Lezione n. 27 / 28 NMR. 02/03/2008 Antonino Polimeno 1

Transcript

1 Chimica Fisica - Chimica e Tecnologia Farmaceutiche Lezione n. 27 / 28 Principi delle spettroscopie magnetiche Proprietà magnetiche della materia NMR 02/03/2008 Antonino Polimeno 1

2 Proprietà magnetiche della materia (1) - Una molecola può essere dotata di un momento magnetico permanente, oltre che di un momento indotto da una campo magnetico esterno - Quando un campo magnetico agisce su un materiale, gli effetti dipendono dalla densità del flusso magnetico B (unità SI tesla (T), dove 1 T = Kg s -2 A -1, che corrisponde nel sistema cgs a 10 4 gauss). - Un campione macroscopico esibisce una magnetizzazione M (momento magnetico per unità di volume) - Per un materiale isotropo M B = H µ 0 - dove µ 0 = 4π 10 7 N/A 2 è la permeabilità nel vuoto; χ èla suscettività magnetica del materiale 0 B = µ H M = χh µ χ = 1 µ Antonino Polimeno 2

3 Proprietà magnetiche della materia (2) - La suscettività magnetica del materiale può essere - positiva; materiale paramagnetico p.es. aria, alluminio, magnesio, platino - negativa; materiale diamagnetico p. es.acqua, argento, oro, piombo). - Nel primo caso il campo magnetico nel materiale è maggiore che nel vuoto, nel secondo caso è minore. - Nel caso il campo magnetico sia molto maggiore si parla di - materiale ferromagnetico, p. es. cobalto, ferro, nichel Antonino Polimeno 3

4 Proprietà magnetiche della materia (3) - Una relazione generale - dedotta da Langevin (1905) - tra la suscettività magnetica molare e le proprietà molecolari in molti materiali è la seguente M χ χ N α m ρ = = + p 2 3kT B - Le caratteristiche magnetiche di una sostanza sono conseguenza diretta delle proprietà molecolari, come si vede dalla formula di Langevin. - Una molecola è sede di molti momenti magnetici, che a loro volta dipendono dai vari momenti angolari: - orbitali elettronici - spin elettronici - spin nucleari Antonino Polimeno 4

5 Proprietà magnetiche della materia (4) - In particolare, il paramagnetismo è legato al momento angolare degli elettroni. La relazione classica tra il momento magnetico di un atomo (idrogenoide per semplicità) con un elettrone che si muova lungo un'orbita circolare ed il momento angolare è p = γ L - I due vettori sono antiparalleli e diretti perpendicolarmente all'orbita. Da un punto di vista quantistico, il momento angolare dell'elettrone è quantizzato, secondo il numero quantico l, ed assume solo i valori p µ z B = m µ B 24-1 = e / 2m = JT e - In presenza di un campo magnetico esterno, il momento angolare precede attorno alla direzione del campo, e la componente diretta lungo il campo assumere valori dettati dal numero quantico magnetico m Antonino Polimeno 5

6 Antonino Polimeno 6

7 Proprietà magnetiche della materia (5) - L'elettrone possiede anche un momento angolare intrinseco, detto spin, che causa un momento magnetico. Un elettrone spaiato è perciò un piccolo magnete. - Anche in questo caso possiamo trovare una relazione di proporzionalità diretta tra momento magnetico e momento angolare di spin, ma il rapporto giromagnetico è (circa) il doppio di quello del caso orbitalico, - La quantizzazione del modulo dipende dal numero quantico di spin s, che peraltro per un elettrone vale 1/2, - in presenza di una campo magnetico la componente lungo il campo è quantizzata - Lo studio dell'influenza di un campo magnetico sulla quantizzazione dei momenti magnetici risultanti dalla presenza di elettroni spaiati e la loro dipendenza dall'intorno chimico sono importanti per la spettroscopia EPR. Antonino Polimeno 7

8 Proprietà magnetiche della materia (6) - Infine, le proprietà magnetiche di una molecola sono dettate anche dal momento magnetico dei nuclei atomici, che, sono dotati spesso (non sempre) di momento angolare di spin intrinseco, e quindi di momento magnetico - lo studio dell'influenza di un campo magnetico sulla quantizzazione dei momenti magnetici nucleari, le transizioni tra livelli energetici magnetici nucleari e la loro dipendenza dall'intorno chimico sono discussi nell ambito della spettroscopia NMR. Antonino Polimeno 8

9 Risonanza magnetica nucleare (1) - Lo spin di un nucleo è descritto da un numero quantico, che indichiamo con I, associato al vettore momento di spin - Per nuclei con numero di massa dispari, I è un multiplo dispari di 1/2, mentre per nuclei con numero di massa pari I è un multiplo pari di 1/2. - Il momento magnetico assume i valori pn = gnµ N I( I + 1) g = µ H N = e 2m p = JT In presenza di una campo magnetico esterno B 0, la componente del momento magnetico nucleare diretta lungo il campo assume valori quantizzati, che corrispondono anche a livelli energetici rivelati dalla struttura iperfine delle righe spettrali. pnz, = MIgNµ N, MI= I, I + 1,..., I 1, I Antonino Polimeno 9

10 Risonanza magnetica nucleare (2) - I livelli energetici risultano equispaziati E = p B = M g µ B Nz, 0 I N N E = g µ B = γ B 0 0, M = ± 1 N N N I ν = γ N 2 B π 0 - Es. 19 F: g N = , B 0 = 1 T E= J, ν = MHz 0 Antonino Polimeno 10

11 Antonino Polimeno 11

12 Risonanza magnetica nucleare (3) - Le transizioni tra questi livelli energetici sono osservabili con picchi di assorbimento, da esprimersi in opportune unità (vedi oltre). In pratica, nei moderni spettrometri NMR, il campione è soggetto ad un campo magnetico molto intenso che genera lo splitting dei livelli. - L'eccitazione avviene mediante onde radio e l'assorbimento in corrispondenza delle diverse frequenze di risonanza viene registrato. Quindi in sintesi, in uno spettro NMR in ascissa abbiamo una misura della frequenza di assorbimento ed in ordinata un'assorbanza. Antonino Polimeno 12

13 Risonanza magnetica nucleare (4) - L'importanza della spettroscopia NMR discende da una considerazione: i nuclei attivi risentono del loro intorno chimico formato da altri atomi che li circondano, con i loro elettroni. - Il campo magnetico applicato induce, sull'intorno elettronico di ogni nucleo, un campo magnetico locale opposto (fenomeno di induzione). La nube elettronica provoca una modulazione locale del campo applicato, detta schermatura. - Il campo residuo effettivo è ( ) B= B σ Al variare dell'intorno chimico di un certo nucleo, la frequenza di risonanza è più bassa di un fattore 1-σ, dato che solitamente il campo magnetico indotto è opposto a quello applicato. - Diversi valori di σ corrispondono a diversi intorni chimici. Antonino Polimeno 13

14 Risonanza magnetica nucleare (5) - Un modo conveniente di definire il comportamento di un nucleo è dato dallo spostamento chimico o chemical shift che si ricava mettendo in relazione le costanti di schermo dei vari nuclei con un composto standard. - Per studi NMR basati sul protone e sul 13 C si usa come standard il tetrametilsilano (Si(CH 3 ) 4, TMS). - L'atomo di silicio è infatti il meno elettronegativo dei tre elementi che costituiscono il TMS (elettronegatività: Si=1.91; H=2.1; C=2.55), e questo causa un'altissima schermatura del carbonio e dell'idrogeno. Inoltre, grazie all'alta simmetria della molecola, tutti gli atomi di carbonio e tutti gli atomi di idrogeno sono schermati nella stessa misura. Antonino Polimeno 14

15 Risonanza magnetica nucleare (6) - Il chemical shift è definito in modo rigoroso come la frequenza di assorbimento del nucleo, meno la frequenza del riferimento, diviso per la frequenza del riferimento moltiplicato per 10 6 e cioè in parti per milione (ppm) δ ν ν = rif 10 ν - Spesso si descrive il comportamento di un determinato nucleo in termini di posizioni relative nello spettro. Per esempio, un picco con shift δ = 10 ppm si dice a campi bassi (o deschermato) rispetto ad un picco a 5 ppm, tenendo presente che la massima schermatura in linea di principio è a 0 ppm. rif 6 Antonino Polimeno 15

16 Antonino Polimeno 16

17 Risonanza magnetica nucleare (6) - L'analisi di uno spettro NMR può esser molto complessa, ma anche estremamente informativa sulla struttura e la dinamica molecolare. - Di particolare importanza risulta essere il fenomeno detto accoppiamento spin-spin (spin-spin coupling), responsabile di molte delle caratteristiche che rendono la spettroscopia NMR utile per determinare la struttura di una molecola. - Consideriamo come esempio l'etanolo, CH 3 CH 2 OH, di cui si riporta lo spettro 1 H NMR ad alta risoluzione. Antonino Polimeno 17

18 Risonanza magnetica nucleare (6) - Ciò accade a causa di una piccola interazione (accoppiamento) tra i due gruppi di protoni. Si può verificare come la distanza tra i picchi del tripletto metilico e tra i picchi del quartetto metilenico sia uguale: questa quantità, di solito espressa in Hertz, si dice costante di accoppiamento, J. - Consideriamo i protoni del metilene: sono due, e ciascuno ha una di due possibili orientazioni (allineato od opposto al campo magnetico), il che porta a quattro possibili configurazioni, - nella prima gli spin sono entrambi opposti al campo: questo causa una lieve diminuzione del campo risentito dai protoni del metile (e quindi si vede uno spostamento a campi un po' più alti) - delle altre tre configurazioni, due hanno gli spin in opposizione l'uno all'altro e quindi non influenzano i protoni metilici; l'ultima rafforza il campo (essendo gli spin entrambi paralleli al campo stesso) e quindi i protoni metilici si spostano a campi un po' più bassi. - Il risultato è che i protoni del metile si 'vedono' come un tripletto con intensità (rapporto fra le aree) 1:2:1. Antonino Polimeno 18

19 Risonanza magnetica nucleare (7) - Allo stesso modo, l'effetto dei protoni del metile sui protoni del metilene è razionalizzabile dalle otto possibili combinazioni dei tre protoni; - di queste abbiamo due gruppi di tre con lo stesso effetto magnetico - Si hanno perciò quattro possibili effetti, che portano ad uno splitting del metilene in quattro picchi con intensità 1:3:3:1. Antonino Polimeno 19

20 Risonanza magnetica nucleare (8) - In uno spettro NMR, assumendo che il chemical shift tra gruppi di protoni interagenti sia molto maggiore delle loro costanti di accoppiamento, l'intepretazione dei picchi è molto semplice 1. la molteplicità di un multipletto è data dal numero di protoni equivalenti vicini più uno 2. i nuclei equivalenti non interagiscono fra loro 3. la costante di accoppiamento è indipendente dal campo applicato Antonino Polimeno 20

21 Risonanza magnetica nucleare (9) - L'isotopo paramagnetico più usato ed abbondante è 1 H, con un chemical shift non grande, ma segnali molto stretti; - il deuterio 2 H è di solito impiegato come tale in solventi deuterati (per non interferire con l'idrogeno), ma anche come sonda per membrane fosfolipidiche, cristalli liquidi etc. - L'isotopo elio 3 He è molto sensibile, ma presente in percentuali piccole nell'elio naturale, che quindi deve essere arricchito artificialmente - Il 13 C è molto usato, anche se presente in basse percentuali: l'acquisizione degli spettri è quindi molto lenta; usato per marcare composti in studi di - sintesi e metabolismo, ha una bassa sensibilità, ampio chemical shift e segnali stretti - Molto usato anche 15 N, per studi di marcatura anche se è presente in basse percentuali e può richiedere arricchimento del campione. - Altri isotopi abbastanza usati sono 14 N mediamente sensibile, presente in alte percentuali e non utilizzabile per molecole piccole e 19 F, con un buon chemical shift. Antonino Polimeno 21

22 Risonanza paramagnetica elettronica (1) - La Risonanza Paramagnetica Elettronica o Risonanza di Spin Elettronico, nota come EPR (dall'acronimo inglese Electron Paramagnetic Resonance) o ESR (dall'inglese Electron Spin Resonance) è una tecnica spettroscopica impiegata per individuare e analizzare specie chimiche contenenti uno o più elettroni spaiati (chiamate specie paramagnetiche), come - i radicali liberi, - gli ioni di metalli di transizione - i difetti in cristalli - le molecole in stato elettronico di tripletto fondamentale (ad es. l'ossigeno molecolare) o indotto per fotoeccitazione - I concetti basilari della tecnica EPR sono analoghi a quelli della risonanza magnetica nucleare, ma in questo caso sono gli spin elettronici ad essere eccitati al posto degli spin dei nuclei atomici. Antonino Polimeno 22

23 Risonanza paramagnetica elettronica (2) - Per un elettrone spaiato il numero quantico di spin vale s=1/2 e i possibili valori del numero quantico magnetico sono m s =+1, -1 - In presenza di una campo magnetico - diretto per convenzione lungo l'asse z del laboratorio - i due stati hanno energie pari a E = = p B gµ m B s, z 0 B s 0 - dove g= , µ B è il magnetone di Bohr - I valori dei fattori g dipendono da caratteristiche quantomeccaniche sofisticate; in condizioni diverse - vuoto, legami chimici - il loro valore può cambiare. Antonino Polimeno 23

24 Risonanza paramagnetica elettronica (3) - All'aumentare del campo aumenta quindi la differenza di energia tra i due stati. - Un elettrone spaiato può passare da un livello energetico all'altro assorbendo oppure emettendo una quantità di energia E tale che sia verificata la condizione di risonanza, con la condizione richiesta dalla regola di selezione ms =±1 - La maggioranza delle misure EPR viene effettuata in campi magnetici di circa 0.35 T con una corrispondente risonanza di spin che ricade nella regione delle microonde alla frequenza di 9-10 GHz. - In linea di principio, gli spettri EPR possono essere generati sia variando la frequenza dei fotoni incidenti su un campione mantenendo il campo magnetico costante, sia nel modo contrario. Antonino Polimeno 24

25 Risonanza paramagnetica elettronica (4) - Nella pratica si tende a mantenere costante la frequenza: l'insieme di centri paramagnetici, come i radicali liberi, viene esposto a microonde di frequenza fissata. - Aumentando il campo magnetico esterno, la differenza di energia tra gli stati di spin +1/2 e -1/2 tende ad aumentare fino a raggiungere il valore di risonanza con le microonde e generando un picco di assorbimento dovuto alla maggiore popolazione presente allo stato energetico inferiore (le popolazioni dei vari stati seguono la distribuzione di Boltzmann). - Un tipico spettro EPR riporta quindi un'assorbanza contro un campo magnetico - Solitamente inoltre lo spettro è presentato in derivata, cioè si rappresenta la derivata dell'assorbanza invece dell'assorbanza stessa. Antonino Polimeno 25

26 Antonino Polimeno 26

27 Risonanza paramagnetica elettronica (5) - Le applicazioni principali della spettroscopia EPR riguardano lo studio di radicali liberi in soluzione o ioni paramagnetici in solidi cristallini. - Di particolare interesse èla tecnica detta di spin labelling, nella quale una molecola organica con un elettrone spaiato viene legata chimicamente ad una molecola oggetto di indagine. - L'analisi dello spettro consente di ottenere informazioni molto accurate sull'intorno chimico della sonda paramagnetico e quindi sulla struttura (e dinamica) della molecola ospite - In linea di principio, il segnale è presente sotto forma di picchi dovuti all'accoppiamento con alcuni nuclei (quelli a momento nucleare maggiore) presenti nell'intorno dell'elettrone spaiato - Per esempio nel caso dello spettro in soluzione del TEMPO, un radicale libero stabile molto usato in studi EPR, la presenza di un tripletto si deve all'accoppiamento con il nucleo di azoto 14 N, con I=1: i tre possibili stati dello spin nucleare schermano in modo diverso l'elettrone. - In pratica per, la forma complessiva di uno spettro EPR può dipendere in modo significativo dalla temperatura e da altri fattori, legati in modo complesso alla dinamica molecolare dell'intorno. Antonino Polimeno 27

28 NMR Esempi (1) Ribbon diagram della struttura cristallina di (a) AKeco e (b) AKeco in complesso con l inibitore l AP5A. Antonino Polimeno 28

29 Parametri sperimentali (1) (a) 15 N T 1 (b) 15 N T 2 (c) 15 N-{ 1 H} NOE (1) da dati acquisiti a 303 K at T (blu) e T (magenta)) in funzione del numero del residuo Antonino Polimeno 29

30 Dinamica di AKeco [modello dinamico (a) e modello dinamico (b)]. Dinamiche con τ < 4 ns in giallo, τ > 4 ns in rosso. Antonino Polimeno 30

31 NMR Esempi (2) Antonino Polimeno 31

32 T1 > T2 ; i tempi di rilassamento dipendono dal tipo di tessuto Antonino Polimeno 32

33 Antonino Polimeno 33

34 Antonino Polimeno 34

35 Siemens 3 Tesla Magnetom Allega MR Headscanner Antonino Polimeno 35

36 EPR Esempi (2) Antonino Polimeno 36

37 1 2 Antonino Polimeno 37

38 Antonino Polimeno 38

39 Dinamica molecolare di un doppio strato di fosfatidilcolina Cristallo Gel Fluido Ac.Palmitico Acqua Azoto, Ac. Oleico, Fosforo Ossigeno Antonino Polimeno 39