UNITA DI RICERCA DI TRIESTE

Transcript

1 UITA DI RIERA DI TRIETE Direttore cientifico: Prof. Ennio Zangrando - uovi omposti di RUTEI-DM con Leganti di arbossilati I farmaci di platino cosiddetti di seconda e terza generazione che sono attualmente in uso clinico sono formalmente derivati dal cisplatino (cis-[ptl 2 ( 3 ) 2 ]) per sostituzione dei gruppi anionici uscenti e/o dei gruppi amminici. el carboplatino, [Pt(cbdc)( 3 ) 2 ] (cbdc= 1,1-ciclobutandicarbossilato), i due cloruri uscenti sono stati sostituiti da un chelante dicarbossilato. Un altro composto di platino con un legante dicarbossilato, recentemente approvato per il trattamento del cancro al colon, è l ossaliplatino, [Pt(dach)(ox)] (dach = R,R-1,2-diaminocicloesano, ox = ossalato) (Figura 1). 3 2 Pt Pt 3 2 carboplatino ossaliplatino E altresì noto che in soluzione fisiologica i composti antitumorali di -l-dmso da noi sviluppati, compreso il AMI-A (Figura 2), idrolizzano dei cloruri generando le specie attive. l l l l AMI A E dunque ragionevole ipotizzare che, come nel caso dei composti attivi di Pt(II), anche per i composti antitumorali di rutenio la sostituzione dei cloruri con carbossilati o dicarbossilati chelanti possa provocare un significativo cambiamento nei processi di idrolisi e di conseguenza nella bio-distribuzione e nell attività di tali composti. i è quindi intrapreso lo studio della reattività dei precursori di -ldmso verso dicarbossilati allo scopo di sviluppare una nuova serie di composti in cui, al posto degli alogeni, siano coordinati al anioni ossigenati. i è iniziato dai composti di (II) in quanto, essendo diamagnetici, permettono l uso della spettroscopia MR per la loro caratterizzazione. ono stati presi in considerazione tre precursori di (II), i due isomeri neutri cis,fac-[l 2 (dmso-) 3 (dmso-)], trans-[l 2 (dmso-) 4 ] ed il composto privo di cloruri fac-[(dmso-) 3 (dmso-) 3 ][ 3 F 3 ] 2. I leganti dicarbossilati utilizzati sono stati il malonato (mal), l 1,1-ciclobutan-dicarbossilato (cbdc), il succinato (suc) e l ossalato (ox) (Figura 3) cbdc mal suc ox In sintesi, sono stati preparati numerosi nuovi complessi, sia mono- (1 5) che di- (6 11) che tetra-nucleari (12), raccolti schematicamente in Figura 4. Tutti i complessi sintetizzati sono stati 1

2 caratterizzati spettroscopicamente e, in quasi tutti i casi, ne è stata determinata anche la struttura allo stato solido tramite diffrazione di raggi. Tutti i prodotti, indipendentemente dalla loro carica e nuclearità, presentano il frammento fac-(dmso-) 3, che è molto stabile. n n n 1: ox l 1 2: ox dmso 0 3: mal l 1 4: mal dmso 0 5: cbdc l 1 8: mal 2 9: suc 2 10: cbdc 2 11: cbdc 12 3 n 6: l 0 7: dmso +2 E interessante inoltre notare che cbdc e mal, nonostante la somiglianza strutturale, presentano differenti modi preferenziali di coordinazione: mal preferisce legarsi come chelante (η 2 -mal) al frammento fac-(dmso-) 3, mentre cbdc preferisce la coordinazione a ponte (µ-cbdc). Infine, è stato studiato il loro comportamento in soluzione acquosa tramite spettroscopia MR nella prospettiva di valutarne in seguito l eventuale attività antitumorale. - Modelli della Vitamina B 12 e complessi di cobalto Recentemente l interesse per i bioconiugati della vitamina B 12 (bl, dove bl = cianocobalamina, vedi Figura) è cresciuto sensibilmente, soprattutto per quanto riguarda le applicazioni in ambito terapeutico e diagnostico. E noto da lungo tempo, infatti, che le cellule di tessuti che proliferano rapidamente richiedono grandi quantità di vitamina B 12. Tramite la sintesi di opportuni bioconiugati si intende sfruttare questo fenomeno per veicolare agenti di contrasto per l imaging o agenti citotossici all interno di queste cellule. La vitamina B 12 è un nutriente essenziale per i mammiferi, i quali non la producono e devono assumerla col cibo. Il suo passaggio dall apparato digerente alle cellule coinvolge tre proteine di trasporto: l aptocorrina, il fattore intrinseco e la transcobalamina (T). ell ultimo stadio il complesso T-bl entra nelle cellule tramite un processo di endocitosi mediata da un recettore della membrana cellulare. La bl è dotata di molti gruppi funzionali che possono essere facilmente modificati, ma la scelta tra essi per la realizzazione del bioconiugato deve tenere conto dell efficienza della molecola risultante nel raggiungere le cellule bersaglio. Quindi l affinità del bioconiugato per la T non deve diminuire significativamente. Recenti studi cristallografici 2

3 condotti presso la nostra unità di ricerca di Trieste sulla T umana e bovina hanno rivelato che il gruppo 5 -idrossile della bl può venire funzionalizzato senza compromettere sensibilmente la formazione del complesso T-bl. ulla base di queste informazioni sono stati progettati e sintetizzati due leganti bioconiugati, bl-dtpa (vedi Figura) e bl-tta, tramite l esterificazione del gruppo 5 -idrossile della bl con la dianidride del DTPA (acido dietilenetriammino-,,,, -pentacetico) e del TTA (acido trietilenetetrammino,,,,,, - esacetico). La reazione di questi leganti bioconiugati con il Gd 3+ porta alla sintesi dei potenziali agenti di contrasto paramagnetici bl-dtpa-gd e bl-tta-gd. tudi di caratterizzazione dei leganti bioconiugati e dei loro complessi col Gd 3+ sono attualmente in corso A D 3 2 B o A D 3 o 3 B P P 3 bl bl-dtpa - tudio strutturale del riconoscimento molecolare tra antigene e anticorpo nella crioglobulinemia mista di tipo II associata a infezione da V. In collaborazione il entro di Riferimento ncologico (R) di Aviano, si sta sviluppando uno studio strutturale che si colloca all interno di un progetto di ricerca sulle problematiche inerenti alle complicanze associate all infezione da virus dell epatite (V) e, in particolare, la crioglobulinemia mista di tipo II (M), una malattia cronica di tipo autoimmunitario caratterizzata da proliferazioni oligoclonali di linfociti B, che in un significativo numero di casi esita ad un linfoma non odgkin (L) conclamato. E stato recentemente dimostrato che, in pazienti affetti da crioglobulinemia mista, le immunoglobuline di tipo M (IgM) con attività di fattore reumatoide, presenti nel crioprecipitato, sono analoghe ai recettori esposti delle cellule B monoclonali che in questi pazienti proliferano in maniera incontrollata, generando in alcuni di essi linfomi non-odgkin. La crioglobulinemia è il risultato della produzione da parte dei linfociti B di immunoglobuline di tipo M (IgM) bispecifiche, capaci cioè di riconoscere non solo l antigene virale (la proteina non strutturale 3 di V), ma anche la regione costante delle immunoglobuline di tipo G (Fc-IgG). La risposta autoimmune, oltre a causare la formazione di crioprecipitati composti dai complessi IgM-IgG (crioglobulinemia), provoca una anomala stimolazione dei linfociti B che si ritiene possa facilitare l insorgenza della patologia neoplastica. 3

4 L obiettivo del presente studio è quello di comprendere le basi molecolari di questa bispecificità, attraverso l analisi della struttura cristallografica delle interazioni IgM-3 e IgM-Fc (IgG). Le immunoglobuline sono glicoproteine flessibili, in grado di assumere un ampia varietà di conformazioni grazie alla mobilità delle loro subunità. Questa caratteristica permette di assolvere due compiti fondamentali, il riconoscimento e la successiva eliminazione dei corpi estranei come virus e batteri, ma determina anche la difficoltà di cristallizzazione delle immunoglobuline e la conseguente scarsità della letteratura al riguardo. i è pensato quindi di utilizzare un approccio indiretto a questo studio strutturale: si è deciso di procedere alla produzione, purificazione e cristallizzazione di un frammento dell immunoglobulina in esame, costituito dalle parti variabili della catena leggera e della catena pesante, responsabili del riconoscimento molecolare dell antigene, legate in modo covalente attraverso un linker che permetta il corretto ripiegamento delle subunità immunoglobuliniche. La proteina ricombinante cfv (ingle hain Variable Fragment) è stata prodotta dalla Dott.sa Valli De Re presso il entro di Riferimento ncologico di Aviano, utilizzando una sequenza di IgM individuata dal crioprecipitato di un paziente V positivo affetto da crioglobuninemia mista. La proteina prodotta è costituita dalla sequenza della parte variabile della catena leggera del paziente, legata attraverso il linker (er-gly 4 ) 3 alla sequenza relativa alla parte variabile della catena pesante. ono inoltre presenti un frammento -terminale (tag) utile per la purificazione e un frammento - terminale che consente la formazione di frammenti attivi bispecifici utili alla verifica in vitro della reattività della proteina prodotta. Questa proteina è stata ottenuta nei corpi di inclusione di batteri E. oli, utilizzando un vettore di espressione inducibile. La lisi delle cellule, condotta presso il Laboratorio del entro di Eccellenza in Biocristallografia dell Università di Trieste, ha permesso di separare i corpi di inclusione, successivamente solubilizzati in una soluzione tampone a p 8.3 contenente guanidinio, utilizzato come agente caotropico. Il campione è stato successivamente purificato mediante cromatografia di esclusione FPL, su colonna uperdex 200 R 10/30 (Amersham Biosciences), utilizzando come eluente la stessa soluzione denaturante. L analisi elettroforetica su gel di poliacrilamide ha permesso di controllare la purezza della proteina in questa soluzione. A dispetto del vantaggio di ottenere in modo semplice una discreta quantità di proteina, l espressione nei corpi di inclusione batterici presenta il notevole svantaggio di richiedere una procedura di refolding della proteina purificata. Infatti, a causa della scarsa solubilità della forma attiva del frammento di immunoglobulina, le cellule di E. oli producono questa proteina in forma denaturata. Presso il laboratorio del entro di Eccellenza in Biocristallografia dell Università di Trieste sono state eseguite prove di refolding del frammento di immunoglobulina prodotto, utilizzando metodi di diluizione e di dialisi, in presenza di diversi additivi (ossidanti, additivi che evitando l aggregazione) e a p tra 4 e 9.5. La resa massima, valutata per via spettrofotometrica, del processo di refolding nei diversi esperimenti è risultata di 48%. Tuttavia, dopo aver concentrato questa soluzione, si è osservato che la concentrazione di proteina non cambiava, mentre si riscontrava la presenza sempre più abbondante di un precipitato bianco. E probabile che la forma della proteina ottenuta sia poco solubile ed abbia perciò raggiunto la massima concentrazione possibile (circa 0.11 mg/ml), non sufficiente per i successivi esperimenti di cristallizzazione. onsiderando le difficoltà incontrate nella rinaturazione di questa proteina, si è deciso di analizzarne la struttura, per verificare quali mutazioni nella sequenza primaria prodotta dal sistema di espressione potessero aumentarne la solubilità. La solubilità è influenzata principalmente dagli amminoacidi che si trovano esposti sulla superficie della proteina nella sua struttura tridimensionale. on disponendo di dati sperimentali per questa struttura, è stato necessario modellizzarla a partire da strutture note di immunoglobuline. Attraverso il software BLAT, è stata effettuata la ricerca di sequenze simili a quella della proteina in esame nel database Protein DataBank (PDB), che contiene le strutture tridimensionali determinate per via sperimentale attraverso diffrazione di raggi oppure tecniche di risonanza 4

5 magnetica. Le strutture trovate sono state valutate in base alla somiglianza che presentavano con la sequenza del cfv e alla qualità dei dati da cui sono state ricavate. La struttura della proteina in esame è stata quindi ricostruita a partire da frammenti appartenenti alle proteine individuate nel Protein DataBank. Alcuni residui sono stati mutati utilizzando il programma di grafica molecolare. Le strutture così ottenute hanno suggerito di apportare alcune modifiche alla sequenza della proteina ricombinante prodotta dal sistema di espressione. La produzione della proteina con la sequenza modificata è in corso presso il laboratorio del entro di Riferimento ncologico di Aviano. 5