LE COLTURE CELLULARI 1

Transcript

1 LE COLTURE CELLULARI 1

2 Sperimentazione preclinica (10 anni) IN VITRO: esperimenti su colture cellulari EX VIVO: esperimenti su cellule IN VIVO: esperimenti su animali da laboratorio 2

3 Sperimentazione preclinica in vitro: vantaggi e svantaggi delle colture cellulari Sistemi semplificati e altamente riproducibili Consentono l analisi di meccanismi cellulari e molecolari Controllo ambientale Economicità e rapidità di risposta Disponibilità Sistemi semplificati rispetto ad un organismo integrato Condizioni di esposizione alle sostanze diverse da quelle in vivo Difficoltà di correlare le concentrazioni in vitro con quelle in vivo Le sostanze somministrate possono interagire con il terreno di coltura 3

4 Applicazione delle colture cellulari Studio di processi intracellulari (sintesi proteica e meccanismi di traduzione dei segnali) Studio di citotossicità Studio del meccanismo di azione dei farmaci Studio dei meccanismi di interazione cellula-cellula Studio di anomalie genetiche (analisi del cariotipo) Biologia molecolare (mappature, transfezioni, analisi di mutanti, proteine ricombinanti, anticorpi monoclonali) Studio di processi infettivi virali Caratterizzazione di tumori In campo industriale: studio di effetti farmacologici e tossici di farmaci 4

5 Colture primarie 5

6 Colture primarie VANTAGGI Mantengono le caratteristiche delle cellule in vivo SVANTAGGI numero finito di divisioni (cicli) senescenza popolazione eterogenea isolamento complesso 6

7 Colture secondarie: 1. le cellule discendono da colture primarie trasformate o indotte mediante agenti chimici, fisici o biologici 2. le cellule discendono direttamente dal tessuto di origine: una volta consumato il terreno di coltura si deve provvedere ad una subcoltura in nuovo recipiente con terreno fresco Fedeltà del cariotipo VANTAGGI Presentano più cicli cellulari rispetto alle colture primarie SVANTAGGI Possono differenziarsi in altri tipi cellulari 7

8 Linee cellulari: subcoltura Linee cellulari a vita finita Numero limitato di cicli in coltura Inibizione da contatto Forte dipendenza da siero e fattori di crescita Linee cellulari continue (trasformate) Originano da mutazioni di colture primarie Si possono ottenere dai tumori Poca dipendenza da siero e fattori di crescita Linee cellulari clonali Derivano da una singola cellula (omogenee) 8

9 Trasformazione in linea cellulare continua - trattamento con cancerogeni - esposizione a virus - mutazioni spontanee Cellule trasformate Cellule immortalizzate - perdono la capacità di regolare la crescita: crescono continuamente e quindi hanno durata di vita infinita - perdono alcune caratteristiche che hanno in vivo (mancata espressione di certi geni) -richiedono meno siero per la crescita -hanno tempo di raddoppiamento più breve 9

10 1) Coltura primaria: tempo di crescita lento 2) Linea cellulare primaria: maggiore velocità di crescita 3) Linea cellulare secondaria: tempi di crescita progressivamente più lunghi (sino alla morte) 4) Linea cellulare stabilizzata (immortalizzata) 10

11 1. European Collection of Cell Culture AmericanTissueCultureCentre (USA) National Cell Culture Center (USA) German Collection of Microorganism and Cell Culture IZS Centro Substrati Cellulari IST Servizio Biotecnologie 11

12 12

13 Isolation date: 1957 The CHO-K1 cell line was derived as a subclone from the parental CHO cell line initiated from a biopsy of an ovary of an adult Chinese hamster by T. T. Puck in The cells require proline in the medium for growth. ATCC complete growth medium: The base medium for this cell line is ATCC-formulated F-12K Medium, Catalog No To make the complete growth medium, add the following components to the base medium: fetal bovine serum to a final concentration of 10%. Temperature: 37.0 C 13

14 Remove and discard culture medium. Briefly rinse the cell layer with 0.25% (w/v) Trypsin mm EDTA solution to remove all traces of serum which contains trypsin inhibitor. Add 2.0 to 3.0 ml of Trypsin-EDTA solution to flask and observe cells under an inverted microscope until cell layer is dispersed (usually within 5 to 15 minutes). Note: To avoid clumping do not agitate the cells by hitting or shaking the flask while waiting for the cells to detach. Cells that are difficult to detach may be placed at 37 C to facilitate dispersal. Add 6.0 to 8.0 ml of complete growth medium and aspirate cells by gently pipetting. Add appropriate aliquots of the cell suspension to new culture vessels. Incubate cultures at 37 C. 14

15 1952: George Gey stabilizzò in coltura la prima linea cellulare tumorale: Carcinoma della cervice uterina Linea cellulare HeLa derivata da donna di 31 anni, Henrietta Lack Il terreno di coltura era fatto di sangue di pollo, sali speciali e placente. 15

16 Crescita di una linea cellulare in coltura Non tutte le cellule si dividono Alcune cellule muoiono Consumo di sostanze nutritive Accumulo di cataboliti tossici nel terreno Limitazione di spazio (piastra/fiasca) 16

17 LA DENSITA RAGGIUNTA A PLATEAU DALLE CELLULE TRASFORMATE E PIU ALTA DI QUELLA DELLE CELLULE NORMALI DEVONO ESSERE DILUITE CON TERRENO FRESCO IN NUOVE PIASTRE/FIASCHE ALTRIMENTI MUOIONO 17

18 CAMERA DI BURKER 18

19 COME E DOVE SI LAVORA CON LE LINEE CELLULARI: EQUIPAGGIAMENTO ESSENZIALE 19

20 CAPPA A FLUSSO LAMINARE INCUBATORE CENTRIFUGA MICROSCOPIO INVERTITO MATERIALE per COLTURE CELLULARI TERRENI DI COLTURA EQUIPAGGIAMENTO PER CRIOCONSERVAZIONE 20

21 LA CAPPA A FLUSSO LAMINARE FORNISCE UN LUOGO DI LAVORO PULITO PER LE COLTURE CELLULARI; UNA PROTEZIONE DAGLI AEROSOL PER L'OPERATORE. LA PROTEZIONE È ASSICURATA DALL USO DI FILTRI DI HEPA (ARIA POLVERIZZATA DI ALTA EFFICIENZA). RAGGI UV ACCESI PRIMA E DOPO IL LAVORO PER STERILIZZARE LA SUPERFICIE IL LIVELLO DI CONTENIMENTO DEL FILTRO (QUINDI DI PROTEZIONE) VARIA A SECONDA DEL CODICE DI CATEGORIA 21 DELLA CAPPA.

22 L INCUBATORE AMBIENTE RIGOROSAMENTE CONTROLLATO PER LO SVILUPPO DELLE COLTURE CELLULARI. TEMPERATURA (37 C) UMIDITA (95%) LIVELLI DI CO 2 (5-10%). PER EVITARE CONTAMINAZIONI DELL AMBIENTE INTERNO: INCUBATORI RIVESTITI DI RAME (ATTIVITÀ ANTIMICROBICA DEL RAME); LIQUIDI SPECIFICI DI TRATTAMENTO NELLA VASCA DELL ACQUA OCCORRE UNA PULIZIA REGOLARE 22

23 LA CENTRIFUGA PER LORO STESSA NATURA LE CENTRIFUGHE PRODUCONO GLI AEROSOL PER CUI È NECESSARIO MINIMIZZARE QUESTO RISCHIO PER L OPERATORE. COPERCHIO SIGILLATO CON PARTE TRASPARENTE IN MODO DA POTERE OSSERVARE LO STATO DEL CARICO SENZA APRIRE IL COPERCHIO. EQUILIBRARE LE PROVETTE CON ATTENZIONE. LE CELLULE SI CENTRIFUGANO A RPM PER 5 MINUTI. PER TOGLIERE RESIDUI CELLULARI A VELOCITÀ + BASSA (800 RPM). 23

24 LE COLTURE CELLULARI VENGONO VISUALIZZATE CON MICROSCOPIO OTTICO INVERTITO: La luce proviene dall alto e l obiettivo è posizionato in basso. Consente di osservare cellule poste in una piastra, cosa impossibile con un normale microscopio ottico a causa dello spessore del contenitore. 24

25 Sistemi di illuminazione del campione: a trasmissione (o a campo chiaro): LUCE DIRETTA a diffusione (o a campo scuro): CONTRASTO DI FASE LUCE DIRETTA CONTRASTO DI FASE 25

26 MATERIALE PER COLTURE CELLULARI Vetro (riutilizzabile); viene di volta in volta lavato e sterilizzato. Plastica monouso; disponibile in commercio imballato monouso e sterile L'uso di materiale in plastica monouso è da preferirsi per praticità, sicurezza e qualità. 26

27 Fabbisogni nutrizionali/fisici punti critici: terreni reagenti siero ph temperatura umidita relativa O 2 e CO 2 27

28 I terreni piu usati sono: MEM (Minimum Essential Medium), DMEM (Dulbecco s Modified MEM), RPMI (Roswell Park Memorial Institute). I terreni variano tra loro per composizione salina e diverso contenuto di elementi nutritivi. Per linee cellulari piu esigenti esistono terreni piu ricchi di metaboliti e vitamine: ISCOVE (con transferrina, lecitina e albumina) HAM-F12 28

29 Composizione standard del terreno di coltura 29

30 Come si fa a capire il ph del terreno: Quando il ph e intorno a 7.3 (valore fisiologico) il colore del terreno e rosso-arancio. A ph acido ( ) il colore vira al giallo: con il proliferare delle cellule il ph del terreno si acidifica per la produzione di C0 2 da parte del metabolismo cellulare: il terreno va cambiato. A ph basico (> ) il colore vira al rosso-viola: tale colorazione indica che le cellule non sono metabolicante attive. 30

31 SIERO FETALE BOVINO (FBS) i fattori di crescita; Il siero di vitello fetale contiene: i fattori adesivi; altre sostanze indispensabili per il metabolismo cellulare: albumina, veicolanti lipidi e vitamine liposolubili. colesterolo, acidi grassi, glucocorticoidi transferrina Cu, Zn, Co, Mo, Se, Va: cofattori enzimatici 31

32 L USO DEL SIERO E CONTROVERSO Protegge le membrane grazie al corretto grado di viscosità; Introduce fattori di crescita ed ormoni; Veicola lipidi, ferro e molecole organiche; Favorisce interazione fra cellule e substrato; Contiene inibitori della tripsina; Possibile tossicità degli anticorpi; Variabilità da lotto a lotto; Inibitori metabolici; Fattori di crescita che favoriscono i fibroblasti rispetto ad altri tipi cellulari; 32

33 COME SI MANTENGONO LE LINEE CELLULARI: 33

34 Come mantenere una linea cellulare: la criopreservazione Conservate in azoto liquido a -196 C Le cellule vitali possono essere recuperate in qualsisi momento 34

35 Metodica per la crioconservazione 1. Raccogliere le cellule in fase logaritmica 2. Determinare il numero delle cellule 3. Centrifugare la sospensione cellulare 4. Risospendere delle cellule nel medium di congelamento (20% FBS e 10% DMSO) 5. Dividere in criovials 6. Dare inizio al processo di congelamento 35

36 Vantaggi Ridotto rischio di contaminazione microbica e di cross contaminazione Si possono utilizzare linee cellulari a ben precisi passaggi Riduzione di costi e tempi 36

37 Procedura di scongelamento 1. Scongelare la vial nel bagnetto a 37 C 2. Pulire l esterno con alcool assoluto 3. Aprire la vial sotto cappa e trasferire il contenuto in una falcon sterile contenente 3-5 ml di mezzo completo 4. Centrifugare 5 min a circa 1000g/min per eliminare il DMSO 5. Aspirare il sovranatante 6. Risospendere il pellet cellulare in terreno fresco 7. Seminare in nuove piastre 37

38 contaminazioni CONTAMINAZIONI DI COLTURE CELLULARI 38

39 contaminazioni PRINCIPALI TIPI DI CONTAMINAZIONI IN COLTURE CELLULARI: Batteri Funghi (Muffe) Lieviti (Candida) Micoplasmi Virus 39

40 contaminazioni Batteri (bacilli) ingrandimento 320x I batteri appaiono come pulviscolo negli spazi tra le cellule 40

41 contaminazioni Gli antibiotici il più comunemente usati sono: Penicillina/Streptomicina (usati insieme) Gentamicina (spesso usata con kanamicina) Kanamicina (spesso usata con gentamicina) Ampicillina Questi antibiotici risultano efficaci sia contro i batteri gram-positivi che i batteri gram-negativi. E sconsigliato aggiungere a colture contaminate cocktail di molti antibiotici perché usati insieme possono provocare un effetto tossico cumulativo sulle cellule. 41

42 contaminazioni LIEVITI: Lievito (candida) ingrandimento 100x 42

43 contaminazioni FUNGHI: Fungo (muffa) ingrandimento 100x 43

44 contaminazioni I due agenti antimicotici più comunemente usati sono: anfotericina B (Fungizone). Il Fungizone è in genere molto tossico nei sistemi di coltura cellulare e dovrebbe essere usato solo all effettiva occorrenza (0.2 µg/ml e 2 µ/ml). mycostatina (Nystatin). Non si tratta di una soluzione ma di una sospensione colloidale per cui deve essere mescolata completamente prima di essere aggiunta ai terreni di coltura (100 U/ml e 250 U/ml) Nota importante: gli antibiotici ordinariamente usati quali penicillina/streptomicina, gentamicina e kanamicina non sono efficaci contro i funghi o le muffe. 44

45 contaminazioni MICOPLASMA: < 1 µm 45

46 contaminazioni Come combattere il micoplasma Gentamicina e kanamicina marginalmente efficaci contro i micoplasmi. Si preferisce: TIAMULIN MINOCICLINA VANCOMICINA Il modo migliore rimane comunque l eliminazione della coltura inquinata!!! 46

47 COLTURE CELLULARI: MODALITA DI COMPORTAMENTO 1) il laboratorio di colture cellulari deve essere ad uso esclusivo delle colture 2) usare cappe a flusso laminare sterile, verticale. 3) sostituire periodicamente prefiltri e filtri della cappa. 4) il piano di lavoro deve essere pulito prima di iniziare a lavorare e dopo aver finito di lavorare con alcool denaturato. 5) quando gli operatori SONO ASSENTI accendere gli UV germicidi nel piano di lavoro e nella stanza. 6) tutto il materiale utilizzato, vetro o plastica, soluzioni, deve essere rigorosamente sterili 47

48 7) Indossare i guanti. 8) usare un pipettattore elettrico. 9) colture inquinate vanno isolate, incubate con un disinfettante e quindi autoclavate; 10) sterilizzazione del materiale delle soluzioni: a secco (2h, 180 C); in autoclave (120 C, 30 ); per filtrazione, con eventuale sistema di aspirazione. 48

49 VALUTAZIONE DELL ASSORBIMENTO INTESTINALE 49

50 MODELLI CELLULARI PER LO STUDIO DELL ASSORBIMENTO INTESTINALE Linee cellulari di ratto derivate da intestino tenue fetale o neonatale Caco-2 50

51 CARATTERISTICHE DELLA LINEA CELLULARE Caco-2 Origine Crescita Differenziamento morfologia Parametri elettrici Enzimi digestivi Trasporto attivo Trasporto ionico di membrana Trasportatori non ionici di membrana Recettori Adenocarcinoma colorettale umano cellule epiteliali in monostrato cellule epiteliali in monostrato dopo la confluenza Cellule polarizzate, con giunzioni serrate e orletto a spazzola apicale Resistenza elettrica elevata Peptidasi e disaccaridasi specifiche dell intestino tenue Aminoacidi, zuccheri, vitamine, ormoni. Na +,K + ATPasi, H +,K + ATPasi, scambiatore Na +,H +, cotrasportatore Na +,K +, Cl -, canali apicali per Cl - P-glicoproteina, MRPs, LRP Vitamina B12, vitamina D3, EGF, trasportatori per il glucosio (GLUT1,3,5 e SGLT1)

52 CARATTERISTICHE DELLA LINEA CELLULARE Caco-2 Origine Crescita Differenziamento morfologia Parametri elettrici Enzimi digestivi Trasporto attivo Trasporto ionico di membrana Trasportatori non ionici di membrana Recettori Adenocarcinoma colorettale umano cellule epiteliali in monostrato cellule epiteliali in monostrato dopo la confluenza Cellule polarizzate, con giunzioni serrate e orletto a spazzola apicale Resistenza elettrica elevata Peptidasi e disaccaridasi specifiche dell intestino tenue Aminoacidi, zuccheri, vitamine, ormoni. Na +,K + ATPasi, H +,K + ATPasi, scambiatore Na +,H +, cotrasportatore Na +,K +, Cl -, canali apicali per Cl - P-glicoproteina, MRPs, LRP Vitamina B12, vitamina D3, EGF, trasportatori per il glucosio (GLUT1,3,5 e SGLT1)

53

54 STUDI METABOLICI IN VITRO FRAZIONE EPATICA S9 (supernatante a 9000 giri ) MICROSOMI in sospensione EPATOCITI in coltura

55

56 parent compound concentration (after incubation) % parent compound = 1 X 100 disappearance parent compound concentration (before incubation)

57

58 inibizione induzione

59 Screening per valutare l epatotossicità