Il microambiente tumorale come bersaglio terapeutico

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1 Il microambiente tumorale come bersaglio terapeutico Area Tematica 2 Sottoprogetto 2.3 Bioterapie dei tumori Sviluppo di protocolli di terapia combinata, inclusi trattamenti integrati di chemioimmunoterapia 1

2 Razionale e Premesse In vivo la crescita tumorale è influenzata in modo determinante dalle cellule del microambiente (fibroblasti, cellule del sistema immunitario innato e adattativo, cellule della rete vascolare e linfatica) e da componenti della matrice extracellulare (citochine, componenti dello stroma) La prova di principio che è possibile controllare la crescita di tumori umani agendo sul microambiente anziché direttamente sulla cellula neoplastica, è rappresentata da un numero crescente di esempi. In particolare: Talidomide nel mieloma Bevacizumab nei tumori del colon Rituximab nel linfoma di Hodgkin classico (CD20-neg) Terapia anti H. pylori nel linfoma MALT dello stomaco Prevenzione dei tumori del colon-retto con farmaci anti-infiammatori (NSAIDs) 2

3 Obbiettivi del Sottoprogetto Identificare nel microamiente tumorale nuovi bersagli per il controllo della crescita neoplastica Convalidare in vivo in modelli animali l attività antitumorale di inibitori/modulatori dei bersagli in studio Verificare in tumori umani l azione antitumorale di composti con attività sul microambiente 3

4 Schema riassuntivo dei bersagli in studio Malorni [Autofagia/xenofagia] Pelicci G. [Gene Rai] Pelicci PG, Amati [nicchia emopoietica] Corti [NGR-TNF, VS-1] Gianni [endotelio] Colombo [SPARC] Tagliabue [serpina, fibulina] Gianni [CD4 + ] Allavena [macrofagi] Anichini [IL-19R] Anichini [IL-19] Allavena [PTX-3] 4

5 INT, Milano Andrea Anichini Bersaglio preclinico Avanzamento lavori Mediatori solubili (IL-19, IL-9, IL-23) prodotti da cellule di melanoma e attivi su fibroblasti tumore-associati (TAF) e cellule immunitarie Valutare l attività immunomodulatoria e proinfiammatoria di citochine prodotte da cellule di melanoma (IL-19,IL-9,IL-23, e altre); Blocco dell attività immunomodulatoria e proinfiammatoria di IL- 19 con anticorpi neutralizzanti IL-19, e con inibitori della via di segnale di IL-19R nei TAF. Gli esperimenti verranno ripetuti con altre citochine espresse dal melanoma. Profilo di espressione genica in fibroblasti normali vs. TAF esposti a IL-19, tramite piattaforma ILLUMINA Bead Station

6 Esperimenti in corso Espressione di IL-19 in-vivo in melanomi primitivi Melan-A/MART-1 IL-19 6

7 INT, Milano Mario Colombo Bersaglio preclinico traslazionale Avanzamento lavori SPARC (secreted protein acidic and rich in cysteine); proteina matricellulare con ruolo chiave nella modulazione del microambiente, nella progressione tumorale e nella formazione di metastasi. Verificare nel carcinoma mammario se anticorpi anti-sparc potenziano l attività antitumorale Isolamento di anticorpi umani anti-sparc E stato isolato un anticorpo monoclonale murino anti-sparc con attività inibitoria 7

8 Tumors from SPARC KO mice lack of the fibrous stroma wt KO Our aim was to create a species specific Ab that given in vivo could reduce the tumor stroma and perhaps facilitate drug influx MP Colombo 8

9 We immunized SPARC KO mice with a SPARC over-expressing tumor cell line and selected Ab able to block SPARC inhibition of wound closure as readout of biological function t0 t48 t72 t96 Our Ab Ig mouse MP Colombo 9

10 INT, Milano Elda Tagliabue Bersaglio preclinico traslazionale Avanzamento lavori Proteine della matrice extracellulare (serpina B5, fibulina-1) Analisi, in modelli animali geneticamente manipolati, della risposta alla chemioterapia in funzione del livello di espressione di componenti del microambiente (serpina B5, fibulina-1) Valore prognostico del profilo di espressione di geni del microambiente in pazienti con tumore della mammella operato; Isolamento di anticorpi monoclonali anti-serpina e anti-fibulina, e valutazione di una loro attività di potenziamento della chemioterapia nel carcinoma mammario Produzione di vettori virali per l espressione di serpinab5 in cellule di carcinoma mammario Produzione e purificazione di serpinab5 ricombinante da utilizzare per la produzione di anticorpi monoclonali Messa a punto di un saggio di Real Time-PCR per la determinazione dei livelli di espressione di serpinab5 nei campioni tumorali fissati 10

11 Produzione di vettori virali per l espressione di serpinab5 in cellule di carcinoma mammario Produzione e purificazione di serpinab5 ricombinante per produzione di anticorpi monoclonali 5 utr bm40 Serpin B5 Messa a punto di un saggio di Real Time-PCR per la valutazione dei livelli di espressione di serpinab5 in campioni PFFE Serpin B5 Vettore virale pcep-pu 9900 bp Vettore di espresione (peptide segnale per la secrezione; tag di 6 Histidine) Core biopsies Infezione di cellule di carcinoma mammario Analisi delle cellule infettate lisato surnatante WT Serpin WTSerpin Trasfezione di cellule eucariote Purificazione con resina Ni-NTA di serpinab5 dai surnatanti di coltura Immunizzazione degli animali RT-PCR relativa Estrazione dell RNA 11

12 IEO, Milano Pier Giuseppe Pelicci, Bruno Amati Bersaglio preclinico traslazionale Avanzamento lavori Nicchia emopoietica (osteoblasti SNO, N-caderina, ß-catenina) Studio dei fattori del microambiente midollare che regolano l equilibrio tra self-renewal e differenziamento delle cellule staminali leucemiche (LSC) Eliminazione del clone leucemico attraverso modifica delle interazioni anti-apoptotiche tra LSC e microambiente (in particolare cellule SNO) Evidenziamento del ruolo della ciclina E1 nella regolazione del selfrenewal in cellule staminali ematopoietiche 12

13 Competitive Bone Marrow transfer Bone Marrow cells X Rays X Rays X Rays WT (competitor) vs cyce1-wt Tg-GFP or cyce1-ko Tg-GFP 1:1 mix cobmt-1 BMMNC transplant cobmt-2 BMMNC transplant cobmt-3 129/C57-GFP+ Test Blood for Chimerism (% GFP+ cells) E1-WT E1-KO P=0, La perdita di ciclina E1 aumenta il potenziale di Self-renewal delle cellule staminali ematopoietiche 13

14 IEO, Milano Giuliana Pelicci Bersaglio preclinico traslazionale Gene Rai espresso da cellule di glioblastoma Studiare in vitro e in vivo le proprietà biologiche delle cellule staminali di glioblastoma, e in particolare il ruolo di Rai su selfrenewal, proliferazione d differenziazione Conferma del ruolo di Rai come possibile bersaglio di composti ad attività anti-glioblastoma 14

15 IEO, Milano Giuliana Pelicci [continuazione] Avanzamento lavori 1) Rai è espressa nel 60% dei GBM esaminati. L espressione di Rai all interno del tumore e disomogenea. Rai è sempre espresso, ad elevati livelli, nelle htnscs isolate. 2) È stato caratterizzato in vitro ed in vivo il comportamento di htnscs isolate da GBM umani, in cui l espressione di Rai è stata spenta stabilmente mediante la tecnica dell RNA interference. 3) htnscs interferite stabilmente per Rai mostrano una ridotta capacita proliferativa ed un importante deficit di migrazione rispetto alle cellule di controllo esprimenti Rai. 4) L inoculo intracranico di cellule staminali tumorali neuronali umane in topi immunosoppressi determina l insorgenza di tumori con le caratteristiche di un glioblastoma. Il silenziamento genico di Rai e in grado di indurre una maggiore sopravvivenza in tutti gli animali sottoposti ad inoculo. 15

16 1 RAI EXPRESSION LEVEL IS VARIABLE IN SAMPLES FROM DIFFERENT PATIENTS RAI IS ALWAYS EXPRESSED IN htnscs ISOLATED FROM HUMAN GBMs 2 htnscs WT htnscs empty vector sirai 64 Lentiviral infection Vinculin IHC anti RAI on human GBMs tissues 10X IB α RAI 52 Interfered htnscs IB α RAI RAI 3 4 RAI SILENCING AFFECTS htnscs GROWTH AND MIGRATION RAI SILENCING IMPAIRES GLIOBLASTOMA FORMATION empty vector sirai a. RAI-silenced htnscs are smaller and grow slower compared with RAI-expressing counterparts empty vector 4X 4X Cell number (log scale) DIV (Days in Vitro) sirai empty vector sirai b. empty vector sirai a. A WT, mock transduced and RAI-interfered htnscs were injected in the caudate nucleus of nude mice. RAI silencing results in delayed mortality due to impaired glioblastoma formation, as shown by (a) MRI analysis and (b) Kaplan Meier survival curve. GFP/Ki67 Colocalization A Homolateral hemisphere B C Contralateral cortex b. WT empty vector sirai 4X t 0 t 7d 4X 0/EGF 0/FGF 0/FGF+EGF B 40X 5X 5X 20X 20X The tumor is widely diffused, infiltrates the ventricles and the ippocampus after the injection of both (A) WT and (B) control htnscs. (C) RAI-interfered htnscs induce a well delineated noninfiltrating tumor. 4X 4X RAI-silenced htnscs show impair migration in both (a) wound-healing and (b) Boyden Chamber assays in response to different attractors C 40X 5X 20X 16

17 IEO, Milano Walter Malorni [ISS, Roma] Bersaglio preclinico traslazionale Autofagia (self-cannibalism) e xenofagia (xeno-cannibalism) cellulare, che rappresentano un importante meccanismo di resistenza delle cellule tumorali alla chemioterapia 1) studio in vitro della suscettibilita apoptotica e delle capacità auto/xenofagiche di cellule isolate da tumori primari e metastatici (carcinomi e melanomi) in condizioni di microambiente sfavorevole; 2) modulazione farmacologica dell autofagia/xenofagia con inibitori della diidrofolato reduttasi (es. pirimetamina) in cellule intrinsecamente resistenti ai chemioterapici; 3) valutazione in topi SCID dell attività dei farmaci testati in vitro: es. pirimetamina in terapia combinata. Messa a punto di protocolli di chemioterapia associata a inibitori della sopravvivenza autofagica Avanzamento lavori Induzione in vitro di autofagia in cellule di melanoma metastatico intrinsecamente resistenti alla chemioterapia e inibizione farmacologica attraverso la pirimetamina. 17

18 18

19 Bersaglio Microambiente tumorale di soft tissue sarcomi (liposarcomi) Humanitas, Milano Paola Allavena Proteina di fase acuta PTX-3; Monociti/macrofagi intra-tumorali Definizione del ruolo di PTX-3 e dei monociti/macrofagi nella crescita dei sarcomi mediante trattamento in vitro e in vivo con il farmaco Trabectedin (potente inibitore della sintesi di PTX-3 e e CCL2, e dotato di attività citotossica nei confronti di monociti/macrofagi, oltre che delle cellule tumorali) traslazionale Avanzamento lavori Valutare in pazienti con sarcoma in trattamento con Trabectedin: L attività del farmaco in liposarcomi. Il suo effetto inibitorio sulla secrezione di mediatori infiammatori espressi nel micro-ambiente. Se i livelli di PTX-3 circolante nei pazienti in terapia con Trabectedin rappresentano un marcatore predittivo di risposta tumorale. I liposarcomi sono molto suscettibili all effetto citotossico di Trabectedin a concentrazioni nel range nanomolare. I liposarcomi producono elevate quantita di diversi mediatori infiammatori il cui ruolo nel micro-ambiente e sotto studio. Tra questi, PTX3 e CCL2 (chemochina attiva sui monociti) sono significativamente ridotti datrabectedin 19

20 Effetto anti-tumorale del farmaco Trabectedin su cellule di liposarcoma umano % di cellule vive h 48h 72h Linee di liposarcoma risultano molto suscettibili a basse dosi farmaco, ma a tempi relativamente lunghi di 48 ore Ctrl 1.2nm 2.5nM 5nM Trabectedin Geni apoptotici upregulati dopo trattamento con Trabectedin % di cellule vive Ctrl 1.2nm 2.5nM 5nM Trabectedin Fold increase FAS TNFRSF10A BCL2A1 BIK CASP10 LRDD NALP1 BBC3 PMAIP1 TNF RELB APAF1 BAK1 BCL2L11 CRADD BCL2 20

21 Trabectedin inibisce la produzione di PTX3 e CCL2 in cellule di liposarcoma, ma non di IL PTX3 Espressione di PTX3 in due distinti liposarcomi umani. Il pattern di positivita puo risultare etereogeneo (Prof. S.Pilotti) ng/ml * * CTR 0,6 1,2 2,5 2.5 CCL2 5.0 IL ng/ml * * ng/ml CTR 0,6 1,2 2,5 0 CTR 0,6 1,2 2,5 Trabectedin (nm) Trabectedin (nm) 21

22 Humanitas, Milano Angelo Corti [HSR, Milano] Bersaglio Endotelio vascolare tumorale preclinico traslazionale Avanzamento lavori Valutazione in vivo nel topo del meccanismo d azione e dell attività antitumorale di composti antiangiogenetici di sintesi originale: vasostatina-1 (frammento N-terminale della cromogranina A) e NGR-TNF (TNF fuso con il peptide CNGRC, espresso dai vasi angiogenici) Studi clinici di fase I/II con NGR-TNF, da solo e in combinazione con chemioterapici o con vasostatina-1 1. E stato messo a punto un metodo per la preparazione di NGR- TNF libero da contaminanti deamidati (P3). L attività dell NGR- TNF/P3 è stata valutata in modelli animali (20 pg sono risultati sufficienti per indurre effetti terapeutici). 2. E stata prodotta la vasostatina-1 ricombinante necessaria per lo studio nei modelli animali (prodotti >50 mg di vasostatina purificata) 22

23 Produzione e caratterizzazione di NGR-TNF/P3 (privo di contaminanti deamidati) RP-HPLC SE-HPLC SDS-PAGE Effetto anti-tumorale di NGR-TNF/P3 da solo e in combinazioone con melphalan Fibrosarcoma di topo WEHI-164 Linfoma di topo RMA 23

24 INT, Milano A. Massimo Gianni Bersaglio traslazionale Cellule del microambiente nel linfoma di Hodgkin (T linfociti, B linfociti) Valutare l attività anti-linfoma indiretta di composti attivi su cellule presenti nel microambiente di HL (linfociti B, linfociti T, endotelio vascolare). In particolare: Anticorpo anti-cd4 (zanolimumab) Anticorpo anti-cd20 (rituximab) Anticorpo anti-cd52 (alemtuzumab) Anti-VEGF (sorafenib) 24

25 INT, Milano A. Massimo Gianni [continuazione] Avanzamento lavori Stesura di un protocollo clinico multicentrico randomizzato che confronta chemioterapia seguira da radioterapia (ABVD-RT) con chemio-immunoterapia con rituximab e senza RT (R-ABVD), nel linfoma di Hodgkin in stadio iniziale; Arruolamento in corso di pazienti con HL candidati a trattamenti di terza linea (fallimento per ricaduta o progressione di una seconda linea) in uno studio monoistitutzionale con impiego di sorafenib; Arruolamento in corso di pazienti con HL, con cellule del microambiente CD52+, in un saggio terapeutico off-label che impiega alemtuzumab; Trattative in corso con Genmab per uno studio clinico di chemioimmunoterapia (chemioterapia di salvataggio associata a zanolimumab) [lo studio approvato da Serono è stato cancellato per restituzione dei diritti di sviluppo dell anticorpo alla Genmab] 25

26 INT, Milano A. Massimo Gianni [continuazione] 26

27 Schema riassuntivo dei bersagli in studio Malorni [Autofagia/xenofagia] Pelicci G. [Gene Rai] Pelicci PG, Amati [nicchia emopoietica] Corti [NGR-TNF, VS-1] Gianni [endotelio] Colombo [SPARC] Tagliabue [serpina, fibulina] Gianni [CD4 + ] Allavena [macrofagi] Anichini [IL-19R] Anichini [IL-19] Allavena [PTX-3] 27