Focus sul Test BRCA. Maria Adelaide Caligo SOD Genetica Molecolare, AOUP

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2 Focus sul Test BRCA Maria Adelaide Caligo SOD Genetica Molecolare, AOUP

3 La Genetica del Carcinoma Ovarico: BRCA1 e BRCA2 LA GENETICA DEL CARCINOMA OVARICO: BRCA1 e BRCA2 BRCA1 PREVALENZA DI VARIANTI PATOGENETICHE GERMINALI NEI GENI BRCA BRCA2 *NELLE PZ CA OVARICO: >10% Rischio di cancro ovarico nelle donne portatrici di mutazione nei geni BRCA1 e BRCA2 * NELLE PAZ CON CA OVARICO SIEROSO DI ALTO GRADO: 17-20% STUDI RETROSPETTIVI EVIDENZIANO CHE LE MUTAZIONI BRCA SONO ASSOCIATE AD UNA MIGLIORE PROGNOSI E SONO PREDITTIVE PER UNA MIGLIORE RISPOSTA ALLA TERAPIA CON I DERIVATI DEL PLATINO 44% 17% 44% non ha storia familiare

4 Il meccanismo di trasmissione ereditaria delle mutazioni germinali del gene BRCA1 e BRCA2 è di tipo autosomico dominante a penetranza incompleta E: gene mutato e: gene normale Le mutazioni somatiche non si ereditano Autosomico: legato a geni localizzati su cromosomi non sessuali quindi la malattia si manifesta sia nei maschi che nelle femmine Dominante: è una malattia genetica che si manifesta quando uno solo dei 2 alleli è mutato Penetranza incompleta: non tutti gli individui portatori del gene mutato sviluppano la malattia

5 Funzione: Essenziali nel preservare la Struttura Cromosomica Coinvolti nella RIPARAZIONE dei danni a doppia elica al DNA Le cellule BRCA-deficienti sono instabili, cioè accumulano mutazioni, che favoriscono la trasformazione neoplastica e la crescita del tumore

6 Funzione: DNA double-strand break repair e.g. ionising radiation Cisplatinum, vincristine NonHomologous EndJoining (Error prone) RAD51 BRCA1 BRCA2 SingleStrandAnnealing (Error prone) Homologous Recombination Error free

7 Test genetico BRCA1: 22 esoni codificanti >5000nt BRCA2: 27 esoni codificanti>10.000nt Non ci sono hot spot di mutazione -80% frameshift o nonsenso -7% splice variant -10% delezioni?unclassified variant -Polimorfismi Pattern di mutazioni estremamente eterogeneo BIC ( elenca più di 1560 diverse mutazioni/polimorfismi per BRCA1 e 1880 per BRCA2 mutazioni PATOGENETICHE determinano perdita e non funzionamento della proteina Il test si basa sul sequenziamento diretto del DNA 98% specificità 98% sensibilità >80% dei laboratori ha adottato NGS

8 Test genetico

9 Le mutazioni BRCA possono essere somatiche o germinali Le mutazioni somatiche possono essere anche germinali Le mutazioni germinali sono sempre anche nel tessuto tumorale del carrier

10 BRCA mutazioni somatiche

11 BRCA mutazioni somatiche: quante? 12/21 (60%) 5/7 (71%)

12 BRCA mutazioni somatiche: Stato dell arte (2018) BRCA somatic mutation in Ovarian Cancer: 2018 State of Art ONCOTARGET (2017), 7:1076

13 BRCA1 e BRCA2 essenziali nel riparo dei dsdna-break attraverso Homology Directed DNA Repair (HDR)

14 Homologous Recombination Deficiency: Exploiting the Fundamental Vulnerability of Ovarian Cancer

15 Classificazione delle Varianti di significato incerto (UV/VUS) Varianti di significato incerto (UV/VUS) Sostituzioni di singoli amminoacidi, piccole delezioni o inserzioni in-frame con un effetto sulla proteina non prevedibile Circa il 2-5% dei test genetici BRCA e il 20-40% dei test MSP portano all identificazione di varianti di significato incerto Lerner-Ellis, Jordan, et al. Expert review of anticancer therapy15.11 (2015):

16 Classificazione delle Varianti di significato incerto (UV/VUS) Evidenze genetiche dirette: Co-segregazione con la malattia Co-occorrenza con mutazioni patogenetiche note Confronto della frequenza allelica in casi e controlli Evidenze genetiche indirette: Predizioni in silico basate sulla posizione e sulla natura del cambio amminoacidico (sift, polyphen, Mutation Taster) Saggi funzionali in vitro Saggi biochimici volti alla caratterizzazione del gene o della proteina Analisi LOH e di metilazione in vivo sul tessuto tumorale

17 Classificazione delle Varianti di significato incerto (UV/VUS) Website for BRCA classification BRCA exchange HGMD UMD (Universal Mutation Database) BIC LOVD ClinVar Website for functional analysis of BRCA Huntsman Cancer Institute (HCI) ex LOVD-IARC BRCA1 Circos LOVD BRCA1/BRCA2

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19 Overview of ENIGMA classification process Class Quantitative Measure: Probability of Pathogenicity Predictive Testing of At- Risk Relatives 5: Pathogenic >0.99 Yes Surveillance for At-Risk Relatives Full high-risk guidelines for variant carriers 4: Likely pathogenic Yes b Full high-risk guidelines for variant carriers 3: Uncertain No b Based on family history & other risk factors 2: Likely not pathogenic or of little clinical significance 1: Not pathogenic or of no clinical significance No b risk factors - treat as no BRCA1/2 pathogenic variant detected for Based on family history & other this disorder <0.001 No b risk factors - treat as no BRCA1/2 pathogenic variant detected for Based on family history & other this disorder disorder Research Testing of Relatives Not indicated Yes Yes Yes Not indicated Table 1: IARC 5-tiered classification system with accompanying recommendations for family management a a Adapted for clarity from original tabular presentation published (Plon et al., 2008) b Recommend continued testing of proband for any additional available testing modalities available for BRCA1/2 e.g. rearrangements.

20 BRCA1 e BRCA2 essenziali nel riparo dei dsdna-break attraverso Homology Directed DNA Repair (HDR) Mutazioni in BRCA1/2 sono presenti in circa il 20% dei ca ovarici Mutazioni in geni coinvolti nello stesso pathway (DSD HR repair) si trovano in circa 30% dei ca ovarici (Clin Cancer Res 22: 3764, 2016) Diversi gruppi hanno sviluppato metodi per misurare la instabilità genomica tumorale e quindi il deficit di HR: - pattern di LOH (BrJ Cancer 107:1776, 2012) - TAI-Telomeric Allelic Imbalance (Cancer Discov 2: 366, 2012) -LST-Large Scale State Transition (Cancer Res 72: 5454, 2012) HDR score si calcola come la somma aritmetica di: LOH (per regioni>15mb)+ TAI(regioni di sbilancio allelico dal subtelomero al centromero) + LST (breakpoint tra regioni sbilanciate >10Mb<3Mb)= Lo score varia da 0-100: se il tumore ha HDR >42 è definito HR-deficiente HRDetect predice il deficit BRCA1/2 basandosi su signature mutazionale-brca specifica (Nat Med 23: , 2017)

21 Modulo per la richiesta del test somatico BRCA dalla sala operatoria Protocollo condiviso tra : - Chirurgia/Oncologia - Anatomia Patologica - Genetica Molecolare

22 Genetica Molecolare: Workflow test genetico Sanger for SNPs and In/Del and MLPA for CNVs NGS Assay: TruSight Tumor Low input Kit Gene panel: BRCA1/2 Sequenziatore: MiSeq Illumina Sequence alignment and variant calling: Variant Studio Illumina Confirmation on both Tumor & Genomic DNAs >5% allele frequency C3, C4, C5 variants

23 Il Percorso Multidisciplinare Pazienti con diagnosi di C.O. non mucinoso e non borderline Mini Consulenza pre-test: Raccolta del consenso informato Test genetico su tessuto tumorale (preferibilmente a fresco) su prelievo ematico Scelte terapeutiche basate sul test Consulenza post-test (se eseguito su tessuto solo per le pz+): risultato test genetico Se la mutazione identificata è germinale il test è proposto ai familiari

24 Modulo di consenso informato

25 1. Conclusioni: test BRCA In quali pazienti? Lo stato mutazionale di BRCA (somatico o germinale) dovrebbe essere valutato in tutte le pazienti con diagnosi di carcinoma ovarico non mucinoso non borderline (linee guida AIOM-SIGU 2015; NCCN guidelines v ) Quando? Meglio alla diagnosi Comunque al completamento dell iter diagnostico per fornire indicazioni utili per le scelte terapeutiche e per l accesso al percorso di consulenza genetica

26 2. Conclusioni: test genetico germline o somatico? Germline Identifica mutazioni costituzionali Viene analizzato DNA da sangue o saliva Il soggetto può essere non affetto Lo scopo è di identificare famiglie con sindromi neoplastiche ereditarie Può essere prescritto dal genetista ma anche dall oncologo, chirurgo etc. E sempre meglio venga offerto nell ambito di un percorso di consulenza genetica pre e post test Evidenzia solo mutazioni germinali Somatico Identifica mutazioni nel tumore (cioè acquisite) Viene fatto sul tessuto tumorale Il paziente è affetto da neoplasia Lo scopo è terapeutico o prognostico Viene prescritto dall oncologo Non sempre viene richiesto in consenso al paziente Evidenzia sia mutazioni somatiche che germinali, ma non è in grado di distinguerle tra loro E più complesso di altri test molecolari in uso nella diagnostica oncologica routinaria

27 3.Conclusioni: l interpretazione del dato -Enorme livello di eterogeneità di potenziali varianti patogenetiche disperse lungo tutta la sequenza codificante dei geni BRCA1 e BRCA2 -Non tutte le varianti BRCA associate ad un alto rischio di sviluppare il tumore sono anche predittive di una risposta alla terapia. -Alcune delle varianti associate ad un basso rischio di sviluppare un tumore ovarico potrebbero ugualmente essere predittive di una risposta alla terapia -possono esserci eventi di inattivazione epigenetica: come valutarli? Questo rende difficile valutare il valore predittivo della particolare variante in relazione alla possibile risposta al trattamento.

28 Acknowledgement S.D. Laboratorio di Genetica Molecolare Collaborators Anatomia Patologica I (Prof. Naccarato) Ostetricia e Ginecologia (Prof. Gadducci) UO Clinica Medica (Dr.ssa Congregati) Grazie per l attenzione!

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30 confirmation on both Tumor & Genomic DNAs FFPE sample 5 slides of 10 µm TruSight Tumor Low input Kit, protocollo Dual Strand 10ng tumor DNA NGS BRCA Assay MiSeq Illumina Variant Studio Illumina + CUSTOM BIOINFORMATIC PIPELINE for sequence alignment and variant calling SNVs & Indel >5% allele frequency C3, C4, C5 variants CNVs Sanger Sequencing MLPA confirmation on Genomic DNA

31 Test BRCA1/BRCA2 SOMATICO Viene eseguito su tessuto tumorale con metodiche di sequenziamento di nuova generazione (NGS). Evidenzia sia mutazioni somatiche che germinali, ma non è in grado di distinguerle tra loro. E possibile capire se una variante rilevata è germinale o somatica analizzando un secondo tessuto del paziente, non tumorale (preferibilmente dna da sangue E più complesso di altri test molecolari in uso nella periferico). diagnostica oncologica routinaria. Infatti esiste un enorme livello di eterogeneità di potenziali varianti patogenetiche disperse lungo tutta la sequenza codificante dei geni BRCA1 e BRCA2 e possono Non tutte le varianti BRCA associate ad un alto esserci eventi di inattivazione epigenetica rischio di sviluppare il tumore sono anche predittive di Questo una risposta rende difficile alla terapia valutare il valore predittivo della particolare variante in relazione alla possibile risposta al trattamento.

32 Materiali e Metodi: Next Generation Sequencing: Analisi dei Dati Analisi primaria Analisi secondaria Analisi terziaria Base calling Alignment Annotazione delle Varianti Filtraggio delle Varianti Minor Allele Frequency < 1% Coverag e > 30 Alt Variant Frequency > 5%

33 Gynecol Oncol Aug;146(2): doi: /j.ygyno Epub 2017 Jun 10. A universal genetic testing initiative for patients with high-grade, non-mucinous epithelial ovarian cancer and the implications for cancer treatment. Gynecol Oncol Apr;145(1): Bednar EM 1, Oakley HD 1, Sun CCdoi: 2, Burke /j.ygyno Epub CC 2, Munsell MF 3, Westin SN 2, Lu 2017 KH 4 Feb. 3. Mainstreaming cancer genetics: A model integrating J Med Genet Mar 13. pii: germline jmedgenet- BRCA testing into doi: /jmedgenet- routine ovarian cancer clinics [Epub ahead of print] Mainstreamed genetic testing for women with ovarian cancer: first-year experience. Rahman B 1, Lanceley A 1, Kristeleit RS 2, Ledermann JA 2, Lockley M 2, McCormack M 2, Mould T 2, Side L 3

34 Interpretation of BRCA genetic variants The mutation spectrum of the BRCA genes is very broad, and the interpretation of the clinical significance of identified variants is not always straightforward. Indeed, variant classification is an important aspect of the BRCA testing process, particularly when considering that quite often clinical testing detects genetic alterations not reported in the scientific literature [26]. Therefore, although no consolidated standards exist for the classification of constitutional BRCA variants, it is important that laboratories use updated classification criteria, and that reports be written up in accordance with good laboratory practice recommendations. The Evidence-based Network for the Interpretation of Germline Mutant Alleles (ENIGMA) has recently developed specific criteria for interpreting the clinical significance, in relation to cancer risk, of constitutional variants of BRCA genes. These are available on the consortium website [27]. Non tutte le varianti BRCA associate ad un alto rischio di sviluppare il tumore sono anche predittive di una risposta alla terapia However, it must be considered that studies in mouse models have

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36 Validità e utilità clinica: problematiche

37 GERMINA LE SOMATICO Analisi dei geni BRCA1 e BRCA2 a tutti i nuovi casi di adenocarcinoma sieroso ad alto grado G3 La tumorigenesi associata a un difetto dei geni BRCA1/BRCA2 può prendere origine non solo da un evento germinale a cui si associano alterazioni somatiche (LOH), ma 1/3 anche dei carcinomi da eventi ovarici che ESCLUSIVAMENTE possiede un difetto dei geni SOMATICI BRCA presenta (BRCAness) mutazioni esclusivamente somatiche This implies that when a variant is identified in tumor DNA, its origin (constituti onal or somatic) must be establishe d by analyzing normal

38 Timeline in the identification of HBOC predisposing genes 85% BRCA1 / BRCA2 mutations: associated with increased risk of breast and ovarian cancer explain up to 15% of breast and ovarian cancer cases A large proportion of breast cancers have no mutations in BRCA1/2 Milano, 21 Settembre 2016 A Rudolph. British Journal of Cancer Advance Online Publication. 12 January 2016 doi: /bjc

39 BRCA1 tumor suppressor protein DNA repair Protein Ubiquitination Regulation of transcription Regulation of cell cycle Repair of double strand DNA breaks / DNA adducts Mediates E2- dependent ubiquitination Modulates gene expression in response to cell stress P21 DNA damage Induces cell cycle arrest at the G1/S, S and G2/M checkpoints Prevention of tumorigenesis Cellular function regulated by BrCa1

40 Risultati 54 varianti differenti: 27 in BRCA1 27 in BRCA2 Gene BRCA1: 5 frameshift 13 missenso 3 di splicing 1 al 5 UTR 5 silenti Classificazione (IARC): 6 patogenetiche 3 VUS 13 benigne 5 non riportate in letteratura

41 Risultati 54 varianti differenti: 27 in BRCA1 27 in BRCA2 Gene BRCA2: 2 frameshift 1 nonsenso 13 missenso 2 splicing 1 al 3 UTR 8 silenti Classificazione (IARC): 1 patogenetica 1 VUS 19 benigne 6 non riportate in letteratura

42 Overview of ENIGMA classification process

43 Parp-inibitori e letalità sintetica

44 Mutations in Homologous Recombination Genes and Outcomes in Ovarian Carcinoma Patients in GOG 218: An NRG Oncology/Gynecologic Oncology Group Study Abstract Purpose: We hypothesized that mutations in homologous recombination repair (HRR) genes beyond BRCA1 and BRCA2 improve outcomes for ovarian carcinoma patients treated with platinum therapy and would impact the relative benefit of adding prolonged bevacizumab. Experimental Design: We sequenced DNA from blood and/or neoplasm from 1,195 women enrolled in GOG-0218, a randomized phase III trial in advanced ovarian carcinoma of bevacizumab added to carboplatin and paclitaxel. Defects in HRR were defined as damaging mutations in 16 genes. Proportional hazards models were used to estimate relative hazards for progression-free survival (PFS) and overall survival (OS). Results: Of 1,195 women with ovarian carcinoma, HRR mutations were identified in 307 (25.7%). Adjusted hazards for progression and death compared with those without mutations were lower for women with non- BRCA HRR mutations [HR = 0.73; 95% confidence interval (CI), ; P = 0.01 for PFS; HR = 0.67; 95% CI, ; P = for OS] and BRCA1 mutations (HR = 0.80; 95% CI, ; P = 0.02 for PFS; HR = 0.74; 95% CI, ; P = 0.01 for OS) and were lowest for BRCA2 mutations (HR = 0.52; 95% CI, ; P < for PFS; HR = 0.36; 95% CI, ; P < for OS). A test of interaction showed no difference in the effect of bevacizumab on PFS between cases with and without mutations. Conclusions: HRR mutations, including non-brca genes, significantly prolong PFS and OS in ovarian carcinoma and should be stratified for in clinical trials. The benefit of adding bevacizumab was not significantly modified by mutation status. Clin Cancer Res; 24(4); AACR. Translational Significance: In the setting of a large clinical trial in primary ovarian cancer patients, we have demonstrated that damaging mutations in a selected set of genes affecting homologous recombination repair beyond BRCA1 and BRCA2 are associated with improved progression-free and overall survival, controlling for known prognostic features, with an outcome similar to that seen for BRCA1 mutations. Cases with BRCA2 mutations had even better outcomes. Given the magnitude of these effects, consideration should be given to assessing homologous recombination repair in the design and analyses of ovarian carcinoma clinical trials. We found mutations in homologous recombination repair genes including BRCA1 and BRCA2 in all histologic subtypes, with only low-grade serous having a significantly lower mutation frequency. Our data do not support restricting access to clinical trials, or to germline genetic testing, on the sole basis of histology. We did not see a differential effect of the impact of bevacizumab on progression-free survival by mutation status.

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46 PROPOSTA di PERCORSO A tutti i pazienti questionario semplice con domande a punteggio(modena score) PRIMA SELEZIONE SOGGETTI CON FAMILIARITA PUNTEGGIO > valore stabilito MINI CGO PRE-TEST Compilazione del questionario e richiesta del test genetico Il pz firma il consenso informato al test ed ha l'occasione di porre eventuali domande di chiarimento in merito. Vengono compilate le richieste per il test e viene fatto il prelievo Medio rischio ASSENZA MUTAZIONI PRELIEVO EMATICO, SCHEDA-QUESTIONARIO CONSENSO INFORMATO INVIARE TUTTO ALLA SOD GENETICA MOLECOLARE AOUP ALTO rischio MUTAZIONE IDENTIFICATA CONSULENZA GENETICA

47 Risultati: Varianti Germinali o Somatiche? Patogenetiche VUS Non riportate in letteratura Alt Variant Frequency: <20%: Somatiche >20%: Germinali

48 PERCHE ESEGUIRE il test nelle pazienti con ca ovarico conoscere il reale rischio e attuare le opportune strategie preventive fornire ai propri familiari informazioni Importanti per la loro valutazione del rischio Impatto sul trattamento della paziente

49 Funzione: Essenziali nel riparare i danni a doppia elica del DNA Le proteine BRCA sono coinvolte nel controllo della ricombinazione omologa (HR) e nel riparo dei danni a doppia elica al DNA (tramite H2AX, RAD51, P53..) BRCA2 interagisce con RAD51 tramite le BRCs repeats, promuovendo il riparo del DNA BRCA2 BRCA1 DNA BRCA1 è richiamata sul DNA da H2AX fosforilata da ATM e ATR che forma dei foci nel sito di danno. H2AX e BRCA1 iniziano il processo di riparo tramite modificazione della struttura della cromatina locale.

50 Overview of ENIGMA classification process BRCA Sequence Variant Confirm HGVS Nomenclature Predicted to lead to a premature termination codon Large deletion Large Duplication All other variants, including: * exonic silent/missense/in-frame ins-del * splice site, other intronic *UTR Clinically Important (CI) residue/s disrupted*; No predicted splicing CI residues disrupted* Lab evidence CI residue/s disrupted* Class 5 Pathogenic Bioinformatic prediction of splicing Review literature Seek/review additional clinical evidence: segregation, pathology, co-occurrence Check against multiple datasets: * Frequency (1000 g ++, other) * Multifactorial likelihood posterior * Curated Splicing dataset * Clinically important domains * List of classified missense (pathogenic/not pathogenic) * Prior probability of pathogenicity * Founder variants Assess against criteria and assign class Class 1 or 5 >> public databases Possible intermediate? >>>> Further research Class 2,3,4 Prioritise collection of further information

51 Romero I et al. Endocrinology 2012; 153: Sottotipi Carcinoma Ovarico: mutazioni

52 Sottotipi Carcinoma Ovarico: mutazioni