Forense, UniversitàdegliStudidi Pavia

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1 N.S.P. Aspetti Analitici ed Interpretativi Luca Morini, Angelo Groppi, Claudia Vignali Dipartimentodi SanitàPubblica, MedicinaSperimentalee Forense, UniversitàdegliStudidi Pavia

2 CAMPIONI BIOLOGICI Sangue (Siero/plasma/sangue intero) Urina Capelli

3 NPS OGGETTO DI STUDIO Cannabinoidisintetici Catinonisintetici Fenetilamine DerivatidellePiperazine DBZDs(DesignerBenzodiazepines) DerivatidelFentanil

4 TECNICHE ANALITICHE Immunochimica/imm munoenzimatica GC-MS GC-MS/M LC-MS LC-MS/MSS LC-HRMS

5 TECNICHE ANALITICHE IMMUNOCHIMICA/IMMUNOENZIMATICA Userfriendly Applicabile alle principali matrici biologiche Risposta rapida Utile solo come screening Cross-reactivityancora da verificare Pochi kit disponibili ad oggi sul mercato

6 IMMUNOASSAY: CANNABINOIDI SINTETICI Metodo immunenzimatico HEIA per la determinazione di cannabinoidi sintetici inurina. Semplice e rapido 400analisi perora Permette un analisi semiquantitativa Forensic Sci Int Aug;241: doi: /j.forsciint Epub 2014 Apr 24. Evaluation of a homogenous enzyme immunoassay for the detection of synthetic cannabinoids in urine. Barnes AJ1, Young S1, Spinelli E2, Martin TM3, Klette KL3, Huestis MA4.

7 IMMUNOASSAY: CANNABINOIDI SINTETICI Le strutture chimiche, così come le caratteristiche chimico-fisiche, deicannabinoidi sintetici sonoanche molto diverse tradiloro Non è stata osservata cross-reactivity per tutte le sostanze analizzate Per risposte con valenza medico-legale e/o amministrativa è necessaria un analisi diconferma con altra metodica Forensic Sci Int Aug;241: doi: /j.forsciint Epub 2014 Apr 24. Evaluation of a homogenous enzyme immunoassay for the detection of synthetic cannabinoids in urine. Barnes AJ1, Young S1, Spinelli E2, Martin TM3, Klette KL3, Huestis MA4.

8 TECNICHE ANALITICHE GC-MS, GC-MS/MS, LC-MS, LC-MS/MS Utile come analisi di conferma Applicabile alle principali matrici biologiche Alta sensibilità e specificità Fasi preanalitica ed analitica complesse Analisi costose Analisi mirate Necessità di standard analitici

9 TECNICHE ANALITICHE LC-HRMS Utile come analisi di conferma Applicabile alle principali matrici biologiche Alta sensibilità e specificità Analisi generica mediante massa esatta

10 LC-HRMS TECNICHE ANALITICHE Fasi preanalitica ed analitica complesse Analisi costose Necessità di standard analitici Software dedicato per l elaborazione di dati

11 STUDIOINSILICO Studio predittivo del metabolismo di xenobiotici attraverso l uso di softwaresdedicati MetaSite è attualmente il software maggiormente utilizzato (quantomeno in ambito tossicologico) per la valutazione del metabolismo «insilico»

12 MATRICE EMATICA: SENSIBILITÀ CANNABINOIDI SINTETICI Substances Range (ng/ml) Mean (ng/ml) Median (ng/ml) AM JWH JWH JWH JWH JWH JWH RCS UR XLR

13 MATRICE EMATICA: SENSIBILITÀ CATINONI SINTETICI Range disensibilità ampio LOD:0.5-50ng/mL LOQ:1-100ng/mL Di norma identificati nel sangue in concentrazioni superiori a 50 ng/ml

14 MATRICE EMATICA: SENSIBILITÀ Range moltoampio FENETILAMINE 4-FAidentificata nel sangue ad unaconcentrazione pari a90ng/ml 25H-NBOMe identificato inferiorea0.5ng/ml nel sangue ad una concentrazione

15 MATRICE EMATICA: SENSIBILITÀ DERIVATI DELLE PIPERAZINE Pochidati sui campioni reali Si sono riscontrati casi di positività nel siero a concentrazione superioria50ng/ml

16 MATRICE EMATICA: SENSIBILITÀ DESIGNER BDZ Le concentrazioni non si discostano significativamente da quelle riscontrate pericomposti benzodiazepinici tradizionali

17 MATRICE EMATICA: SENSIBILITÀ DERIVVATI DEL FENTANIL Casi di intossicazione letale da acetylfentanyl con valori ematici superioria200ng/ml Un caso di intossicazione etale da butyrfentanyl con valori ematici pariacirca 50ng/mL Ilsufentanyl viene generalmente somministrato a dosipari a5µg

18 MATRICE URINARIA Difficoltànell identificare la molecola immodificata Metabolismo delle NPS ancora oggetto di studio Problematiche analitico-interpretative nella valutazione dei metaboliti urinari

19 PRINCIPALI VIE METABOLICHE Fase I: Idrolisi Anal Bioanal Chem May;408(13): doi: /s Epub 2016 Mar 2. Metabolites of synthetic cannabinoids in hair--proof of consumption or false friends for interpretation? 1,2 1,

20 PRINCIPALI VIE METABOLICHE Fase I: Ossidazione (Ossidrilazione) Anal Bioanal Chem May;408(13): doi: /s Epub 2016 Mar 2. Metabolites of synthetic cannabinoids in hair--proof of consumption or false friends for interpretation? 1,2 1,

21 PRINCIPALI VIE METABOLICHE Fase I: N e/o O dealchilazione Forensic Toxicol. 2016;34: Epub 2016 Mar 28. Strategies to distinguish new synthetic cannabinoid FUBIMINA(BIM-2201) intake from its isomerthj- DiaoX 1,Scheidweiler KB 1,WohlfarthA 2,Zhu M 3,Pang S 4,HuestisMA 2201: metabolism of FUBIMINA in human hepatocytes. 1

22 PRINCIPALI VIE METABOLICHE Fase II: glucuronazione(coniugazione) Forensic Toxicol. 2016;34: Epub 2016 Mar 28. Strategies to distinguish new synthetic cannabinoid FUBIMINA(BIM-2201) intake from its isomerthj- DiaoX 1,Scheidweiler KB 1,WohlfarthA 2,Zhu M 3,Pang S 4,HuestisMA 2201: metabolism of FUBIMINA in human hepatocytes. 1

23 CATINONI SINTETICI Principali vie metaboliche N dealchilazione Riduzione del chetone ad ossidrile Ossidrilazione

24 CATINONI SINTETICI Principali vie metaboliche N dealchilazione Riduzione del chetone ad ossidrile Ossidrilazione

25 Principali vie metaboliche FENETILAMINE Ossidrilazione sul gruppo aminico O dealchilazione sul metossile in posizione 2

26 FENETILAM Principali vie metaboliche Demetilazione + ossidrilazione N dealchilazione MINE (NBOMES) 25C-NBOMe

27 DERIVATI DELLE PIPERAZINE Principali vie metaboliche Ossidazione sull anello aromatico N dealchilazione

28 Principali vie metaboliche Riduzione del nitrogruppo N dealchilazione Ossidrilazione DBZDS J Mass Spectrom Nov;51(11): doi: /jms Characterization and in vitro phase I microsomal metabolism of designer benzodiazepines- fonazepam, 3-hydroxyphenazepam, metizolamand an update comprising adinazolam, cloniprazepam, nitrazolam.

29 DERIVATI DEL FENTANIL Principali vie metaboliche N dealchilazione Ossidrilazione sull anello aromatico Anal Bioanal Chem Jan;402(3): doi: /s Epub 2011 Nov 8. Qualitative studies on the metabolism and the toxicological detection of the fentanyl-derived designer drugs 3- methylfentanyl and isofentanyl in rats using liquid chromatography-linear ion trap-mass spectrometry(lc- MS(n)).

30 MATRICE CHERATINICA Il capello non è di norma utile per la valutazione delle somministrazioni/intossicazioni nell acuto Può rivestire un ruolo fondamentale nell interpretazione dei risultati quali-quantitativii ottenuti su sangue e urina

31 METABOLISMO SU CAPELLO La contaminazione esterna, in particolare di sostanze inalate attraverso il fumo, deve essere attentamente valutata Anal Bioanal Chem May;408(13): doi: /s Epub 2016 Mar 2. Metabolites of synthetic cannabinoids in hair--proof of consumption or false friends for interpretation? Franz F 1,2,AngererV 1,2,Hermanns-Clausen M 3,AuwärterV 1,Moosmann B 4.

32 CASO REALE Un giovane (16 anni), in centro storico di un paese. piena notte, fu visto gettarsi in torrente nel Un testimone dell evento affermò che il ragazzo, nei momenti subito precedenti al folle gesto, sera molto agitato e confuso.

33 NBOMe NBOMe: Fenetilamine del gruppo 2-C(2-metossifenil)- metil 25C-NBOMe 25H-NBOMe Fino alla fine del 2015 sono state identificate 19 sostanze appartenenti alla classe degli «NBOMe» 15 sono già apparse sul territorio italiano a tutto il 2015

34 ANALISI GC-MS DEL MATERIALE IN SEQUESTRO Immersione del campione (cartone) in 0.5 mldi metanolo Sonicazione per cinque minuti 50 µl della soluzione evaporati a secchezza e successivamente derivatizzati in 100 µl di una soluzione di anidride pentafluoropropionica ecloroformioper 1h a60 C Evaporazione della soluzione derivatizzante e ripresa in 50 µl di etilacetato Iniezione in GC-MS (modalità Full Scan amu) Ioni maggiormente specifici: 481 pentafluoroamide del frammento pentafluoroamide del frammento C-NBOMe 25H-NBOMe

35 ANALISI LC-MS/MS DI SANGUE E URINA Aggiunta di tampone fosfato( (ph 6.0) a1mldi sangue (/urina) Estrazione su colonne SPE (Bond Elut Certify) Eluizione con 2 ml (8:2)al 2% di NH3 di soluzione diclorometano-isopropanolo Evaporazione della soluzione e ripresa in 300 µl di fase mobile Iniezione positiva) in LC-MS/MS (modalità MRM polarità Eluizione in gradiente (fase mobile composta da A: acido formico 0.1%; B: acetonitrile; Flusso 200 µl/min)

36 ANALISI LC-MS/MS DI SANGUE E URINA Transizioni ioniche monitorate per ciascuna molecola oggetto di indagine MOLECOLA Q1 Q3 DP EP CE CXP 25C-NBOMe 335,9 120, C-NBOMe 335,9 91, H-NBOMe 302,1 121, H-NBOMe 302,1 91, B-NBOMe 382,0 121, B-NBOMe 382,0 91, I-NBOMe 428,2 121, I-NBOMe 428,2 91, D-NBOMe 316,1 121, D-NBOMe 316,1 179, E-NBOMe (SI) 330,2 121, E-NBOMe (SI) 330,2 193,

37 RISULTATI LC-MS/MS SU SANGUE 25C-NBOMe m/z 335.9/ C-NBOMe m/z 335.9/ H-NBOMe m/z 302.1/ H-NBOMe m/z 302.1/91.5

38 RISULTATI LC C-MS/MS - NBOMe Blotter Matrice Sangue centrale Sangueperiferico Urina 25C-NBOMe Positivo 1,43ng/mL 25H-NBOMe Positivo 0,13ng/mL 2,80 ng/ml 0,29ng/mL 0,94 ng/ml 0,14ng/mL

39 ANALISI TH HC E THC-COOH Nei liquidi biologici è stata identificata anche la presenza di THC e THC-COOH Analisi GC-MS e LC-MS/MSS THC Sangue centrale: 9,9 ng/ml Sangue periferico: 15,5 ng/ml Urina non idrolizzata: Negativo Urina idrolizzata: Negativo THC-COOH Sangue centrale: 8,5 ng/ml Sangue periferico: 56,0 ng/ml Urina non idrolizzata: 9,5 ng/ml Urina idrolizzata: 43,0 ng/ml

40 CASISTICAA CAV PAVIA Sintesi dei dati clinici e analitico-tossicologicintossicazione da 25-NBOMe identificati initaliadal CAV di Pavia di alcuni degli 11 casi di tra : SESSO, ETÀ F, 28 SOSTANZA DICHIARATA Amfetamina, ketamina M, 17 Alcol, marijuana M, 24 LSD, alcool M, 18 LSD e sostanza non nota SINTOMI Agitazione psicomotoria, convulsioni rabdomiolisi ricovero in rianimazione per giorni coma convulsioni ipertermia e acidosi metabolica ricovero in rianimazione per giorni Delirio gettatosi da un muro ricovero in rianimazione per giorni Stato di agitazione psico-motoria 25I-NBOMe, 2-CI (LC-MS delirio su urina) Grave stato di agitazione psico- M, 18 Nessuna motoria tentativi di gettarsi sotto le auto sopraggiungenti ANALISI TOX: NBOME 25I-NBOMe, 2-CI (LC-MS su urina) 25I-NBOMe, 2-CI (LC-MS su urina) 25I-NBOMe, 2-CI (LC-MS suurinae sangue) 25I-NBOMe, 2-CI (LC-MS su urina) ANALISITOX: ALTRO Ketamina, norketamina, MDMA/MDA THC, THC-COOH THC, THC-COOH THC, THC-COOH THC, THC-COOH M, 18 LSD Grave stato di agitazione psicomotoria gesti autolesivi 25B-NBOMe (LC-MS su urina) THC, THC-COOH M, 26 Mezzo «trip» Agitazione, confusione aggressività con gesti autolesivi 25I-NBOMe(LC-MS su urina) /

41 CASO REALE (CAPELLI E SANGUE) Soggetto deceduto dopo due giorni di ricovero presso una clinica Noto abusatore di catinoni sintetici Capelli Sangue