovirus 1) Disinfezione superfici in zone ben ventilate e lontano da fiamme DISINFEZIONE Fenoli e derivati fenolici Fenolo: tossico, corrosivo, carcinogenico Derivati fenolici con gruppo funzionale (cloro, bromo, alchil, benzil, phenyl, amil) a sostituzione di un H del ring aromatico Distruzione membrana e parete cellulare, inattivazione enzimatica, denaturazione proteica Battericidi, fungicidi, tubercolicidi, virucidi 2-5% (0.5%, HIV; 2%, funghi) O-phenylphenol (Lysol), Irgasan Esaclorofene (Phisohex): HLD per cocchi Gram+ Strumenti chirurgici 55

56 DISINFEZIONE Alogeni Bromuri, fluoruri, cloruri, ioduri Battericidi, fungicidi, virucidi, sono combinati per ridurre tox, instabilità e corrosività Eliminazione di gruppi S-H: Ossidazione: form. di ponti di-sulfidrilici inattivi Combinazione: ione metallico sottrae SH liberi Cloruri Cl + p-toluene-sulfonamide (chloramine T) 1:10 sodio-ipoclorito (NaOCl) 5.25% per rischi ematogeni (soluzione recente, cute pulita) Ioduri PVP-J (Betadine) per uso cutaneo e chirurgico DISINFEZIONE Composti ammonio quaternario Detergenti cationici, derivati da modificazioni di NH 4 + Distruzione membrana cellulare, inattivazione enzimatica, denaturazione (coagulazione) proteica Batteriostatico (-cida ad elevate concentrazioni), fungistatico, virustatico Frequenti infezioni da Gram- QUATs-associate (Pseudomonas spp. è QUATs-resistente) Non corrosivi, non tossici, economici Neutralizzati da materiale organico, saponi e detergenti anionici 56

57 DISINFEZIONE Surfattanti Saponi e detergenti Rimozione meccanica dei microrganismi (flora transitoria: Gram-,, 80%) per sfregamento I I saponi degradano la pellicola idrolipidica sopracutanea (emulsificazione) Disinfezione - Sensibilità relativa - Limitazioni 57

58 Applicazione delle tecniche di disinfezione Un approccio conveniente è quello suggerito da Spaulding, applicato nelle linee-guida U.S. Gli oggetti che necessitano di essere disinfettati o sterilizzati sono classificati come: critici semi-critici non critici I livelli richiesti di disinfezione sono: alto livello intermedio basso livello Livelli di disinfezione Alto livello Per strumentazioni critiche che sono a contatto con tessuti corporei e non possono essere sterilizzati (laparoscopi, artroscopi,, etc) Intermedio Per strumentazione semi-critica che può venire a contatto con mucose o cute, ma non penetrano nei tessuti (termometri,, etc) Basso livello Per oggetti non critici, disinfezione ambientale, etc 58

59 Spaulding s scheme Alto livello di disinfezione Intermedio livello di disinfezione Basso livello di disinfezione Resistenza dei microrganismi alla disinfezione 59

60 DISINFEZIONE Fattori critici Ambiente: temperatura (20-37 C) ph del mezzo in cui deve agire il disinfettante Materiale: natura del materiale (porosità presenza di materiale organico (sangue, pus) Inattivazione principio attivo Rivestimento superficie batterica Adsorbimento (eliminazione) del principio attivo Disinfettante: concentrazione del principio attivo tempo di applicazione (contatto con materiale) qualità acqua per diluizione disinfettante Microrganismo: tipologia carica microbica DISINFEZIONE Valutazione del potere disinfettante Il fenolo è il disinfettante più attivo Coefficiente fenolico Rapporto tra la concentrazione minima di fenolo, capace di uccidere un germe test (Salmonella typhimurium) in 10 minuti ma non in 5, e quella del composto in esame 60

61 Scelta di un disinfettante Attività: esteso spettro di azione (battericida, fungicida, tubercolicida, virucida) Rapidità di azione: breve tempo minimo di applicazione : : minuti Atossicità: non irritante per occhi, mucose, cute No colorazioni Non corrosivo Stabilità: per diluizioni e tempi consigliati (anche in presenza di materiale organico) Buona capacità di penetrazione e detersione Costi: ragionevoli (economicit( economicità) LA DISINFEZIONE Principio attivo e (suo impiego) Gram + Gram- Virus Funghi Lieviti B. kock Spore Pseudomonas Alcool (pelle, mani, ferite) Clorexidina (pelle, mani, ferite) Iodio (pelle, mani, ferite) Ossigeno attivo (ferite, strumenti) Ammonio quaternario (pelle, ferite, oggetti) Cloro (oggetti, superfici, biancheria Aldeidi (superfici, oggetti, strumenti Fenoli (superfici, oggetti) Attività buona Attività media Solo su alcune forme Attività nessuna 61