LABORATORIO MULTIFUNZIONE

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1 LABORATORIO MULTIFUNZIONE (Chimica Fisica Scienze) ELENCO ESPERIMENTI ATTUALMENTE DISPONIBILI ANALISI LATTE vedi Balestrieri pag. 409 e seguenti DETERMINAZIONE DELL ACIDITÀ TOTALE Si prelevano 20 ml di latte e si titolano con NaOH 0,1 N in presenza di fenolftaleina (2-3 gg) fino a colorazione violetta persistente per almeno 15 sec. L acidità si esprime in gradi SH ( ml di NaOH 0,25 N necessari ad ottenere il viraggio per 100 ml di latte ) e nel nostro caso si calcola: Acidità ( g. ac. lattico / 100 ml di latte ) = V x 0,045 V = volume di NaOH 0,1 N consumati per la titolazione SH = acidità ( g. di acido lattico / 100 ml ) / 0,0225 PUNTO DI CONGELAMENTO Il latte di vacca genuino ha un punto di congelamento compreso fra - 0,53 e - 0,57 (purché l acidità sia inferiore a 0,18 g/100 ml di ac. lattico). I valori comunemente accettabili sono superiori a -0,530 e si misura determinando la temperatura al plateau corrispondente al punto di congelamento. Apparecchiatura: - termometro per crioscopia - provette crioscopiche - criostato Procedimento: Si regola la temperatura del bagno del crioscopio a circa 4-5 gradi sotto zero con aggiunte di sale e ghiaccio. Si misura la temperatura di congelamento dell acqua distillata per ottenere lo zero del termometro (scrivere di quanto si scosta dallo zero) e quindi si effettua una misura utilizzando una soluzione standard a punto di congelamento noto per controllare la taratura del termometro.

2 Si riempie la provetta con latte fino alla tacca e si porta al crioscopio, si sistema il termometro e l agitatore in modo da ottenere una agitazione continua della massa. Si continua il raffreddamento fino a circa 0,5 sotto il punto di congelamento ipotetico e si aggiunge qualche cristallo di ghiaccio e si continua ad agitare fino a quando il termometro non ricomincia a risalire. A questo punto si sospende l agitazione e si osserva l innalzarsi della temperatura che sarà sempre più lento fino a quando non si ferma ( plateau ). Si percuote con delicatezza il termometro fino a quando la misura non si stabilizza. Si fa la lettura e a questa si aggiunge il valore ottenuto per lo zero con l acqua distillata. N.B. Per latti di pecora il valore deve essere superiore a 0,570. Per i latti di capra i valori sono simili a quelli di vacca. MATERIA GRASSA Il metodo Gerber si basa sulla capacità dell acido solforico di sciogliere tutti i componenti del latte ad esclusione del grasso, che viene fatto separare in strato chiaro e trasparente e misurato. Apparecchiatura: - Centrifuga riscaldata - Butirrometro Gerber ( per il latte di vacca con scala 0-4 oppure 0-7 per pecora scala 0-14 ) - Pipetta da 11 ml per il latte - Pipetta da 1 ml per l alcol isoamilico - Pipetta da 10 ml per ac. solforico ( ps. 1,820-1,825 ) Procedimento: Il campione di latte da analizzare si porta alla temperatura di 20 C ( le pipette sono tarate a questa temperatura) e si mescola con cura evitando la formazione di schiuma. Si introducono nel butirrometro 10 ml di ac. solforico per Gerber e quindi 11 ml di latte, curando di non bagnare l orlo del butirrometro e versando il latte sull ac. solforico goccia a goccia facendolo stratificare. Si aggiunge 1 ml di alcol isoamilico e si chiude il butirrometro con il tappo di gomma aiutandosi con lo spingitappo. Si agita capovolgendo più volte fino ad ottenere una massa omogenea (attenzione si sviluppa una notevole quantità di calore) e si pone in centrifuga riscaldata a 1000 giri/in per 15 minuti. Si legge la quantità di grasso regolando il livello di lettura con lo spingitappo.

3 Nel caso di latte omogeneizzato i valori possono essere in difetto per cui, per avere un riscontro più preciso, bisogna ripetere più volte il procedimento di centrifugazione. Se si volesse usare il metodo Rose-Gottlieb per estrazione con etere di petrolio vedi Tateo pag. 52, oppure Balestrieri pag. 419 AZOTO TOTALE Si intende la quantità tot. di azoto presente nel latte determinata col il metodo Kjeldahl espressa in % P/V. Principio del metodo: Si fa digerire a caldo una certa quantità di latte, ac. solforico conc. e solfato di potassio con solfato di rame come catalizzatore. L azoto si trasforma in solfato di ammonio che viene successivamente distillato in opportuno sistema. Apparecchiatura: - Palloni Kjeldahl da 500 ml - Pipette e cilindri vari - Apparecchiatura per digestione - Apparecchiatura per distillazione - Burette varie per titolazione Reattivi: - Solfato di potassio - Solfato di rame o ossido di rame - Ac. solforico conc. - Idrossido di sodio al 30 % - Ac. borico al 2 % - Indicatore misto preparato sciogliendo 0,01 g di rosso di metile, 0,02 g di blu di bromotimolo e 0,06 g di verdebromocresolo in 100 ml di alcool al 95 %. Procedimento Portare il campione a 20 C e mescolare accuratamente evitando la formazione di schiuma. Pipettare 5 ml di latte in pallone Kjeldahl senza sporcare le pareti, aggiungere 5 g. di solfato di potassio, 0,3 g. di solfato di rame e 15 ml di ac. solforico conc. Si scalda a fiamma bassa fino a

4 completa eliminazione delle schiume, si aumenta la fiamma fino a quando la soluzione non diventa limpida e verdeazzurra. Si raffredda e si travasa quantitativamente, aiutandosi con acqua, nel pallone di distillazione. Si procede alla distillazione aggiungendo soda fino neutralizzazione e quindi raccogliendo il distillato in circa 30 ml di ac. borico con indicatore. Finita la distillazione, accertarsi con una cartina che non distilla più ammoniaca, si procede alla titolazione usando ac. solforico 0,1 N (indichiamo con V il volume consumato) fino a colorazione rossa. Calcoli: N % P/V = 1,4 x V x N / volume analizzato Prot. tot. = N x 6,38 = 0,1786 x Vtit. AZOTO NON PROTEICO In un matraccio da 50 ml aggiungere 25 ml di latte a 20 C. Portare a volume aggiungendo, sotto costante agitazione, ac. tricloroacetico al 20 %. Si filtra dopo 30 usando filtri a fascia bianca o Watman 40. Si prelevano 20 ml di filtrato limpido e si pongono in pera Kjeldahl, si addizionano 5 ml di ac. solforico ed una punta di spatola di selenio. Si mineralizza e si distilla come sopra. Si titola con ac. solforico 0,05 N. Calcoli % NPN x 6,38 = V x 0,04466 AZOTO NON CASEINICO In matraccio da 50 ml prelevare 20 ml di latte a 20 C, aggiungere 20 ml di acqua e porre in bagnomaria a 37 C per 20. Si aggiungono 2 ml di ac. acetico al 10%, si agita e si ripone a bagnomaria per altri 20, si aggiungono 2 ml di acetato di sodio 1N si agita. Dopo raffreddamento si porta a volume con acqua e si filtra su filtro a fascia nera o Watman 41. Si prelevano 20 ml di filtrato e si pongono in pera Kjeldahl, si aggiungono 5 g di solfato potassico, 0,3 g di solfato di rame e 15 ml di ac. solforico conc. Si mineralizza, si distilla e si titola con ac. solforico 0,05 N. Calcoli:

5 % NCN x 6,38 = V x 0,0558 % SP = % NCN - % NPN % SP/Pt = % SP x 100 : % Pt LATTOSIO Si introducono in un matraccio da 100 ml 1 ml di latte a 20 C, si aggiungono 5 ml di acqua e 2-3 gocce di ac. acetico conc. Si pone il matraccio a bagnomaria a 80 C sino a formazione di grumi caseosi ( circa 15 ). Se il liquido è ancora lattiginoso si raffredda e si addizionano 0,5 ml di soluzione satura di acetato di piombo neutro e dopo agitazione, 1 ml di soluzione di solfato di sodio anidro saturo. Si lascia a riposo per mezzora e poi si completa a volume di 100 ml con acqua; si filtra su filtro asciutto. In matraccio tarato da 100 ml si introducono 20 ml di filtrato limpido, 20 ml di soluzione a 4 g. litro di acido picrico e 10 ml di soluzione al 20 % ( p/v ) di carbonato di sodio anidro. In altro matraccio si trattano allo stesso modo 20 ml di acqua ( bianco ), è opportuno preparare uno standard a conc. vicina al campione da analizzare ( per il latte circa 10 mg di lattosio ). Si tengono i matracci a bagnomaria a 90 C esatti per 20, quindi si raffredda in bagno d acqua, si porta a volume e si legge l assorbanza a 530 mm. Per preparare la curva di taratura si prelevano aliquote di lattosio ( da 3 a 15 mg ) e si diluiscono a 20 ml circa in matracci tarati da 100 ml; a tali soluzioni si addizionano 20 ml di ac. picrico e 10 ml di soluzione al 20 % di carbonato sodico, si tengono in bagnomaria a 90 C per 20, si raffreddano si portano a volume e si legge l assorbanza a 530 mm. ( TATEO vol. I pag. 42 ). Calcoli % LATTOSIO ( P/V ) = 5 x 0,100 x L = 0,5 x L L = mg di lattosio letti nella curva di taratura. ANALISI MICROBIOLOGICHE DEL LATTE ( da approntare ) CONTA DELLE CELLULE SOMATICHE

6 Preparazione vetrino: sul vetrino porta oggetto vengono tracciati n 4 campi di 1 cm di lato. Per ogni campione di latte si devono analizzare almeno due film. Con una microsiringa si prelevano 0,01 ml di latte e si depone sul quadratino prima sui bordi e poi si distribuisce uniformemente su tutto il quadratino. Il vetrino così preparato si lascia asciugare per essere successivamente colorato. Colorazione: reagenti Alcol etilico al 96 % Xilene Blu di metilene procedimento Il vetrino viene immerso in alcol etilico per un minuto e mezzo e quindi si pone ad asciugare in stufa. Si immerge nuovamente in xilene per un minuto e mezzo e si riasciuga in stufa. Il vetrino viene nuovamente immerso in alcol etilico per un minuto e mezzo e quindi si pone ad asciugare in stufa. Alla fine si immerge in blu di metilene per un minuto e mezzo. conta delle cellule Contare i campi (almeno 90) nel terzo centrale del film evitando di prendere in considerazione le cellule che ricadono nella zona periferica. calcolo Fattore di lavoro: 12732/d 2 x s d = diametro del campo microscopico in mm s = numero di campi in cui è stata effettuata la conta. Il numero di cellule somatiche contate vengono moltiplicate per il fattore di lavoro ottenendo il n di cellule per ml di latte. I valori normali devono essere intorno a CARICA BATTERICA TOTALE (CBT)

7 Si agita il campione da analizzare per capovolgimento 25 volte. Si prende una aliquota di 1 ml di latte e si effettuano le diluizioni scalari fino a in provette contenenti 9 ml di soluzione di Ringer sterili. Dalla soluzione diluita si preleva 1 ml di soluzione e si pone su capsula Petri sterile priva di terreno. Si versano nella capsula circa 20 ml di terreno di coltura ( Milk plate count agar) sterilizzato in autoclave a 121 C per 20 minuti e successivamente condizionato alla temperatura di 45 C. Le piastre solidificate vengono incubate alla temperatura di 30 C per 72 ore. Si contano le colonie e si moltiplica per il fattore di diluizione. COLIFORMI Si agita il campione da analizzare per capovolgimento 25 volte. Si prende una aliquota di 1 ml di latte e si effettuano le diluizioni scalari fino a in provette contenenti 9 ml di soluzione di Ringer sterili. Dalla soluzione diluita si preleva 1 ml di soluzione e si pone su capsula Petri sterile priva di terreno. Si versano nella capsula circa 20 ml di terreno di coltura ( Violet red bile agar preparato pesando 19,25 grammi di terreno in polvere e sciogliendolo in 500 ml di acqua distillata a bagnomaria bollente senza sterilizzato in autoclave ) sciolto alla temperatura di 45 C e si miscela. Le piastre solidificate vengono incubate alla temperatura di 37 C per 48 ore. Si contano le colonie e si moltiplica per il fattore di diluizione. N.B. Per il latte pastorizzato si procede nella stessa maniera ma i prelievi devono essere fatti per la CBT su diluizioni e per i coliformi si preparano due piastre con 1ml e 5 ml di latte tal quale. STAFILOCOCCO AUREUS Si agita e si preleva una aliquota di un ml di latte e si depone in una capsula di Petri contenente il terreno specifico (Agar sale mannite) si distribuisce con l ansa sterile e si mette ad incubare a 37 C per 48 ore. Le colonie positive devono colorarsi di giallo oro caratteristico. SALMONELLA Si prelevano 20 ml di latte in bottiglie da 250 ml con tappo a vite, contenenti 100 ml di terreno di pre arricchimento (buffered peptone water) precedentemente sterilizzato in autoclave. Si agita e si lascia ad incubare

8 per 24 ore in termostato a 37 C. Si prelevano 10 ml di questo campione e si inoculano in 100 ml di Muller-Kauffman tetrathionate (al terreno sciolto senza sterilizzarlo vengono aggiunti solo al momento dell uso 1 ml di verde brillante e 2 ml di soluzione di iodio) si pone ad incubare per 48 ore a 43 C. Successivamente vengono allestite subcoture in brillant green agar modified (il terreno viene sciolto senza sterilizzarlo e raggiunta la temperatura di C viene aggiunto sulpha-mandelate supplement, ricostituito asetticamente con 5 ml di acqua sterile e aggiunto a 500 ml di terreno) ed incubate a 35 C per 24 ore. La crescita di colonie rosse sospetta salmonella vengono successivamente identificate. Indietro