Determinazione rapida di residui di Glifosate ed AMPA nelle acque mediante derivatizzazione e determinazione on-line SPE-HPLC
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- Ortensia Rosati
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1 Determinazione rapida di residui di Glifosate ed AMPA nelle acque mediante derivatizzazione e determinazione on-line SPE-HPLC M. Volante, R. Fumagalli ARPA Lombardia - Dip. Lecco A. Fontana, L. De Angelis - Univ. Milano - Dip. Sc. Farmacologiche I. Castelnuovo, A. Pozzi Univ. Insubria Dip. Chimica
2 Parleremo di. Perché AMPA e Glifosate Approccio all analisi dei loro residui La derivatizzazione mediante FMOC L analisi diretta HPLC dei derivati FMOC L applicazione del sistema SPARK Prestazioni ottenute dal metodo On-line
3 Determinazione dei residui dei pesticidi nelle acque potabili - superficiali Più di principi attivi appartenenti a classi chimiche diverse autorizzati potenzialmente ritrovabili Proprietà chimiche e comportamenti analitici molto differenti: richiedono più strumentazioni e più metodi multiresiduali Necessità di stabilire priorità nelle molecole da tenere sotto controllo Le priorità sono definite a partire dall intensità di impiego, la tossicità, la persistenza nell ambiente
4 Glifosate ed AMPA Il Glifosate ed il suo metabolita AMPA (acido amino-metil-fosfonico) per la grande quantità di formulati che viene venduta ed utilizzata è indubbiamente in cima a tutte le liste di priorità. La sua bassa tossicità ne favorisce un larghissimo impiego come diserbante
5 Glifosate ed AMPA L alta solubilità in acqua rende queste molecole difficilmente analizzabili con i comuni metodi multiresiduo gascromatografici o HPLC Sono disponibili metodi dedicati con complessi step preparativi per la purificazione del campione In passato raramente analizzati: pochi i dati attualmente a disposizione
6 Glifosate ed AMPA Un èquipe francese (Le Fur, Analusis, 2000, 28, ) ha messo a punto una determinazione diretta HPLC su campione acquoso previa derivatizzazione con FMOC e rivelazione fluorimetria La sensibilità del metodo può essere implementata mediante estrazione SPE dei derivati fluorescenti Gly-FMOC e AMPA-FMOC e/o sua determinazione mediante LC-MS sfruttando gli ioni ( altamente selettivi!) del derivato stesso
7 Ns. determinazione diretta FMOC / HPLC 3 ml di campione in vial da ml Aggiunta di 400 ml di tampone borato (standard commerciale) ph 10 Aggiunta di 500 ml di FMOC 0,5 mm in acetonitrile 30 minuti di reazione a temperatura ambiente Stop reazione con 2,5 ml di acido o-fosforico 0,2% v/v
8 Ns. determinazione diretta FMOC / HPLC La determinazione diretta per iniezione (200 ml!) dei derivati in HPLC senza preconcentrazione comporta severe limitazioni di applicazione in prossimità dei limiti di legge (0,1 mg/l) Presenza di un interferente sovrapposto al picco dell AMPA Allargamento dei picchi, linea di base alterata dal residuo idrolizzato del FMOC in alte concentrazioni
9 Ns. determinazione diretta FMOC / HPLC Esempio di determinazione HPLC senza preconcentrazione (l eccitazione = 265 nm, l emissione = 300 nm) Colonna: Spherisorb Amino 250 x 4.6 mm o equivalente Eluente: Acetonitrile - Ac.fosforico 0,2% (80-20), 2 ml/min Rimozione eccesso FMOC-OH con Diclorometano!
10 Ns. determinazione diretta On-Line FMOC / HPLC La fase estrattiva di preconcentrazione dei FMOC derivati può essere effettuata mediante tecnica SPE con adeguata fase (C18?, PLRP?) Questo stadio può essere convenientemente standardizzato e velocizzato mediante un estrattore SPE on-line interfacciato con il sistema HPLC
11 Ns. determinazione diretta On-Line FMOC / HPLC Cartucce SPE Certify II dedicate a AMPA e Glifosate Solvatazione con 2 ml di acido formico 0,05% Equilibrazione con 5 ml di isopropanolo Caricamento sulla cartuccia di 200 ml di campione Eluizione direttamente in colonna con la fase mobile dell HPLC Fine eluizione dopo 10 secondi per evitare il grosso del residuo idrolizzato FMOC-OH e minimizzare il picco in testa al cromatogramma Pulizia cartuccia con Acetonitrile-Ac.Fosforico 0,2% 75-25
12 Programmazione SPARK Symbiosis Conditions Events Timed Events Parameters Step 1 Exchange Step 2 Solvatation Step 2 Solvatation Step 3 Equilibration Step 4 Flush Step 5 Load Sample Step 6 Wash Step 7 Elute Step 8 Purge System Step 9 Move Cartridge ACE exchange completed HPD1 Syr Ready ACE exchange completed HPD1 Syr Ready ACE exchange completed HPD1 Syr Ready ACE exchange completed HPD1 Syr Ready ACE exchange completed HPD1 Syr Ready ACE exchange completed HPD1 Syr Ready ACE exchange completed HPD1 Syr Ready ACE exchange completed HPD1 Syr Ready ACE exchange completed HPD1 Syr Ready ACE Cart Exch Left ACE Clamp valve left: [1-2] HPD to Cart ridge HPD1 Pump 1 : Aspirate: 0,05% Formic Acid Dispense: Out Volume: 2 ml Asp. Flow: 10 ml/min Disp. Flow: 5 ml/ min. HPD1 Pump 1 : HPD1 Pump 1 : HPD1 Pump 1 : ACE Move Cartr Left ACE ACE AUX 1 : ACE ACE AUX 1 : ACE ACE AUX 3 : ACE ACE AUX 3 : ACE Clamp valve Left: ACE Clamp valve Left: Aspirate: Isopropilic alcohol Dispense: Out Volume: 5 ml Asp. Flow: 10 ml/min Disp. Flow: 5 m/min. (Impostare volume campione fisso pari a 200 ul) Aspirate: Isopropilic alcohol Dispense: Out Volume: 2 ml Asp. Flow: 10 ml/min Disp. Flow: 2.5 m/min. 01 :00 : 600 PUMP On 01 :01 : 600 PUMP Off 01 :00 : 2475 Flu On 01 :01 : 2475 Flu Off 01 :00 : Pump to Cart to [6-1] 01 :30 : HPD to Cart to [1-2] Aspirate: SSM2 Dispense: OUT SSM2 : 75ACN/25H3PO4 Volume: 25 ml Asp. Flow: 10 ml/min Disp. Flow: 5 m/min. To Tray
13 Ns. determ. diretta On-Line FMOC / HPLC Esempio di determinazione HPLC con preconcentrazione (l eccitazione = 265 nm, l emissione = 300 nm) su SPARK Symbiosis Colonna: Spherisorb Amino 250 x 4.6 mm o equivalente Eluente: Acetonitrile Ac.fosforico 0,2% (80-20), 2 ml/min.
14 Area Ns. determinazione diretta On-Line FMOC / HPLC: linearità AMPA LINEARITA' AMPA y = x R 2 = 0, ,5 1 1,5 2 2,5 ug/l
15 Area Ns. determinazione diretta On-Line FMOC / HPLC: linearità Glifosate Linearità Glifosate y = 25292x - 252,86 R 2 = 0, ,5 1 1,5 2 2,5 ug/l
16 Ns. determinazione diretta on-line FMOC / HPLC: ripetibilità AMPA e Glifosate Ripetibilità (CV%) su matrice acqua minerale AMPA 1 mg/l: 4,8% AMPA 0,1 mg/l: 2,0% Glifosate 1 mg/l: 1,8% Glifosate 0,1 mg/l: 1,5%
17 Ns. determinaz. diretta on-line FMOC / HPLC: confronto con lab. di riferimento (ARPA Dip. Milano) valori in mg/l Campione AMPA - On-line SPE AMPA - Lab Riferimento FA 0506 < 0,1 0,2 FL ,8 1,5 FB ,4 0,6 FM ,7 0,5 FV 0506 < 0,1 < 0,1 FP ,1 < 0,1 FG 0506 < 0,1 < 0,1 FC ,8 1,2 FR ,3 2,1 FA ,2 0,3 FL ,7 3,7 FB ,4 1,5 FM ,9 1,6 FV ,2 < 0,1 FP ,2 0,2 FG ,1 < 0,1 FC ,3 1,3 FR ,4 3,0
18 Contaminazione acque uso umano
19 Contaminazione acque superficiali
20 Per concludere. L applicazione di un sistema on-line-hplc all analisi di Glifosate e AMPA velocizza i tempi e garantisce buona ripetibilità; Automazione di una analisi dedicata, che si va ad aggiungere alle classiche multiresiduo, lavorando in parallelo ; Possibilità di avere dati in tempo reale relativi a principi attivi di alta priorità.
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