1 Capitolo 8. Sviluppo linfocitario e riarrangiamento ed espressione dei geni dei recettori antigenici

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1 1 Capitolo 8. Sviluppo linfocitario e riarrangiamento ed espressione dei geni dei recettori antigenici La maturazione consiste in una serie di eventi che avvengono negli organi linfoidi generativi o primari: 1. Orientamento verso linfociti T o B. A partire da cellule staminali dette HSC (Hematopoietic Stem Cells) nel midollo osseo e nel fegato fetale si ha la maturazione a CLP (progenitore linfoide comune) che poi a seconda degli stimoli ricevuti dai recettori di membrana si differenzierà in linfocita B o T. I linfociti T terminano la loro maturazione all interno del timo. 2. Riarrangiamento dei geni per il recettore. Elemento chiave della maturazione linfocitaria che avviene nei linfociti B immaturi nel midollo osseo e nei linfociti T immaturi nel timo. A partire da un numero modesto di geni grazie a tagli, ricongiungimenti ed aggiunte si genera un numero elevatissimo di esoni differenti che codificano per il recettore, tutto questo prima dell incontro con l antigene. 3. Selezione dei linfociti utili ed eliminazione di quelli pericolosi. Le cellule che non esprimono un recettore o pre-recettore corretto muoiono per apoptosi; quelle che sono in grado di legare con bassa avidità gli MHC vengono portate avanti nella maturazione dalla selezione positiva; quelle che legano con elevata avidità antigeni self vengono eliminate dalla selezione negativa fenomeno detto delezione clonale; Possono anche andare incontro a un successivo riarrangiamento del recettore detto editing recettoriale. 4. Proliferazione. 5. Differenziazione in sottogruppi (CD4, CD8, etc). Orientamento verso le linee B e T L orientamento dipende dalle istruzioni ricevute dalla superficie della cellula seguite dall induzione di specifici fattori trascrizionali. Lo stadio precoce dello sviluppo è caratterizzato dalla proliferazione stimolata soprattutto dall IL-7 prodotta dalle cellule stromali di midollo e timo. Mutazioni nel recettore per questa citochina portano ad immunodeficienze quali le SCID. 1.1 Riarrangiamento dei geni recettoriali I geni che codificano per il recettore per l antigene sono generati per riarrangiamento di regioni diverse del gene che codifica per la regione variabile(v) con segmenti di geni della diversità (D) e quelli della ricongiunzione(j).tale processo è detto ricombinazione V(D)J Organizzazione dei loci per le IG Esistono tre loci genici separati su cromosomi diversi che codificano per le tre catene delle IG (pesante, λ, κ). Ciascun locus contiene una regione costante (C) che codifica la parte C delle catene e una regione V che codifica la parte variabile composta da copie multiple di segmenti V e J, nel locus per la catena 1

2 pesante sono presenti anche segmenti D. Nell uomo nei segmenti o geni V al 5 di ognuno vi è una sequenza L che codifica per un peptide leader che caratterizza tutte le proteine neo-sintetizzate e svolge un ruolo essenziale nell indirizzamento verso l ER. Nel 3 della regione V cioè tra i geni V e quelli C vi sono segmenti J e nei loci per le catene pesanti vi sono anche dei segmenti D. La regione C della catena pesante è costituita da circa 9 geni C, solo 3 o 4 bastano per codificare l intera regione C della catena pesante e altri 2 per la regione carbossi-terminale di membrana. Nel locus per le catene leggere vi è un unico esone C che basta da solo a codificare l intera regione C della catena leggera. Nelle catene leggere il dominio V è codificato dai segmenti V e J mentre quelle pesanti da V(D)J Organizzazione dei loci per TCR L organizzazione è molto simile a quella per le Ig. I geni che codificano per le catene α, β e γ sono su cromosomi separati, mentre quello per la catena δ è contenuto in quello per la catena α. La struttura di questi è uguale a quella detta prima: regione V con segmenti V, J e D solo nelle catene β e δ e una regione C con 2 geni nelle catene β, γ e uno solo nelle altre due. Ciascun gene V è preceduto in 5 da una sequenza L che codifica per il peptide leader. 2

3 1.1.3 Ricombinazione V(D)J La ricombinazione V(D)J dà origine alla specificità e variabilità del recettore e consiste nell unione di segmenti V, D(se presente) e J presi a caso. Siccome i segmenti scelti si trovano lontani sul cromosoma devono essere effettuate rotture e riallacciamenti. Durante la ricombinazione sono aggiunti o rimossi nucleotidi che aumentano enormemente la variabilità dell esone V(D)J. Il risultante esone V(D)J codificherà la regione variabile, in associazione con le regione C che sono invece costanti.tale ricombinazione è effettuata da un complesso detto ricombinasi. Il complesso della ricombinasi riconosce specifiche sequenze dette RSS situate nel 3 del segmento V e 5 del segmento J; tali sequenze sono costituite da una sequenza altamente conservata di 7 nucleotidi detta eptamero distaccata da una sequenza spaziatrice d 12 o 23 nucleotidi da una seconda sequenza conservata di 9 nucleotidi detta nonamero. Un enzima specifico una volta avvicinati i due eptameri (uno adiacente a V e uno adiacente a J) taglia l elica tra il segmento V e J e il rispettivo eptamero, successivamente segue l unione dei due segmenti codificanti e l eliminazione del frammento contentente le RSS sotto forma di anello. In alcuni casi gli eptameri sono situati entrambi a destra sia di V che di J in tal caso è necessaria una inversione del Dna intermedio e le RSS tagliate non vengono eliminate ma rimangono nel cromosoma. La ricombinazione tra due segmenti si verifica solo uno è fiancheggiato da uno spaziatore di 12 e l altro di 23: è la cosiddetta regola 12/23. Il processo di ricombinazione V(D)J si può riassumere in quattro eventi fondamentali: 1. sinapsi: i due segmenti codificanti e le RSS adiacenti vengono in contatto tra loro grazie alla formazione di un anello sul cromosoma. 2. taglio: rottura del doppio filamento di Dna. 3

4 3. codifica e processazione: le estremità tagliate vengono modificate mediante aggiunta o rimozione di nucleotidi. 4. unione:le estremità codificanti vengono unite in un processo detto NHEJ (Non Homolgous End Joining). In tali processi svolgono un ruolo centrale due proteine dette Rag-1 e Rag-2 che formano il complesso ricombinasi V(D)J. Rag-1 e Rag-2 mantengono uniti i segmenti genici durnte la ricombinazione e poi Rag-1 riconosce le sequenze tra l eptamero e la sequenza codificante e le taglia. Il taglio viene effettuato solo su una delle eliche e l estremità tagliata si lega all altra formando una struttura a forcina detta hairpin. L altra estremità da origine a una terminazione blunt ancora legata alle RSS e non processata. Le due hairpin chiuse, una del V e l altra di J si trovano a essere una di fronte all altra e vengono a essere modificate con aggiunta di nucleotidi. I geni per Rag sono attivi solo nei linfociti immaturi, in fase proliferativa o matura sono silenti proprio per minimizzare il rischio di rotture inapropriate del Dna. Le hairpin vengono aperte e modificate da un enzima detto Artemis, attivato da Dna-Pk (protein chinasi DNA dipendenti) a sua volta attivato dalle due proteine Ku70 e Ku80 che svolgono un ruolo chiave nel riparo della rottura. Generazione della diversità linfocitaria L enorme diversificazione dei linfociti B e T è dovuta soprattutto al riarrangiamento dei geni per il recettore (IG e TCR). Questa diversificazione è dovuta a una diversità combinatoria dovuta semplicemente alle diverse combinazioni possibili tra i diversi segmenti V,J e D e a una diversità giunzionale data dalla aggiunta e rimozione di nucleotidi dai segmenti V, J e D. Quest ultima è mediata da diversi meccanismi: primo meccanismo è la rimozione di nucleotidi dalla sequenza germinale alle estremità del gene a opera di una endonucleasi. un secondo è la aggiunta di nuove sequenze nucleotidiche alle giunzioni scisse da Artemis. Se la scissione è asimmetrica i nucleotidi aggiunti devono essere complementari a quelli del tratto parallelo e tali nucleotidi sono detti nucleotidi P. ultimo meccanismo di diversità giunzionale è la aggiunta casuale di un massimo di 20 nucleotidi non codificati da alcuno stampo detti nucleotidi N mediata da un enzima chiamato TdT. La massima diversificazione si ha nella regione CDR3 delle Ig e TCR che si forma nei siti di ricombinazione V(D)J. Proprio per la sua elevata specificità la sequenza dei nucleotidi contenuta in questa regione funziona come marcatore clonale specifico: in questo modo nei tumori linfocitari si può stabilire quale clone è la causa. 1.2 Sviluppo dei linfociti B 4

5 Durante la maturazione, le cellule della linea linfocitaria B passano attraverso stadi distinti caratterizzati da markers specifici e Ig caratteristiche. Il precusore più precoce destinato a diventare linfocita B è detto linfocita pro-b; queste cellule non producono alcuna Ig e possono essere distinte per l espressione di molecole di superficie quali CD19 e CD10. Le proteine Rag sono espresse per la prima volta a questo stadio e la prima ricombinazione nei geni delle Ig ha luogo nel locus della catena pesante. I passi di questa prima ricombinazione sono: 1. Avvicinamento di un segmento D e un segmento J con eliminazione del DNA interposto 2. Aggiunta di un gene V 5 all unità DJ appena creata: tutto i segmenti V e D interposti vengono eliminati 3. Aggiunta di nucleotidi da parte di TdT 4. Trascrizione di VDJ (se l aggiunta di nucleotidi ha generato una sequenza produttiva) Se il riarrangiamento della catena pesante ha successo la cellula smette di essere chiamata linfocita pro-b e passa alla fase di linfocita pre-b. I linfociti pre-b sono cellule B in sviluppo che esprimono la proteina Igµ ma che devono ancora riarrangiare il locus per la catena leggera. La catena pesante µ è infatti associata con le proteine λ5e VpreB dette surrogati delle catene leggere. L insieme di catena pesante, catene leggere surrogate e proteine trasduttrici dette Igα e Igβ formano quello che prende il nome di recettore pre-b. Nelle cellule con riarrangiamenti in frame del locus IgH è il pre-bcr a fornire i segnali di transizione da fase pro-b a fase pre-b. I segnali in arrivo da questo recettore sono responsabili dell espansione in termini numerici di questa popolazione linfocitaria. Numerose molecole segnalatrici sono necessarie sia al BCR che al pre-bcr per superare il checkpoint. Una tirosin chinasi detta Btk (Bruton s tyrosine kinase) è attivata a valle di questi recettori ed è necessaria per la sopravvivenza e la maturazione della cellula oltre la fase di linfocita pre-b. Mutazioni nel gene Btk portano alla patologia detta agammaglobulinemia X-linked. Il complesso pre-bcr regola i successivi riarrangiamenti dei geni Ig in due modi. In primo luogo se una proteina µ viene prodotta da un locus ricombinato in un cromosoma il pre-bcr blocca la ricombinazione sull altro cromosoma omologo. Se il primo arrangiamento non è invece produttivo viene consentita la ricombinazione V(D)J sull omologo. Grazie a questa attività in ogni clone solo un allele è espresso mentre l altro è in configurazione germinale e non è utilizzato: ci si riferisce a questo processo con il termine di esclusione allelica. Il secondo sistema in cui il pre-bcr regola la ricombinazione è lo stimolo al riarrangiamento del gene per la catena leggera. Nel successivo stadio di maturazione si ha il riarrangiamento dei geni delle catene leggere che producono le rispettive proteine: queste vanno ad associarsi alla catena pesante µ formando l IgM completa. La cellula a questo punto esprime IgM e viene detta cellula B immatura. La produzione di una catena leggera κ inibisce il riarrangiamento del locus per la catena λ e viceversa: le Ig hanno dunque sempre la stessa catena leggera grazie a questo processo detto di esclusione dell isotipo della catena leggera. Sottogruppi diversi di linfociti B sviluppano a partire da progenitori diversi. Le HSC derivate dal fegato fetale sono precursori delle cellule B tipo B-1; le HSC derivate dal midollo danno invece origine 5

6 alla maggior parte dei linfociti B. Questo secondo gruppo di cellule passa rapidamente attraverso due stadi che lo orienta verso lo sviluppo o di cellule B della zona marginale o di cellule B follicolari. La maggior parte dei linfocti B maturi è di tipo follicolare e coesprime le catene pesanti µ e δ: presentano dunque sia IgD che IgM nella forma di membrana. L espressione simultanea delle due diverse catene pesanti è dovuta a splicing alternativo dello stesso mrna. La coespressione di IgD ed IgM si accompagna all acquisizione di competenza funzionale e abilità di ricircolo: a questo punto si parla dunque di linfocita B maturo. I linfociti B maturi naive sono capaci di rispondere agli antigeni e sono destinati a morire in pochi mesi se non incontrano l antigene per il quale hanno grande affinità. Selezione dei linfociti B maturi La selezione nei linfociti T maturi è molto ben definita e precisa, mentre nell ambito dei linfociti B è un processo molto meno rigido. Le cellule B immature che riconoscono antigeni self con troppa avidità vengono indotte a cambiare la loro specificità tramite il processo di editing recettoriale. In questo processo si ha riattivazione dei geni Rag, con una seconda ricombinazione dei geni della catena leggera: normalmente viene modificata la catena leggera κ e questo altera la specificità del recettore. Se l editing fallisce si ha selezione negativa, un processo responsabile almeno in parte del mantenimento della tolleranza dei linfociti B; il riconoscimento dell antigene in questo caso porta a morte apoptotica. Quando la transizione a linfocita B maturo IgD + IgM + è completata, il riconoscimento dell antigene non porta più ad apoptosi o a editing ma a proliferazione e differenziazione. Linfociti B-1 e linfociti della zona marginale Molte delle cellule B-1 esprimono la molecola CD5 che può essere usata come marker; nell adulto grandi quantità di queste cellule si trovano nel peritoneo e nelle mucose. Questi linfociti secernono spontaneamente IgM che spesso reagiscono con polisaccaridi e lipidi: questi anticorpi sono detti anticorpi naturali in quanto prodotti senza immunizzazione, anche se si sospetta che sia la flora intestinale ad indurne la produzione. I linfociti della zona marginale si trovano nella milza e rispondono ad antigeni polisaccaridici generando anticorpi naturali. Il marker per queste cellule è CD Maturazione dei linfociti T Ruolo del timo Il timo è il più importante sito di maturazione dei linfociti T e a dimostrazione di questo: 1. Se viene rimosso il timo in un topo neonato questo non sviluppa linfociti T maturi 2. L assenza congenita di timo, come nella sindrome di DiGeorge, porta a un ridotto numero di linfociti T in circolo e nei tessuti linfoidi e a pesanti carenze di risposte mediate da questo tipo di cellula Il timo involve spontaneamente con l avanzare dell età, ma poichè i linfociti T della memoria hanno una vita anche di oltre vent anni il bisogno di nuovi linfociti T diminuisce negli anziani. 6

7 I linfociti T in fase di sviluppo nel timo sono detti timociti e non esprimono TCR e nemmeno CD4 o CD8. Nella corteccia timica queste cellule esprimono per la prima volta il TCR (αβ o γδ) e per quelle che esprimono il tipo αβ inizia anche la maturazione verso il sottogruppo CD4 + o CD8 +. L ambiente del timo fornisce gli stimoli necessari per la proliferazione e la maturazione dei timociti; molti di questi stimoli arrivano direttamente dalle cellule del timo, cioè cellule epiteliali, macrofagi o cellule dendritiche. La migrazione dei timociti in questo tipo di ambiente garantisce interazioni fisiche con le altre cellule, passaggio necessario per la maturazione. Due tipologie di molecole prodotte dalle cellule timiche non linfoidi sono importanti per la maturazione: Le molecole MHC di classe I e II espresse su cellule epiteliali e dendritiche. Le interazioni tra i timociti in maturazione e queste molecole sono essenziali per la selezione del repertorio linfocitario. Citochine e chemochine secrete dalle cellule stromali. La più importante è IL-7, inoltre le chemochine CCL19 e CCL21, legandosi al recettore CCR7, guidano i timociti nell attraversamento del timo Stadi di maturazione linfocitaria 7

8 I timociti corticali più immaturi, di recente giunti dal midollo, contengono i geni per il TCR in configurazione terminale e quindi non esprimono TCR, CD3 o catene ζ e nemmeno CD4 o CD8: queste cellule vengono dette timociti doppio negativi o cellule pro-t. Come nel caso dei linfociti pro-b, le proteine Rag vengono espresse per la prima volta in questa fase: il riarrangiamento dei geni porta alla transizione verso la fase pre-t e il seguente sviluppo del linfocita αβ. Il riarrangiamento, se svolto con successo, porta alla traduzione di una catena beta funzionante che viene espressa sulla superficie della cellula in associazione con una proteina invariante detta pre-tα. L insieme di catena beta, catena invariante pre-tα, proteine CD3 e proteina ζ prende il nome di complesso pre-tcr. I segnali dal pre- TCR mediano la sopravvivenza dei timociti e la loro espansione proliferativa; i segnali mediano inoltre l inizio della ricombinazione del locus per la catena alfa e guidano la transizione da fase doppio negativa a fase doppio positiva. I segnali del pre-tcr inibiscono inoltre ulteriori riarrangiamenti della catena β limitando l accessibilità della cromatina. Nello stadio successivo di maturazione i timociti esprimono sia CD4 che CD8 e sono dunque detti timociti doppio positivi. Questi timociti esprimono inoltre il recettore per chemochine CCR7 e quindi migrano verso la midollare del timo. A questa fase la cellula esprime l eterodimero completo αβ del TCR. In caso di incapacità di riarrangiare la catena α del TCR il timocita muore per apoptosi. Importante, il riarrangiamento del gene per la catena alfa causa la delezione del locus δ: questa cellula non potrà quindi mai più diventare un linfocita γδ. In virtù della neo acquisita capacità di rispondere agli antigeni, i timociti doppio positivi subiscono selezione positiva o negativa: le cellule che subiscono il processo maturano in linfociti CD4 + o CD8 +, quindi diventano timociti singolo positivi. I timociti singolo positivi entrano nella midollare e lasciano infine il timo per andare a popolare i tessuti linfoidi periferici Processi di selezione Il repertorio linfocitario immaturo non selezionato consiste di linfociti T i cui recettori possono riconoscere qualsiasi antigene peptidico presentato su una molecola MHC qualsiasi. In ogni individuo gli unici linfociti T utili sono quelli specifici per i peptidi non-self presentati dalle molecole MHC self; parallelamente, i linfociti T che riconoscono antigeni self con troppa avidità sono potenzialmente pericolosi perchè possono innescare processi autoimmuni. Quando i timociti doppio positivi esprimono per la prima volta il TCR questo incontra peptidi self presentati su molecole MHC delle cellule timiche epiteliali. La selezione positiva è il processo per cui i timociti i cui TCR riconoscono blandamente questi peptidi e le molecole MHC associate vengono stimolati a sopravvivere. La selezione negativa è invece il processo in cui i timociti i cui TCR riconoscono troppo avidamente i peptidi self o le molecole MHC vengono eliminati per prevenire reazioni contro l organismo stesso. Selezione positiva Se il TCR di un timocita riconosce le molecole MHC I associate al peptide e allo stesso tempo il CD8 interagisce con l MHC, questo riceve segnali che ne evitano la morte e promuovono il proseguimento della maturazione. Per procedere il linfocita doppio positivo può continuare ad esprimere CD8 e il TCR ma può smettere di esprimere CD4; il risultato è un linfocita T CD8 + MHC I ristretto. Un processo totalmente analogo avviene per produrre un linfocita CD4 + MHC II ristretto. Durante la transizione da doppio positivo a singolo positivo gli helper diventano CD4 + CD8 mentre i citotossici CD4 CD8 +. Selezione negativa La conseguenza di un riconoscimento troppo avido è lo scatenarsi dell apoptosi: questo processo elimina i linfociti T autoreattivi e garantisce la tolleranza al self. La tolleranza indotta nei timociti dal riconoscimento degli antigeni self nel timo è detta tolleranza centrale, per differenziarla dalla tolleranza periferica indotta nei linfociti già maturati. La selezione negativa può avvenire sia nella fase doppio negativa che nella fase singolo positiva. Nella midollare, le cellule epiteliali del timo esprimono una proteina nucleare detta AIRE che induce l espressione di parecchi geni tessuto-specifici in modo da rendere questi peptidi disponibili per la presentazione Linfociti T γδ Questo tipo di linfociti ha una linea di sviluppo totalmente a parte: una esclude l altra. La diversità del repertorio di queste cellule è limitata perchè vengono usati solo pochi dei segmenti V, D e J disponibili: 8

9 questi linfociti servono infatti a difendersi da un numero limitato di microbi il cui incontro è molto frequente alle barriere epiteliali Cellule NK-T Le cellule NK-T esprimono TCR αβ non MHC ristretto ma CD1 ristretto: riconoscono infatti antigeni lipidici legati a questa molecola. 9