LA RICERCA NEL TERMALISMO
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- Giustino Bucci
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1 LA RICERCA NEL TERMALISMO Prof. Dr. Ubaldo Armato DIRETTORE, SEZIONE DI ISTOLOGIA E EMBRIOLOGIA, DIP. DI SCIENZE DELLA VITA E DELLA RIPRODUZIONE, UNIVERSITA DEGLI STUDI DI VERONA
2 Psoriasi (1) È una malattia cutanea cronica che si manifesta nel 3% della popolazione, mediata da cellule T, dovuta a fattori genetici e ambientali e caratterizzata da: iperproliferazione della microvascolatura dermica superficiale iperproliferazione e precoce corneificazione dei cheratinociti epidermici infiltrati infiammatori di granulociti neutrofili linfociti T attivati macrofagi cellule APC
3 Psoriasi (2) Clinicamente si presenta con tipiche lesioni eritematose e con scaglie accompagnate sovente da manifestazioni aggiuntive: artrite psoriasica Sono note forme tipiche (a placca) e atipiche (guttata, pustolosa, eritrodermica e inversa) Comorbidità associate possono essere: malattie cardiovascolari, diabete mellito tipo 2, obesità, linfomi, depressione, maliattie infiammatorie dell intestino La terapia va individualizzata in relazione alla intensità, diffusione e durata delle manifestazioni e comprende svariati farmaci, fototerapia e la balneoterapia termale (Comano)
4 Psoriasi (3) Alla base delle modificazioni istopatologiche della psoriasi starebbe un iperespressione e alterate interazioni di un network di citochine e chemochine (IL-1, IL-6, TNF-, etc.). Pertanto, dal punto di vista della Medicina Traslazionale sono del tutto giustificati i tentativi di chiarire scientificamente i meccanismi d azione dell acqua termale di Comano. Noi ne abbiamo indagato gli effetti sulla produzione e secrezione di citochine e chemochine e di marker specifici da parte di cheratinociti psoriasici coltivati in vitro.
5 Materiali e Metodi (1) Le colture primarie in vitro di cheratinociti a confluenza allestite da 9 pazienti affetti da psoriasis vulgaris sono state suddivise in: colture di controllo, incubate con DMEM medium ricostituito con acqua ultrapura (CW 0%) colture trattate, incubate con DMEM medium ricostituito con acqua termale di Comano (CW; 25% o 50% o 100% vol/vol). Le cellule e i terreni di coltura sono stati campionati dopo 3, 5, 7, e 11 giorni dall inizio dei trattamenti.
6 Materiali e Metodi (2) I contenuti intracellulari di citochine, chemochine e i marker psoriasici sono stati valutati tramite immunofluorescenza / microscopia confocale e Western immunoblotting / densitometria delle bande proteiche specifiche. Le citochine e chemochine secrete nei media sono state dosate con metodi EIA / ELISA. Riportiamo qui i risultati relativi a VEGF-A, IL-1, ic-il-1ra, TNF-, IL-6, IL-8, e ai marker psoriasici CK-16, ed elafin/skalp/trappin-2.
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8 TUMOR NECROSIS FACTOR- (TNF- )
9 Il TNF- gioca un ruolo di rilievo nella fisiopatologia della psoriasi (specie nelle forme pustolose di von Zumbush) com è stato dimostrato usando un anticorpo monoclonale specifico (Infliximab). Il TNF- è indotto dall IL-1 induce il VEGF e l NF- e favorisce la formazione locale di infiltrati cellulari infiammatori in quanto induttore di varie chemochine, come: IL-8 gr. neutrofili (microascessi) Gro- gr. neutrofili (microascessi) MCP-1 monociti RANTES memory T cells, NK cells, c. dendritiche, gr. basofili, gr. eosinofili, monociti) oltre che di: IL-6 molecole di adesione (ICAM-1, VCAM-1).
10 Intracellular TNF- kda CW 0% 45 CW 100% NB. Il TNF- è sempre risultato indosabile nei terreni di coltura dei cheratinociti psoriasici sia di controllo che trattati con acqua termale di Comano.
11 VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR-A (VEGF-A)
12 Il VEGF-A è il più potente fattore angiogenico noto ed è iperespresso e ipersecreto dai cheratinociti psoriasici sin dall inizio delle manifestazioni cutanee. I fattori di crescita IGF-II e TGF-, pure iperespressi nella psoriasi, inducono il VEGF-A attivando la via segnaletica MEK/ERK delle MAP chinasi (MAPK). L ipossia e fattori genetici possono pure esser coinvolti. Il VEGF-A stimola la proliferazione delle cellule endoteliali dei capillari delle papille dermiche. Causa perciò una crescita, una dilatazione e un aumentata permeabilità dei capillari dermici, che assumono l aspetto di venule postcapillari con conseguenti iperemia ed edema locali. Il VEGF-A è anche una chemochina esplicando un precoce effetto chemiotattico sui monociti che infiltrano quindi le lesioni.
13 Intracellular VEGF-A 3 days 7 days 11 days CW 0% CW 100%
14 INTRACELLULAR PRECURSORS OF VEGF-A ISOFORMS A kda CW 0% (or DW) CW 100% kda VEGF-A 189 precursor a 4.0 DW-DMEM CW-DMEM C VEGF-A 165 precursor DW-DMEM CW-DMEM D VEGF-A 121 precursor DW-DMEM CW-DMEM Arbitrary units a B a of treatment Arbitrary units of treatment Arbitrary units of treatment
15 SECRETED VEGF-A ISOFORMS A kda CW 0% (or DW) CW 100% kda B VEGF 189 DW-DMEM CW-DMEM 15 C VEGF-A 165 DW-DMEM CW-DMEM D VEGF-A 121 DW-DMEM CW-DMEM 30 6 Arbitrary units of treatment Arbitrary units 10 5 a a a of treatment Arbitrary units a b of treatment b
16 Phospho (p)-erk-1/2 La riduzione dell attività delle MAP chinasi ERK-1/2 (p- ERK-1/2) nei cheratinociti psoriasici trattati con acqua termale di Comano è un indice di attenuazione dei segnali intracellulari evocati dai legami di fattori di crescita e citochine (in parte forse di origine autocrina) con i rispettivi recettori a livello del plasmalemma
17 Interleuchina-1 (IL-1 )
18 L IL-1 è il principale agonista extracellulare del sistema dell IL-1. I livelli di IL-1 si innalzano nell epidermide e nel derma affetti da lesioni psoriasiche. Operando come fattore autocrino o paracrino tramite il suo recettore di membrana IL-1-R1, l IL-1 induce il fenotipo epidermico rigenerativo proprio delle lesioni psoriasiche (e delle ferite in guarigione), caratterizzato dall iperespressione locale di: TNF- CK-16 CK-17 Transglutaminasi (TG) ICAM-1 HLA-DR
19 Intracellular IL-1 CW 0% CW 100% of treatment
20 Intracellular IL-1 CW 0% CW 100% kda IL CW 0% CW 100% Protein amount (arbitrary units) Per cent increase in intracellular IL-1 levels
21 Secreted IL sil-1 CW 0% CW 100% sil-1 (pg ml -1 per 10 6 keratinocytes) Per cent inhibition of sil-1 release
22 Intracellular IL-1-receptor antagonist (ic-il-1-ra)
23 L ic-il-1-ra (intracellular IL-1-receptor antagonist) è un peptide di 152 amino acidi avente un 30% di omologia con l IL-1. Una volta prodotto, l ic-il-1-ra resta entro i cheratinociti e inibisce per legame competitivo il recettore IL-1-R1 localizzato sull involucro nucleare bloccandone l attività segnaletica indotta dall IL-1. Un accumulo di ic-il-1-ra riduce l espressione di CK-16, CK-17, transglutaminasi (TG) e integrina- 1, avvicinando il fenotipo epidermico rigenerativo dei cheratinociti psoriasici al fenotipo dei cheratinociti normali.
24 CW 0% CW 100% Protein amount (arbitrary units) CW 0% 51 CW100% Percent increases in ic-il-1ra levels ic-il-1-ra kda
25 Interleuchina-6 (IL-6)
26 L IL-6 è iperespressa da cheratinociti, fibroblasti e monociti residenti nelle lesioni cutanee psoriasiche a seguito dell induzione da parte di IL-1 e TNF-. L IL-6 stimola la proliferazione di cheratinociti e linfociti. L IL-6 modula le interazioni tra epidermide e sistema immunitario favorendo l attivazione di linfociti T, macrofagi e granulociti neutrofili negli infiltrati infiammatori locali.
27 Intracellular IL-6 3 days 7 days 11 days CW 0% CW 100%
28 Intracellular IL-6 kda CW 0% 45 Protein amount (arbitrary units) 16 IL-6 14 Comano's water 0% % CW 100% pg/ml Secreted IL-6 IL-6 0% 25% 50% 100%
29 Interleuchina-8 (IL-8)
30 L IL-8 è iperespressa nella cute delle lesioni psoriasiche L IL-8 è una chemochina che esplica un intenso effetto chemiotattico sulle mastcellule che si accumulano nel derma delle lesioni psoriasiche entro cui rilasciano istamina, etc.
31 Intracellular IL-8 3 days 7 days 11 days CW 0% CW 100%
32 Intracellular IL-8 kda CW 0% 51 CW 100% 51 Secreted IL Protein amount (arbitrary units) 18 IL-8 16 Comano's water 0% %
33 Marker psoriasici (1) CITOCHERATINA-16 (CK-16) Come la CK-17, la CK-16 è un marker dell iperproliferazione dei cheratinociti psoriasici essendo propria del fenotipo epidermico rigenerativo. L espressione della CK-16 è indotta dall IL-6, a sua volta indotta dall IL-1 = CK16 = VEGF-A (merge)
34 CK-16 kda CW 0% 48 CW 100% Protein amount (arbitrary units) CK-16 Comano's water 0% 100%
35 Marker psoriasici (2) ELAFIN / SKALP / TRAPPIN-2 E una skin-derived anti-leuko-proteinase espressa da cheratinociti psoriasici, ma non dai cheratinociti normali. E indotta da IL-1, TNF-, etc. E espressa come 1. forma matura (10 kda), che è secreta e 2. forma immatura (50 kda), legata in modo covalente a proteine, che resta intracellulare. Inibisce l elastasi e la proteinasi-3 dei granulociti neutrofili, proteggendo così i costituenti della matrice extracellulare della cute.
36 Elafin / SKALP / Trappin- 2 > 50 kda = Elafin-cross linked to other proteins CW 0% CW 100% kda Secreted 10kDa Elafin inhibits neutrophils elastase and proteinase-3 Protein amount (arbitrsry units) ELAFIN 10 kda Comano's water 0% 100% 6 kda Elafin typical of psoriasis Protein amount (arbitrary units) ELAFIN 50 kda Comano's Water 0% 100%
37 Sinossi degli effetti dell acqua termale di Comano rispetto a quelli dell acqua ultrapura Citochine e Marcatori Livelli intracellulari (WB) Livelli extracellulari (ELISA) IL 1β 3d 5d 7d 11d 3d 5d 7d 11d 13d ic IL 1 Ra IL 6 IL 8 VEGF A TNF α CK 16 Elafin, 50kD 100% vs. 0% Livelli aumentati Livelli ridotti Livelli immutati Elafin, 10kD nd nd nd nd nd
38 Conclusioni I nostri risultati costituiscono la prova scientifica che, interferendo con la sintesi e la secrezione di molteplici citochine e chemochine e con l espressione di marker specifici della psoriasi, l acqua termale di Comano avvicina il fenotipo epidermico rigenerativo dei cheratinociti psorasici al fenotipo dei cheratinociti normali. Ricerche ulteriori che chiariscano i fini meccanismi molecolari alla base degli effetti clinici dell acqua di Comano farebbero meglio apprezzare il suo valore alternativo rispetto alle altre modalità terapeutiche correnti
39 Fig. 2 Cytokine pathways and cellular immune response in the pathogenesis of psoriasis. Erine A. Kupetsky, Alicia R. Mathers, Laura K. Ferris Anti-cytokine therapy in the treatment of psoriasis Cytokine Volume 61, Issue
40 Fig. 3 Cytokines targets in the treatment of psoriasis. Erine A. Kupetsky, Alicia R. Mathers, Laura K. Ferris Anti-cytokine therapy in the treatment of psoriasis Cytokine Volume 61, Issue
41 I MIEI RINGRAZIAMENTI VANNO A: ANNA CHIARINI 1 ILARIA DAL PRA 1 RAFFAELLA PACCHIANA 1 GIUSEPPE ZUMIANI 2 MAURO ZANONI 3 1 SEZIONE DI ISTOLOGIA ED EMBRIOLOGIA, DIP. DI SCIENZE DELLA VITA E DELLA RIPRODUZIONE, UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI VERONA 2 CASA DI CURA VILLA BIANCA, REP. DI DERMATOLOGIA E VENEREOLOGIA, TRENTO 3 TERME DI COMANO (TRENTINO)
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