Accertamenti sanitari sulle virosi della vite con saggi immuno-enzimatici: confronto di metodiche su matrici di legno o di foglie fresche

Transcript

1 Accertamenti sanitari sulle virosi della vite con saggi immuno-enzimatici: confronto di metodiche su matrici di legno o di foglie fresche Antonacci Donato 1, Perniola Rocco 1, Caputo Angelo Raffaele 1, Coletta Antonio 1, Milella Rosa Anna 1, Brini Maria Luisa 1, Gasparro Marica 1, Pepe Rosa 2. 1 CRA Consiglio per la Ricerca e la sperimentazione in Agricoltura, Istituto Sperimentale per la Viticoltura Sezione di Turi BARI Via Casamassima, Turi (BA), Italia isvit.ba@entecra.it Tel ; Fax CRA Consiglio per la Ricerca e la sperimentazione in Agricoltura, Istituto Sperimentale per l Orticoltura Via Cavalleggeri, Pontecagnano (SA), Italia isor@entecra.it Tel ; Fax Parole chiave: accertamenti sanitari, virosi, saggio immuno-enzimatico ELISA, foglie, legno. Key words: sanitary checks, virosis, ELISA immune-enzymatic test, leaves, wood. Mots clé: contrôles sanitaires, viroses, test immune enzymatique ELISA, feuilles, bois. Riassunto Una delle metodiche attualmente utilizzate per l individuazione delle virosi di vite è il saggio immuno-enzimatico ELISA. La sensibilità e l affidabilità di questo test dipendono principalmente dalla tipologia del campione di partenza. Nel nostro lavoro, per ogni accessione considerata, sono state prelevate foglie basali nella stagione estiva del 2006 e legno durante la successiva fase del riposo vegetativo. Per i test sierologici sono stati utilizzati kit diagnostici delle ditte Agritest (Italia) e Bioreba (Svizzera), seguendo i protocolli indicati dai fornitori. Entrambi i protocolli consigliano di esaminare tessuto floematico derivante da foglie di vite o da trucioli di legno. Analizzando i risultati dei test ELISA eseguiti sulle due differenti matrici di vite è emerso che, per gli agenti virali GLRaV3, GFlV, ArMV e GVA, la diagnosi può essere effettuata indifferentemente su matrici fogliari o legnose con un basso margine di errore. Il test ELISA non sembra avere la stessa affidabilità su entrambe le matrici per la diagnosi di GLRaV1, GLRaV2 e GFkV. Abstract - Sanitary checks on the grapevine virosis with immune-enzymatic tests: methodologies comparison on wood matrixes or fresh leaves One of the methodologies currently used for the vine virosis individualization is the ELISA immuno-enzymatic test. The sensibility and the reliability of this test mainly depend on the typology of the starting sample. In our research, for each accession, we have collected basal leaves during the 2006 summer season and wood during the following phase of the vegetative rest. For the serologic tests we have used diagnostic kits of Agritest (Italy) and Bioreba (Switzerland) firms, following the protocols pointed out by the suppliers. Both the protocols advise to examine phloematic tissue from vine leaves or from wood shavings. Analyzing the results of the ELISA tests performed on the two different vine matrixes, we have noticed that, for the viral agents GLRaV3, GFlV, ArMV and GVA, the diagnosis can be indifferently carried out on leaf or woody matrixes with a low percentage of error. The ELISA 1

2 test doesn't seem to have the same reliability on both the matrixes for the diagnosis of GLRaV1, GLRaV2 and GFkV. Résumé - Contrôles sanitaires sur les viroses de la vigne avec des tests immune enzymatiques: comparaison de méthodiques sur matrices de bois ou feuilles fraîches Une des méthodiques utilisée actuellement pour la détermination des viroses de la vigne est le test immuno-enzymatique ELISA. La sensibilité et la fiabilité de ce test dépendent de la typologie de l échantillon de départ. Dans notre recherche, pour chaque accession, nous avons prélevé des feuilles basales pendant l'été 2006 et bois pendant la suivante phase du repos végétatif. Pour les tests sérologiques nous avons utilisé des kits diagnostiques des maisons Agritest, (Italie) et Bioreba (Suisse), en suivant les protocoles indiqués par les fournisseurs. Les deux protocoles conseillent d'examiner le tissu phloèmatique dérivant de feuilles de vigne ou de copeaux de bois. En analysant les résultats des tests ELISA exécutés sur les deux matrices différentes de vigne nous avons remarqué que, pour les agents viraux GLRaV3, GFlV, ArMV et GVA, le diagnostic peut être effectué indifféremment sur matrices foliaires ou ligneuses avec une basse marge de faute. Le test ELISA ne semble pas avoir la même fiabilité sur les deux matrices pour le diagnostic de GLRaV1, GLRaV2 et GFkV. Introduzione Le virosi della vite sono considerate patologie gravi per la viticoltura. L uso di misure preventive quali la selezione sanitaria, supportata da efficienti metodi di diagnosi, costituisce la strategia migliore per individuare fonti primarie sane da propagare vegetativamente e, quindi, ridurre l impatto quantitativo e qualitativo che le virosi hanno sulla produzione (Rowhani A. et al., 2005). I lavori di selezione clonale sanitaria e l espletamento delle attività di controllo sui materiali di moltiplicazione della vite, richiedono l applicazione di metodi in grado di fornire risultati validi e di elevata affidabilità per la diagnosi dei virus. Gli esiti dipendono soprattutto dal metodo di saggio usato, dalla tipologia del campione da esaminare e dalle modalità di raccolta (Borgo M. et al., 2006). In particolare la ricerca dei virus in laboratorio avviene mediante due tipi di indagine (Rowhani A. et al., 1997): Indagine sierologica. Si effettua con il saggio immuno-enzimatico ELISA (Enzyme Linked Immunoadsorbent Assay), test sierologico basato sul riconoscimento specifico della proteina capsidica del virus da parte di anticorpi specifici. Indagine molecolare. E basata sul riconoscimento degli acidi nucleici virali presenti nei tessuti dell ospite. L amplificazione genetica (Polymerase Chain Reaction, PCR) consente di aumentare a dismisura la quantità di molecole bersaglio nel campione, attraverso la sintesi in situ di frammenti genomici. Con la diagnosi molecolare possono essere individuati virus per i quali non è ancora stata realizzata la costruzione di anticorpi; inoltre possono essere messe in evidenza infezioni latenti con livelli molto bassi di carica virale. Il saggio sierologico, considerando la praticità operativa e l esiguo costo delle analisi, rappresenta un mezzo utile per un rapido screening sanitario, mentre il test PCR, più costoso del precedente, viene usato per esplorare nuovi virus e perfezionare l esame dei materiali in selezione. La sensibilità e l affidabilità del test ELISA dipendono principalmente dalla tipologia del campione di partenza. Materiali e metodi In questo lavoro, realizzato nel Progetto Vitivin-Valut, finanziato da MiPAAF-CIPE, vengono analizzati i risultati di test ELISA eseguiti su due differenti matrici di vite (legno e foglie), 2

3 raccolte in vari momenti dell anno, per la diagnosi dei virus più comuni. Per i test sierologici sono stati utilizzati kit diagnostici delle ditte Agritest (Italia) e Bioreba (Svizzera), seguendo i protocolli indicati dai fornitori. Entrambi i protocolli consigliano di analizzare tessuto floematico derivante da foglie di vite o da trucioli di legno (Teliz D. et al., 1987). Per il rilevamento dei virus GLRaV1, GLRaV3 (Grapevine Leafroll-associated Virus 1 e 3) e GFlV (Grapevine Fanleaf Virus) è stato applicato il protocollo Bioreba che utilizza il metodo diretto DAS-ELISA (Double-Antibody Sandwich), secondo il quale un primo anticorpo specifico (coating reagent) viene adsorbito nei pozzetti di una piastra di polistirene; dopo l adsorbimento si aggiungono i campioni da saggiare e, infine, gli anticorpi coniugati (conjugate reagent) con la fosfatasi alcalina, un enzima in grado di catalizzare una reazione di colorazione all aggiunta del substrato p-nitrofenil fosfato. Per il rilevamento dei virus GLRaV2 (Grapevine Leafroll-associated Virus 2), ArMV (Arabis Mosaic Virus), GVA (Grapevine Virus A) e GFkV (Grapevine Fleck Virus) è stato utilizzato, invece, il kit diagnostico della ditta Agritest che applica il metodo diretto DAS-ELISA per GLRaV2, ArMV e GVA e il metodo indiretto DASI-ELISA (Double-Antibody Sandwich Indirect) per GFkV. Per GVA, la metodica prevede l inserimento di una fase di presensibilizzazione con l utilizzo della Proteina A, prima dell aggiunta dell anticorpo specifico. Il metodo indiretto DASI-ELISA si differenzia da quello diretto per la presenza di due tipi di anticorpi coniugati: l anticorpo specifico per il virus da ricercare e l anticorpo coniugato antiimmunoglobuline, marcato con la fosfatasi alcalina, in grado di legarsi all anticorpo specifico che permane dove c è l antigene. Il confronto diagnostico è stato effettuato su 121 accessioni/campioni, per ognuna delle quali sono state prelevate circa 10 foglie basali nella stagione estiva del 2006 e legno (porzioni basali o mediane di tralci) durante la successiva fase del riposo vegetativo. In sintesi, sono state prelevate porzioni di tessuto floematico sottocorticale dai tralci o porzioni di nervatura centrale dalle foglie fresche; queste sono state messe in tampone di estrazione nella proporzione di 1:10 (peso/volume) e poi omogeneizzate. L estratto è stato direttamente caricato nei pozzetti di piastre ELISA, precedentemente sensibilizzate. Dopo la coniugazione e il caricamento del substrato, le piastre sono state valutate visivamente e fotometricamente con apposito lettore alla lunghezza d onda di 405 nm. La presenza o l assenza del virus è stata determinata confrontando il valore di assorbanza del campione con il valore soglia, calcolato come due volte il valore medio dell assorbanza dei due controlli negativi. I campioni con assorbanza superiore o inferiore al valore soglia sono stati considerati rispettivamente positivi e negativi. Per ritenere i risultati attendibili, il valore medio dell assorbanza dei due controlli positivi deve essere maggiore o uguale al valore soglia (Figura 1). 3

4 FOGLIE Fase 1 SENSIBILIZZAZIONE DELLE PIASTRE: un anticorpo specifico viene adsorbito nei pozzetti di una piastra di polistirene. LEGNO Si prelevano porzioni di nervatura centrale da foglie fresche. Fase 2 PREPARAZIONE DEI CAMPIONI Si prelevano porzioni di tessuto floematico sottocorticale da tralci. Fase 3 OMOGENIZZAZIONE DEI CAMPIONI: il tessuto floematico viene posto in tampone di estrazione e omogeneizzato. Fase 4 CARICAMENTO DEI CAMPIONI SU PIASTRE Fase 5 CONIUGAZIONE DELLE PIASTRE: aggiunta di un anticorpo coniugato con la fosfatasi alcalina Fase 6 CARICAMENTO DEL SUBSTRATO E LETTURA DELLA PIASTRA Figura 1. Rappresentazione grafica delle fasi principali di un test ELISA. Risultati e discussione In laboratorio sono stati saggiati per la ricerca dei virus GLRaV1, GLRaV3, GFlV e ArMV 121 campioni. Un terzo di questi campioni (39, scelti a caso) è stato analizzato anche per la presenza di GLRaV2, GVA e GFkV. Per ogni campione sono stati effettuati due test sierologici: uno su matrice fogliare (foglie basali prelevate nella stagione estiva del 2006) e l altro su materiale lignificato (prelevato durante la successiva fase del riposo vegetativo). Dalle analisi effettuate, è emerso che per uno stesso campione non sempre si sono avuti gli stessi risultati per entrambe le matrici. In particolare (Figura 2), nella ricerca di GLRaV1, sul totale dei campioni esaminati (121) sono stati individuati 31 campioni con risultati differenti (25,6%): 4 campioni infetti solo per il test su legno, 27 campioni infetti solo per il test su foglie. Per la diagnosi di GLRaV3, hanno dato risultati diversi solo 8 campioni, pari al 6,6%: 6 campioni infetti solo per il test su legno, 2 campioni infetti solo per il test su foglie. Per quanto riguarda GFlV, hanno espresso risultati differenti 11 campioni (9,1%): 4 campioni infetti solo per il test su legno, 7 campioni infetti solo per il test su foglie. 4

5 Invece, nello screening per ArMV, si sono avuti 7 campioni con risultati diversi, pari al 5,8%, tutti infetti solo per il test su legno. Nella diagnosi di GLRaV2, GVA e GFkV, effettuata solo su 39 campioni, i risultati diversi ottenuti hanno riguardato campioni infetti solo per il test su legno, nello specifico: 9 campioni per GLRaV2 (23,1%), 1 campione per GVA (2,6%), 6 campioni per GFkV (15,4%). CONFRONTO TRA LE DUE METODICHE CONFRONTO TRA LE DUE METODICHE 30,0% 25,0% 20,0% 15,0% 10,0% 5,0% 0,0% 25,6% 6,6% 9,1% 5,8% VIRUS SAGGIATI SU 121 CAMPIONI 25,0% 20,0% 15,0% 10,0% 5,0% 0,0% 23,1% 15,4% 2,6% VIRUS SAGGIATI SU 39 CAMPIONI GLRaV1 GLRaV3 GFlV ArMV GLRaV2 GVA GFkV Figura 2. Si riporta in percentuale il numero di campioni che hanno mostrato risultati differenti ai test ELISA eseguiti su matrici di legno e di foglie. Pertanto, i risultati dei test ELISA effettuati portano a diverse conclusioni a seconda dell agente virale saggiato. Come dimostrano i dati della Figura 3, il test sierologico per l esame del virus GLRaV1 sembra mostrare un affidabilità maggiore qualora il saggio venga eseguito su foglie (42 campioni infetti su foglie contro i 19 campioni infetti su tralci). La matrice più idonea per l identificazione di campioni infetti per GLRaV2 o per GFkV, di contro, sembra essere il legno (per GLRaV2, 10 campioni infetti su tralci contro uno solo risultato infetto su foglie; per GFkV, 11 campioni infetti su tralci contro i 5 infetti su foglie). I restanti agenti virali vengono rilevati con buona affidabilità sia su foglie che su legno, come si evince dalle minime differenze riscontrate in termini di campioni infetti. CONFRONTO CAMPIONI FOGLIE-TRALCI SAGGIATI SANI GLRaV1 GLRaV3 GFlV ArMV 0 FOGLIE TRALCI CONFRONTO CAMPIONI FOGLIE-TRALCI FOGLIE TRALCI SAGGIATI SANI GLRaV2 GVA GFKV Figura 3. Confronto campioni esaminati con le due metodiche. Conclusioni Negli accertamenti sanitari per la diagnosi dei virus della vite, il test ELISA è il saggio più comunemente utilizzato per la sua facile metodologia operativa e per la possibilità di ricercare quasi tutti gli agenti virali a costi limitati, permettendo così un rapido screening sanitario. Tuttavia, la sensibilità e l affidabilità di questo test dipendono principalmente dalla tipologia del campione di partenza, indagando sull influenza eventuale della porzione floematica esaminata (in relazione alla sua posizione sul tralcio). 5

6 Questo lavoro ha mostrato che, per gli agenti virali GLRaV3, GFlV, ArMV e GVA, la diagnosi può essere effettuata indifferentemente su matrici fogliari o legnose con un basso margine di errore. Il test ELISA non sembra avere la stessa affidabilità su entrambe le matrici per la diagnosi di GLRaV1, GLRaV2 e GFkV. Bibliografia 1. Borgo M. (2006). Le virosi della vite e la selezione clonale sanitaria. Informatore Fitopatologico, n. 4, Borgo M., Bazzo I., Bertazzon N., Angelini E. (2006). Accertamenti sanitari per la diagnosi dei virus della vite. Informatore Fitopatologico, n. 4, Rowhani A., Uyemoto J.K., Golino D.A. (1997). A comparison between sierological and biological assay in detecting grapevine leafroll associated viruses. Plant Diseases, n. 81, Rowhani A., Uyemoto J.K., Golino D.A., Martelli G.P. (2005). Pathogen testing and certification of Vitis and Prunus species. Annual Review of Phytopathology, n. 43, Sanitary selection of the grapevine. Colmar (France), October 9, Ed. INRA, Paris, 1997 (Les Colloques, n 86). 6. Teliz D., Tanne E., Gonsalves D. and Zee F. (1987). Plant Diseases, n. 71,