Meccanismi di riparazione del DNA. Rotture al DNA, meccanismi di riparazione e conseguenze

Transcript

1 Meccanismi di riparazione del DNA I danni al DNA sono una continua minaccia alla stabilità genomica di una cellula. Gli organismi viventi hanno evoluto vari meccanismi per proteggere l integrità del DNA Questi meccanismi si basano sulla attività degli enzimi della riparazione del DNA. I molteplici sistemi di riparazione del DNA si sono evoluti per salvaguardare l integrità dell informazione genetica negli organismi viventi. Ogni via di riparazione è specializzata nel correggere specifici tipi di danno al DNA Esistono numerosi tipi di lesioni, un singolo processo di riparazione non potrebbe fare fronte a tutti i tipi di danno. L evoluzione ha modulato una grande varietà di sofisticati sistemi di riparazione che riescono a recuperare la maggioranza degli insulti inflitti all informazione genetica cellulare I sistemi di riparazione del DNA devono essersi sviluppati molto presto nell evoluzione, e per questo sono sistemi altamente conservati Rotture al DNA, meccanismi di riparazione e conseguenze Agenti del danno Conseguenze Riparazione diretta Processi di riparazione complessi 1

2 Wolters, Genome maintenance and transcription integrity in aging and disease. Frontiers in Genetics, 4, article 19, 110, 2013 doi: /fgene Fig 1. Diverse lesion types trigger DNA damage responses. DNA damage can be caused by various genotoxic agents, such as Reactive Oxygen Species (ROS) produced during cellular metabolism, Alkylating Agents that find application in cancer therapy, Ionizing radiation (IR), which is used for radio therapy, or UltraViolet (UV) irradiation presenting a daily threat as it is contained in sunlight. The inflicted lesions are just as diverse, since - ROS usually lead to base modifications; - alkylating agents form adducts, while - bifunctional alkylating agents crosslink DNA to form Interstrand CrossLinks (ICLs). - IR typically induces Double-Strand Breaks (DSBs), and - UV light triggers the formation of Cyclobutane Pyrimidine Dimers (CPDs) and 6,4-PhotoProducts (6,4-PPs). Cells have a repertoire to sense the different lesions and subsequently activate DNA damage checkpoint proteins. Ultimately, cells respond to the DNA damage by chromatin remodeling, modified transcription, fine-tuning of energy metabolism, cell cycle arrest, activation of DNA repair pathways and in case of irreparable damage load, induction of senescence or apoptosis. 2

3 Gli agenti alchilanti si dividono in: ] bifunzionali: possono formare dei legami a ponte (cross-link) tra due filamenti del DNA o all interno dello stesso filamento provocando la rottura completa della molecola di DNA, oppure possono causare un blocco della trascrizione e della duplicazione (nitrogen mustard) crosslink at N-7 guanine on both strands (G-G crosslink) nitrogen mustard ] monofunzionali: si legano ad una sola parte e non danno luogo a dei cross-links, ma agiscono spezzando la catena del DNA inattivandolo (ethyl methanesulfonate EMS). Alcuni agenti alchilanti, come l ethylmetane sulfonate (EMS) agiscono trasferendo gruppi etilici e metilici al DNA, causando disappaiamento delle basi. Altri agenti alchilanti attaccano preferenzialmente adenina e guanina (purine) rendendo più labile il legame con il deossiribosio e favorendo la depurinazione. La replicazione del DNA apurinico può generare una mutazione per sostituzione casuale della base. 3

4 Meccanismo Lesione al DNA Sistemi enzimatici Rip diretta: fotoriattivazione Rip diretta: transmetilazione Dimeri di pirimidina Metilazione-alchilazione DNA fotoliasi Alchil-metiltransferasi Escissione di basi (BER) Escissione di nucleotidi (NER) MisMatch repair (MMR) Ricombinazione omologa e non omologa Basi danneggiate (es. alchilate) Dimeri di pirimidina Grossi addotti delle basi Errori di replicazione (appaiamenti non corretti) Glicosilasi+endonucleasi UvrA,B e C in E. coli XPA, B, C, D, E, F, G in h. sapiens MutS, MutL, MutH in E. coli MSH, MLH e PMS in h. sapiens Rotture a doppio filamento RecA e RecB in E. coli Sistemi di ricombinazione RISPOSTE CELLULARI AL DANNO AL DNA: I MECCANISMI DI RIPARAZIONE REVERSIONE DIRETTA DELLE LESIONI fotoriattivazione (in procarioti e eucarioti, ma assente nei mammiferi placentati) transmetilazione: riparazione di O 6 -metilguanina (nella maggior parte delle specie) ESCISSIONE DELLE LESIONI excisione di basi (BER) excisione di nucleotidi (NER) RIPARAZIONE DEGLI ERRORI DI APPAIAMENTO TRA LE BASI (MMR) RIPARAZIONE RICOMBINATIVA Ricombinazione omologa (HR) Ricombinazione non omologa (NHEJ) 4

5 Formation of the most toxic and mutagenic DNA lesion, cyclobutane-pyrimidine dimers by UV radiation. Dimers can form between two adjacent pyrimidines. CH 3 CH 3 thymine-thymine cyclobutane-pyrimidine dimer (CPD) dipyrimidine bases 6-4PhotoProduct) pirimidina (6-4) pirimidone. In questo caso i raggi UV aprono i legami in C-5 C-6, uno degli anelli pirimidinici ruota e il suo C-4 forma un legame con il C-6 dell altro anello. (6-4 pirimidina-pirimidone thymine-cytosine dimer and their photoreactivation by the enzyme photolyase in the presence of light. dipyrimidine bases 5

6 L esposizione del DNA ai raggi UV determina il legame covalente tra due pirimidine adiacenti. Queste strutture vengono chiamate dimeri ciclobutano pirimidina. FOTORIATTIVAZIONE (a) Formation of thymine dimer; (b) Distorted DNA. L enzima DNA fotoliasi (deossiribodipirimidina foto-liasi) catalizza la monomerizzazione dei dimeri di pirimidina. E associata a gruppi cromofori come - FADH 2 (flavina adenina dinucleotide ridotto) coenzima ossiriduttivo, partecipa a innumerevoli reazioni che comportano il trasferimento di 1 o 2 elettroni ; - pterina (composto aromatico, che deriva da una molecola di pteridina 2-amino, 4-cheto sostituita; assorbono fotoni (luce da 300 a 500 nm) e catalizzano la destabilizzazione del legame tra le due pirimidine mediante un trasferimento di elettroni. FOTORIATTIVAZIONE La DNA fotoliasi cattura dal sole l energia necessaria per rompere i legami covalenti che uniscono le pirimidine adiacenti 6

7 Transmetilazione: trasferimento del gruppo metilico (o alchilico) La O 6 -metilguanina è una lesione altamente mutagenica che permette alla guanina di appaiarsi sia con la citosina che con la timina. Confonde il sistema di riparazione degli appaiamenti errati delle basi (MMR) poiché innesca inutili cicli di rimozione di mismatch e successiva reincorporazione della base sbagliata da parte della riparazione replicativa. La metiltransferasi trasferisce il gruppo metilico dalla guanina ad uno dei proprio residui di cisteina. MGMT inattiva RISPOSTE CELLULARI AL DANNO AL DNA: I MECCANISMI DI RIPARAZIONE ESCISSIONE DELLE LESIONI Escissione di Basi e Riparo (BER) Base Excision Repair (BER) 1. Pathway principale per la riparazione di basi modificate, incorporazioni di nucleotidi errati, danni ossidativi, siti apurinici e rotture a singolo filamento. 2. Varie DNA glicosilasi riconoscono le lesioni e rimuovono la base al suo legame glicosidico generando siti abasici o AP (apurinic/ apyrimidinic) 3. Una delle numerose AP endonucleasi incide lo scheletro fosfodiesterico adiacente al sito AP 4. Il nucleotide AP viene rimosso da una esonucleasi/drpase e il tratto mancante di DNA viene riempito attraverso la sintesi di DNA e ligazione. 7

8 La glicosilasi si lega al DNA e lo distorce per inserire la base sospetta in una tasca specifica dove avviene il taglio del legame glicosidico tra base e deossiribosio (ROS) Quando sono riparati SSB intervengono la poli-(adp-ribosio) polimerasi (PARP), la polinucleotide chinasi (PNK), a proteggere e modificare le estremità libere. Il sito AP è riconosciuto da una AP endonucleasi che incide al 5 del fosforibosio e genera un gruppo 3 -OH per la polimerasi che inserirà il nucleotide corretto PCNA e la esoendo nucleasi FEN1 determinano lo scalzamento e la rimozione del filamento danneggiato PCNA, Proliferating Cell Nuclear Antigen) 8

9 Come fa la glicosilasi a rilevare la presenza di una base danneggiata mentre esamina il genoma? Le glicosilasi scorrono lungo il solco minore del DNA finché non trovano la specifica lesione. Quando la base si trova all interno della doppia elica, la base danneggiata viene ribaltata all esterno così da protrudere fuori dalla doppia elica e sedersi nella tasca enzimatica specifica Nucleotide Excision Repair (NER) 1. Riconosce lesioni che bloccano la replicazione del DNA (es. fotodimeri di pirimidina indotti da UV e addotti ingombranti indotti dagli idrocarburi policiclici aromatici) 2. Distorsioni nella doppia elica 3. In E. coli, mediata da UvrABCD 4. Negli eucarioti, molte proteine coinvolte 5. Può essere generale per tutto il genoma (Global Genome Repair-GGR) oppure strettamente associata alla trascrizione (Transcription Coupled Repair-TCR) 9

10 Riparazione attraverso escissione nucleotidica in E. coli ATP ADP+Pi A A UvrA UvrB Piegamento del DNA (bolla di denaturazione) B Elicasi D Taglio al 5 ed al 3 (8 nucl. a monte e 4-5 a valle) 12-mer ATP ADP+Pi C UvrC POLI B B 12 nt sostituiti 10

11 Transcription-Coupled Repair (TCR) Il transcription Repair Coupling Factor (TCRF) lega il complesso della RNA polimerasi bloccato dal danno e recluta il complesso UvrA 2 B 11

12 TCR in mammifero Formazione di un grosso complesso proteico insieme alla RNA polimerasi in stallo (complesso TCNER). Il complesso disloca la polimerasi favorendo l accesso delle proteine richieste per il BER o per il NER. Dopo la riparazione, la trascrizione riparte. I geni che codificano CSA e CSB sono mutati nella sindrome di Cockayne (CS) (fotosensibilità della pelle) 12

13 (Nucleotide Excision Repair) NER nei mammiferi 1. Il danno viene riconosciuto da XPC che è legato ad hhr23b 2. Successivamente si legano XPA, RPA, TFIIH e XPG. Due DNA elicasi che costituiscono TFIIH formano una bolla nel DNA 3. Si lega ERCC1-XPF 4. L endonucleasi XPG taglia l elica danneggiata al 3 del sito di danno. ERCC1-XPF taglia l elica al 5 del sito di danno (incisione bimodale) generanado un frammento di nt 5. Escissione del frammento, sintesi del DNA e ligazione I geni che codificano XPA, B, C, E, F e G sono mutati nello Xeroderma Pigmentoso 13

14 Wolters, Genome maintenance and transcription integrity in aging and disease. Frontiers in Genetics, 4, article 19, 110, 2013 doi: /fgene (modified) 14

15 Malattie umane causate da alterazioni nella riparazione per escissione di nucleotidi (NER) MALATTIA SINTOMI FUNZIONI ALTERATE GENE MUTATO Xeroderma Pigmentoso (XP) Sensibilità alla luce del sole; cancro della pelle, lesioni oculari, frequenti anormalità neuronali, invecchiamento prematuro Riparazione del DNA danneggiato da UV o sostanze chimiche (ipersensibilità ai raggi UV e agenti chimici) XPA,XPB, XPC, XPD, XPF, XPG Sindrome di Cockayne (CS) Nanismo; senilità precoce; atrofia oculare; ritardo mentale; sensibilità alla luce solare, normalmente non associata al cancro Riparazione del danno ossidativo associata alla trascrizione. CSA, CSB, XPB, XPD, XPG Tricotiodistrofia (TTD) Capelli e unghie fragili, ritardo fisico e mentale, normalmente non associata al cancro Riparazione del DNA danneggiato da UV. XPB XPD 15

16 Xeroderma Pigmentosum Autosomica recessiva. 1/ (Western countries) - 1/ (Giappone) Sviluppo precoce di carcinoma cutaneo e delle cellule squamose, melanomi, angiomi e sarcomi (50% dei pazienti) Degenerazione neuronale (20%) 10 gruppi di complementazione (eterogeneità di locus) Difetti principalmente nella riparazione per escissione dei nucleotidi (NER). Mutazioni nei geni:xpa, B, C, E, F e G Sindrome di Cockayne Malattia autosomica recessiva È caratterizzata da: sensibilità alla luce, nanismo, microcefalia, difetti neuronali, sordità, invecchiamento precoce. Non presenta predisposizione al cancro Difetti principalmente in TCR - Mutazioni nei geni CSA e CSB - TCR: (transcription-coupled Repair) 16

17 CNS: Central Nervous System The initial damage response in TCR is mediated by the coupling factors CSA and CSB associated with the RNA polymerase II transcription elongation complex. The initial damage response in GGR is mediated by the damage-recognition factors XPE and XPC. Following damage recognition, the damaged site is remodelled by the helicase activities of XPB and XPD and binding of XPA and replication protein A (RPA). The nucleases XPG and XPF ERCC1 then cut the damaged oligo nucleotide region either side of the damage and this is excised. The repair patch is synthesized by proliferating-cell nuclear antigen (PCNA) and replicative polymerase (Polδ). Damage that isnot excised must be replicated by the action of Polδ. RISPOSTE CELLULARI AL DANNO AL DNA: I MECCANISMI DI RIPARAZIONE RIPARAZIONE DEGLI ERRORI DI APPAIAMENTO TRA LE BASI (MMR) RIPARAZIONE RICOMBINATIVA Ricombinazione omologa (HR) Ricombinazione non omologa (NHEJ) 17

18 In un primo ciclo di replicazione l erronea incorporazione di una base può introdurre una mutazione. Se l appaiamento errato sfugge al sistema di correzione di bozze da parte dell attività esonucleasica 3-5 delle DNA polimerasi replicative (aumenta la fedeltà della replicazione di un fattore 100), in un secondo ciclo replicativo, la mutazione viene definitivamente fissata nella sequenza di DNA. MisMatch Repair (MMR) in E. coli (Principale responsabile della fedeltà della replicazione) (aumenta la correttezza della sintesi del DNA di un fattore tre) L omodimero MutS analizza il DNA e riconosce i mismatch dalla distorsione che essi producono sulla doppia elica MutS si chiude intorno al DNA, induce su di esso una profonda curvatura e subisce una modificazione conformazionale 18

19 MutS recluta la proteina MutL che a sua volta attiva l endonucleasi MutH, un enzima che taglia un filamento nelle immediate vicinanze del mismatch L elicasi UvrD svolge il DNA a partire dall incisione mentre una esonucleasi digerisce progressivamente la singola elica spostata. Si produce una regione a singolo filamento che viene riempita dalla Pol III. Infine una DNA ligasi rinsalda il nick 19

20 Come fa il sistema di riparazione a riconoscere quale dei due nucleotidi scorrettamente appaiati deve sostituire? La Dam metilasi aggiunge un gruppo metilico alla N 6 dell adenina nelle sequenze GATC (sequenza presente una volta ogni 256 basi) Dopo la replicazione, per alcuni minuti, le molecole di DNA figlie, risultano emimetilate. Il filamento di nuova sintesi è quindi riconoscibile dall assenza di metilazione MutH introduce selettivamente un nick sul filamento non metilato 20

21 Direzionalità del sistema MMR Se il DNA viene tagliato al 5 del mismatch l esonucleasi VII o RecJ che degrada il DNA in direzione 5-3 rimuove il tratto di DNA compreso tra il sito di taglio e il nucleotide errato Se il DNA viene tagliato al 3 del mismatch il DNA viene rimosso dall esonucleasi VI che degrada la doppia elica in direzione

22 Mismatch repair nei mammiferi L eterodimero hmsh2/6 riconosce i mismatch e i loops a singola base L eterodimero hmsh2/3 riconosce i loops da inserzione/delezione hmutla e hmutlb interagiscono con MSH e con i fattori di replicazione Sembra che i frammenti di Okazaki forniscano il segnale di discriminazione tra elica parentale e figlia Difetti nel MMR nei mammiferi predispongono al cancro, principalmente al cancro del colon non poliposico (HNPCC), ma anche a cancro uterino, ovarico e gastrico 22

23 Sindrome di Lynch I: (carcinoma ereditario colon-rettale non poliposico, Hereditary Non-Polyposis Colon Cancer HNPCC È una forma ereditaria di tumore al colon con trasmissione dominante, il che significa che ha una probabilità del 50% di manifestarsi nei figli di chi ne è affetto. Diversamente dalla poliposi adenomatosa familiare, la predisposizione allo sviluppo della malattia non si manifesta con la comparsa di polipi, ma direttamente con lo sviluppo del cancro al colon, in genere intorno ai 45 anni di età. Sindrome di Lynch di tipo II: oltre al tumore al colon, comprende altre possibili neoplasie a livello: dell'endometrio, dell'ovaio, dello stomaco, del tratto urinario, dei dotti biliari. Hereditary Gene(s) for which testing Mutation detection rate by cancer syndrome is available sequencing Lynch syndrome MMR genes: MLH1, MSH2, MLH1, MSH2: 85 90% (HNPCC) MSH6, PMS2 MSH6: about 7-10% PMS2: fewer than 5% Unknown genes? EPCAM (not an MMR gene) inactivate MSH2 in about 1% of individuals with Lynch syndrome EPCAM (detected by duplication/deletion analysis) (MMR) genes: Mismatch Repair Genes 23

24 Riparazione delle rotture DSB NHEJ: Predominante nei mammiferi Riparazione inaccurata Veloce meccanismo di emergenza Non dipende dai cromatidi fratelli Attiva in G1 e sia in cellule aploidi che diploidi HR: Prevale nelle cellule in fase S e G2 Riparazione accurata Veloce meccanismo di emergenza 24

25 Una serie di step sono alla base della risposta ai DSB ATM ATM = A-T mutated Serina-treonina chinasi nucleare attivata da rotture a doppio filamento Fosforila e attiva numerosi substrati che si accumulano nei foci di riparo (quindi associati alla riparazione del danno) o bloccano il ciclo cellulare: p53, BRCA1. FANC D2, NBS1, istone H2AX IF Ab Contro H2AX Devono essere percepiti da una molecola che è in grado di riconoscere le lesioni sul DNA o le alterazioni cromatiniche che derivano dalla rottura del DNA Le estremità rotte devono essere quindi processate Vengono attivati i fattori di trasduzione del segnale, probabilmente attraverso modificazioni post-trasduzionali Il segnale viene trasmesso ai fattori effettori Il trasduttore iniziale e principale è ATM 25

26 Model of the double-stranded-break response cycle. (A) Undamaged section of a chromosome, showing two chromatin loops and inactive ATM dimer. (B,C) Induction of a DNA doublestranded- break (DSB), modification of ATM and recruitment of both ATM and MRE1/RAD50/NBS1 (MRN). The possibility that MRN binds before ATM is shown, but the exact order is unknown. The thin black line indicates modified chromatin. (D,E) A wave of H2AX phosphorylation is followed by recruitment of mediators (mediator of DNA damage checkpoint protein 1 (MDC1), p53-binding protein 1 (53BP1) and breast-cancerassociated protein 1 (BRCA1)) to the The molecular architecture of the focus is unknown. (F) Disassembly of the focus, ATM inactivation and chromatin remodelling. The model suggests at least two distinct forms of soluble ATM: an inactive oligomer and an active monomer, and at least two distinct active insoluble forms: one directly at the lesion and another integral to the growing focus. Note that the MRN complex is also a component of the growing focus but, for clarity, has been omitted here. Complex, persistent lesions are thought to be more difficult to repair, and this is reflected in the size attained by the growing focus. The insect contains a colour-coded key to the molecules shown 26

27 MRN ha un ruolo fondamentale come sensore del DSBs e nel processamento e riparazione del danno Principali ruoli del complesso MRN Stimola l attività di DNA ligasi Facilita la ricerca di brevi o lunghe regioni di omologia Mantiene vicine le estremità del DNA MRN: MRE1/RAD50/NBS1 Media la coesione tra un cromatidio rotto e il cromatidio fratello, per impedirne la separazione Rad50 modula l attività enzimatica di Mre11 27

28 Sindromi umane associate a difetti nella riparazione del DNA MALATTIA SINTOMI FUNZIONI ALTERATE GENE MUTATO Atassia Telangiecta sia (AT) Difetti coordinazione muscolare; progress. atrofia muscolare spinale; ipersensibilità alle IR e a agenti chimici; predisp. al cancro, ritardo mentale, immunodeficienza Riparazione replicativa del DNA ATM Anemia di Fanconi (FA) Anemia aplastica, malformazione del cuore, rene ed arti; leucemia; rotture cromosomiche Riparazione replicativa, dimeri di pirimidina indotti da UV; attività ligasica, esonucleasica e trasporto enzimi della riparazione. FAA, FAC Sindrome di Bloom (BS) Difetti di crescita; malattie dovute a fotosensibilità; instabilità cromosomica, alta incidenza di tumori Allungamento delle catene di DNA nella replicazione. BLM Sindrome di Werner (WR) Progeria, ridardo nella crescita Allungamento delle catene di DNA nella replicazione. (BER) WRN L attivazione dei checkpoint è necessaria per la percezione del danno e l amplificazione del segnale in modo da attivare un appropriata risposta biologica. Cancro del colon non poliposico (HNPCC) Tendenza allo sviluppo del cancro al colon non poliposico Mismatch repair hmsh2, hmlh1, hpms1, hpms2 28

29 Clinical phenotype Cerebellar ataxia: progressive neuronal degeneration Immunological dysfunction: low Ig and IgE; normal V(D)J recombination Cancer predisposition: lymphoma and leukaemia; chromosomal translocation Hypogonadism Sensitivity to ionizing radiation Premature aging Increased alpha-fetoprotein Small stature Insulin resistance Cellular phenotype Clinical phenotypes of ataxia-telangiectasia (ATM gene mutated) DNA damage and repair: chromosomal instability; cell-cycle checkpoint defects in G1,S (radio-resistant DNA synthesis) and G2/M; sensitivity to ionizing radiation, increased chromosomal breakages, telomere end-to-end fusions; DNA repair; subtle, but normal kinetics Other abnormalities: cytoskeletal defects, abnormalities in the plasma membrane, an increased number of lysosomes; high levels of trophic factors needed for growth; defects in intracellular signalling. Nijmegen Breakage Syndrome (NBS) Rara malattia autosomica recessiva descritta inizialmente in pazienti olandesi di origine slava Mutazione fondatrice 657delta5 nel gene NBS1 Frequenza 1/ Frequenza eterozigosi in individui slavi 1/155 (asintomatici) Caratteristiche fenotipiche: Fronte ristretta Viso allungato Mandibola rientrata Microcefalia Orecchie pronunciate 29

30 Cross-talk tra le sindromi della Riparazione del DNA Proteine che sono difettive in sindromi simili, presentano interazioni funzionali. ATM fosforila NBS, difettivo nella Nijmengen Breakage Sindrome ATM fosforila BLM e la fosforilazione di BLM dopo l arresto della replicazione dipende da ATR Link funzionali tra pathway di signalling apparentemente separate che possono convergere tutte verso una unica risposta globale al danno del DNA LESIONI AL DNA ARRESTO DELLA REPLICAZIONE DEL DNA LETALITÀ RIPARAZIONE CHECKPOINT DA DANNO AL DNA MECCANISMI DI TOLLERANZA ALLA LESIONE REVERSIONE EXCISIONE RICOMBINAZIONE OMOLOGA NON OMOLOGA ARRESTO DEL CICLO CELLULARE RICOMBINAZIONE SINTESI OMOLOGA DEL DNA TRANSLESIONE MANTENIMENTO DEI TELOMERI MUTAGENESI STABILITÀ GENETICA 30

31 Risposta SOS Il danno porta alla distruzione proteolitica di un repressore trascrizionale a) Stato non indotto b) Stato indotto Gene lexa Gene RecA Gene lexa Gene RecA Proteina Lex A Repressione della trascrizione dei geni coinvolti in diversi processi di riparazione del DNA Proteina RecA (inattiva) Proteina Lex A Proteina Lex A scissa Nessuna repressione, i geni per la riparazione vengono trascritti Rec A attivo stimola la scissione di Lex A Proteina RecA attivata dal danno al DNA The SOS response is a global response to DNA damage in which the cell cycle is arrested and DNA repair and mutagenesis are induced. RecA protein is stimulated by ssdna 31

32 Riparazione post replicativa mediante Sintesi translesione Quando la polimerasi III s imbatte nella lesione presente sullo stampo, si dissocia dal DNA, al suo posto subentra la DNA polimerasi translesione che prosegue la sintesi attraverso il dimero di timina in modo indipendente dall appaiamento delle basi, e che viene poi risostituita della DNA pol III. Riparazione Post Replicativa mediante Strand exchange Stalling indotto dal danno Gap-formation mediante re-priming Ricombinazione omologa Taglio della giunzione di Holliday Dopo la lesione, la replicazione del DNA può riprendere mediante il re-priming della sintesi del DNA a valle del sito di danno, generando un gap nel filamento fratello che può essere ripristinato attraverso la pathway di ricombinazione omologa. La ricombinazione tra il filamento neosintetizzato nella molecola di DNA contenente il danno e il filamento 32 complementare della molecola di DNA omologa permette al complesso replicativo di superare il danno.

33 Deans & West, DNA interstrand crosslink repair and cancer. Nature Reviews Cancer 11, (July 2011). doi: /nrc3088 Suppression of ICL sensitivity by inhibitionof non-homologous end joining. In wild-type cells, interstrand crosslinks (ICLs) can be repaired by homologous recombination (HR) or non-homologous end joining (NHEJ). The Fanconi anaemia (FA) pathway, however, promotes HR dependent stabilization of the replication fork and DNA repair. In FA cells, double-strand breaks (DSBs) are frequently created that can be repaired by either HR or NHEJ. Because the DSB is one ended, NHEJ does not have a natural substrate to rejoin so these breaks can remain unrepaired (generating chromatid breaks) or may ligate with a DSB in a different chromosome (generating radial chromosomes). Suppression of NHEJ by deleting a component of this pathway or by using DNA-dependent protein kinase catalytic subunit (DNA-PKcs) inhibitors promotes the repair of the DSBs by FA independent pathways of HR (dashed arrow). 33

34 Deans & West, DNA interstrand crosslink repair and cancer. Nature Reviews Cancer 11, (July 2011). doi: /nrc3088 How Interstrand CrossLinks (ICLs) kill tumour cells. Interstrand crosslinks (ICLs) can block the progression of the replication fork by inhibiting the progression of the replisome. ICLs can stall transcription. ICLs may distort the structure of chromatin and prevent the access of DNA-interacting proteins. Tumour cell death can be induced by p53- and FAS ligand-dependent apoptosis (programmed cell death) or p53- independent mitotic catastrophe (death when apoptosis is absent but vital DNA integrity is lost). FAS: recettore di membrana cellulare che, attivato da specifici ligandi, può ortare a morte cllulare programmata 34