+ genomic instability. from Hanahan and Weinberg 2000

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Stefano Antonucci
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1 + genomic instability from Hanahan and Weinberg 2000

2 The The isolation, characterization and functional analysis of a large number of tumor suppressor genes has allowed Kinzler and Vogelstein (Nature 386:761, 1997) to propose a new subdivision of this vast gene family in two categories, namely gatekeepers and caretakers. The definitions here below have been slightly adapted by this author and do not entirely reflect the definition reported in the original publication. Gatekeepers sono i geni di suscettibilità al cancro che controllano la proliferazione cellulare o altre funzioni che, una volta inattivate, offrono un vantaggio selettivo che porta all espansione clonale e alla formazione del tumore. Caretakers funzionano per mantenere l integrità del genoma. Prevengono l instabilità genomica e genetica. Un difetto nei caretakers non offre di per sé un vantaggio selettivo ma piuttosto porta alla mutazione di altri gatekeepers. In realtà i caretakers che possono dare inizio al processo di tumorigenesi forniscono un vantaggio selettivo alla cellula attraverso altre funzioni che non sono direttamente legate alla funzione del riparo (per es. l inattivazione di uno dei geni del riparo responsabili per HNPCC che conferisce resistenza all apoptosi)

3 p53 induce l apoptosi dopo un danno esteso al DNA (per es. Chemioterapia o radioterapia). Quando p53 manca c è resistenza all apoptosi DNA damage p53 Inactive Ser15 Ser20 p53 Active Severe DNA damage Ser20 Ser15 p53 Active Ser46 kinase Ser 46 HIPK2 * Cell cycle arrest DNA repair APOPTOSIS By Oda et al., 2000 (modified) Phosphorylation of p53ser46 is associated with induction of apoptosis

4 p53 controlla l apoptosi attraverso diversi effettori:fa trascrivere Bax e PUMA che controllano la via di bcl-2 e Apaf-1 Smac inibisce gli inibitori delle caspasi effettrici Un effettore importante di p53 è PUMA (p53-upregulated modulator of Apoptosis). E una proteina BH3-only della famiglia di BCL-2 ed è è un potente induttore di apoptosi

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6 Normal and Abnormal Telomere Functioning In Normal or Cancer Cells Lisa Fusetti 6

7 . All inizio del 20 secolo, lo zoologo Theodor Boveri fornì una spiegazione sull associazione tra le mitosi aberranti e i tumori maligni. Yet, on occasion, a particular, incorrect combination of chromosomes would generate a malignant cell endowed with the ability of schrankenloser Vermehrung (unlimited growth), which would pass the defect on to its progeny.

8 Barbara Mc Clintock negli anni notò come i cromosomi frammentati avevano la tendenza a fonders Mentre quelli di lunghezza normale sono più stabili. Nel 1988 i telomeri sono stati sequenziati

9 Limit of Hayflick Una popolazione di cellule fetali umane si divideranno tra 40 e 60 volte per poi entrare in senescenza. Ciascuna mitosi fa accorciare un po i telomeri. Questo in cellule umane rende l ulteriore divisione cellulare impossibile e questo correla con l invecchiamento. Questo meccanismo previene anche l instabilità genomica.

10 Tumorigenic conversion of primary embryo fibroblasts requires at least two cooperating oncogenes HARTMUT LAND, LUIS F. PARADA & ROBERT A. WEINBERG Nature 304, (18 August 1983) La trasfezione di fibroblasti embrionali con l oncogene RAS mutato non li converte in cellule tumorali a meno che non siano stati prima immortalizzati con la telomerasi e un secondo oncogene come myc oppure una proteina virale che lega p53 e Rb non venga espressa.

Telomeres and cancer Weinberg and colleagues hanno dimostrato come siano necessari almeno 4 passaggi per una trasformazione, che si può ottenere in laboratorio facendo esprimere la subunità

11 Telomeres and cancer Weinberg and colleagues hanno dimostrato come siano necessari almeno 4 passaggi per una trasformazione, che si può ottenere in laboratorio facendo esprimere la subunità catalitica della telomerasi, htert, che mantiene la lunghezza dei telomeri insieme all antigene large-t di SV40, LT, che inattiva sia p53 che RB in aggiunta all oncogene RAS (mutato) che permette alle cellule di crescere indefinitivamente in assenza di fattori di crescita. Nature 1999

12 Stem cells have longer telomeres

ü Struttura: TELOMERI Da centinaia a migliaia di copie della sequenza tandem 5 TTAGGGG- 3. Sono in maniera predominante a doppia elica ma terminano con una breve sequenza a singola elica (3 overhang).

13 ü Struttura: TELOMERI Da centinaia a migliaia di copie della sequenza tandem 5 TTAGGGG- 3. Sono in maniera predominante a doppia elica ma terminano con una breve sequenza a singola elica (3 overhang). unghezza: 9-15 kb in humans fino a 100 Kb in mouse ü Funzione: Distinguere le terminazioni del cromosoma rispetto alle rotture del DNA; Stabilzzare i cromosomi Prevenire la perdita di informanzione genetica fornendo un meccaismo per il mantenimento della lunghezza del telomero grazie alla telomerasi Telomerase on off Stem cells, cancer somatic cells (illimited replicative potential) (limited replicative potential)

14 La Telomerasi è fatta di di proteine e RNA

15 Come funziona la telomerasi

16 Come funziona la telomerasi

17 I telomeri sono protetti da proteine per evitare che abbiano inizio i meccanismi di riparo che porterebbero alla fusioneepernd Shelterin complex: legano in maniera sequenza specifica le repeats TTAGGG. (P.Martinez, 2010)

18 Se le estremità del telomero non sono protette si avvia il riparo del DNA NHEJ HR

19 Quando p53 manca, si attiva il riparo del DNA (NHEJ) che causa la fusione e rottura dei cromosomi che può portare al fenomeno chiamato catastrofe mitotica. Se la telomerasi è attiva, si ricostituiscono i telomeri e la cellula prolifera in presenza di anomalie cromosomiche (aneuploidia) 19

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Il riparo del DNA è reso possibile attraverso diversi meccanismi DNA damage Reactive Oxygen Species Ionizing radiations Alkylating agents UV light, cisplatin, Polyc Arom Hydroc Reactive Oxygen

22 Il riparo del DNA è reso possibile attraverso diversi meccanismi DNA damage Reactive Oxygen Species Ionizing radiations Alkylating agents UV light, cisplatin, Polyc Arom Hydroc Reactive Oxygen Species Replication errors Reactive oxygen species Ionizing radiation Alkyl agents, cisplatin Type of lesion Altered base, abasic site Single strand break Intrastrand cross-links Bulky DNA adducts Base mismatch, small insertions and deletions Intrastrand cross-links Double strand breaks DNA repair process Base excision repair BER Nucleotide excision repair NER Mismatch repair MMR Recombinational repair HR, NHEJ

23 Methyl-directed mismatch repair 5 MutS, MutL, ATP ADP+Pi 5 MutH, ATP ADP+Pi CH 3 CH 3 CH 3 CH MutS 3 MutL 1. Mismatch within 1 kb of methylated GATC 2. MutS and MutH bind to mismatched spots along the DNA (except C-C) 3. DNA on both sides of the Mitsmatch runs through MutS:MutL complex CH 3 CH 3 MutS MutH MutH MutL CH 3 CH 3 4. MutH binds to MutL and to GATC 5. Endonuclease of MutH cleaves unmethylated DNA at hemimethylated GATC

24 Microsatellite Instability (tandem repeats of DNA) è un segno di MMR-deficiency e può essere dovuto a mutazioni delle proteine del riparo MSH2-MLH1 = Diagnostic Testing (es. Tumori del colon-retto)

25 Disordini nei XERODERMA PIGMENTOSUM meccanismi di riparazione del DNA

26 Xeroderma Pigmentosum (XP) Malattia ereditaria autosomica recessiva; Estrema fotosensibilità che determina severi e precoci danni a livello della cute e degli occhi; Tumori cutanei ( Epitelioma basocellulare,spinocellulare e melanoma) nei primi 10 anni di vita. Nei pazienti sotto i 20 anni è riportata un incidenza di melanomi e carcinomi rispettivamente 2000 e 4800 volte superiore di quella della popolazione generale!!!

27 NUCLEOTIDE-EXCISION Global-genome NER ( GG-NER ): Rimuove le lesioni nei filamenti trascritti e non trascritti dei geni attivi e non attivi REPAIR ( NER ) 2 sotto-pathways: Transcription-coupled NER ( TC-NER ): Rimuove le lesioni dei filamenti trascritti dei geni attivi Un NER subpathway che controlla le mutazioni in geni attivamnete trascritti. È controllato da 8 diverse proteine che formano gruppi di complementazione

28 DNA damage: DSB: double strand break dovuti a radicali dell ossigeno, ad errori di replicazione o a radiazioni ionizzanti. Riparo: HDR:homology-directed-repair dove una sequenza omologa rappresenta lo stampo per il riparo ed in questo caso sister cromatidi identici sono preferiti ad altre regioni omologhe su altri cromosomi. E un tipo di riparo più preciso. NHEJ (non homologous end joining): in questo caso le porzioni terminali di una rottura sono spesso modificate dall aggiunta o dala delezione di nucleotidi che vengono ligati per restaurare la continuità con legami covalenti del cromosoma che ha subito la rottura. Ambedue i meccanismo quindi ristabiliscono la continuità del cromosoma, tuttavia il secondo lo fa a rischio di sacrificare l integrità della sequenza locale.

29 L Importanza del riparo delle rotture del dna Van Gent et al, 2001

31 Attivazione delle risposte al danno alla doppia elica del DNA

32 Il riparo non homologous end joining determina la giustapposizione di frammenti distanti che vengono uniti insieme con perdita di informazione Il riparo non homologous end joining svolge un ruolo importante nel determinare la fusione dei cromosomi

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