Manuale di microbiologia predittiva

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1 Manuale di microbiologia predittiva

2 a cura di Fausto Gardini Eugenio Parente Manuale di microbiologia predittiva Concetti e strumenti per l ecologia microbica quantitativa 123

3 Fausto Gardini Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroalimentari Università degli Studi di Bologna Bologna Eugenio Parente Scuola di Scienze Agrarie, Forestali, Alimentari ed Ambientali Università degli Studi della Basilicata Potenza Istituto di Scienze dell Alimentazione, CNR Avellino Additional material to this book can be downloaded from ISBN ISBN DOI / (ebook) Quest opera è protetta dalla legge sul diritto d autore e la sua riproduzione anche parziale è ammessa esclusivamente nei limiti della stessa. Tutti i diritti, in particolare i diritti di traduzione, ristampa, riutilizzo di illustrazioni, recitazione, trasmissione radiotelevisiva, riproduzione su microfilm o altri supporti, inclusione in database o software, adattamento elettronico, o con altri mezzi oggi conosciuti o sviluppati in futuro, rimangono riservati. Sono esclusi brevi stralci utilizzati a fini didattici e materiale fornito ad uso esclusivo dell acquirente dell opera per utilizzazione su computer. I permessi di riproduzione devono essere autorizzati da Springer e possono essere richiesti attraverso RightsLink (Copyright Clearance Center). La violazione delle norme comporta le sanzioni previste dalla legge. Le fotocopie per uso personale possono essere effettuate nei limiti del 15% di ciascun volume dietro pagamento alla SIAE del compenso previsto dalla legge, mentre quelle per finalità di carattere professionale, economico o commerciale possono essere effettuate a seguito di specifica autorizzazione rilasciata da CLEARedi, Centro Licenze e Autorizzazioni per le Riproduzioni Editoriali, [email protected] e sito web L utilizzo in questa pubblicazione di denominazioni generiche, nomi commerciali, marchi registrati, ecc. anche se non specificatamente identificati, non implica che tali denominazioni o marchi non siano protetti dalle relative leggi e regolamenti. Le informazioni contenute nel libro sono da ritenersi veritiere ed esatte al momento della pubblicazione; tuttavia, gli autori, i curatori e l editore declinano ogni responsabilità legale per qualsiasi involontario errore od omissione. L editore non può quindi fornire alcuna garanzia circa i contenuti dell opera. Springer fa parte di Springer Science+Business Media springer.com Springer-Verlag Italia 2013 Realizzazione editoriale: Scienzaperta, Novate Milanese (MI) Copertina: Simona Colombo, Milano Springer-Verlag Italia S.r.l., Via Decembrio 28, I Milano

4 Prefazione Perché questo manuale? La microbiologia predittiva è la branca della microbiologia degli alimenti che si occupa dello sviluppo di modelli matematici per prevedere la crescita, la sopravvivenza e l inattivazione dei microrganismi. In quasi cento anni di storia dai primi modelli per l inattivazione sviluppati all inizio del secolo scorso, fino alla creazione di database relazionali e sistemi esperti e alla diffusione di modelli quantitativi per l analisi del rischio negli ultimi decenni questa disciplina ha assunto un importanza crescente nella valutazione del rischio microbiologico e nella progettazione e ottimizzazione dei processi dell industria alimentare, vedendo riconosciuto il proprio ruolo nella recente legislazione comunitaria con il Regolamento (CE) 2073/2005 (e successive modificazioni). La letteratura scientifica in materia di microbiologia predittiva diventa sempre più ricca e sono disponibili eccellenti testi, come quelli di McKellar e Lu 1 e di Brul e colleghi 2, nonché numerose review su prestigiose riviste scientifiche. Tuttavia, sia i libri sia gli articoli scientifici sono spesso destinati a un target composto prevalentemente da ricercatori ed esperti con un ottima padronanza della lingua inglese e delle principali tecniche statistiche e matematiche, oltre che di una solida conoscenza microbiologica. Questo libro è destinato a un pubblico ampio studenti universitari, professionisti e ricercatori in primo luogo, ma anche responsabili e tecnici dei settori ricerca e sviluppo delle aziende alimentari e non necessariamente esperto ; affronta quindi la disciplina in maniera orientata al problem solving, fornendo le informazioni essenziali per la progettazione di esperimenti, la raccolta e l analisi dei dati, la formulazione di modelli, l utilizzo degli strumenti informatici e l interpretazione dei risultati ottenuti. Data l importanza crescente della microbiologia predittiva per l industria alimentare e la salute pubblica, sorprende che nel nostro Paese moduli o insegnamenti formali che trattano tale materia siano attivi attualmente (primavera 2013) solo presso alcune delle sedi universitarie che offrono lauree magistrali in Scienze e Tecnologie Alimentari. In particolare, nelle Università degli Studi di Bari, Bologna, Foggia, Firenze, Parma, Potenza e Udine questa disciplina viene trattata in moduli che vanno da due a sei crediti formativi (la maggioranza 1 McKellar RC, Lu X (eds) Modeling microbial responses in food. CRC Press, Boca Raton, Brul S, Van Gerwen S, Zwietering MH (eds) Modelling microorganisms in food. CRC Press, Boca Raton, 2007.

5 VI Prefazione prevede tre crediti formativi, riservando ampio spazio alle esercitazioni). Confidiamo che la disponibilità di un libro di testo possa conseguire, tra gli altri obiettivi, anche quello di incrementare significativamente l offerta formativa nell ambito delle lauree triennali e magistrali e dei master di primo e secondo livello. Per quanto riguarda gli operatori del settore alimentare, questo libro rappresenta un valido supporto per quanti lavorano nell area di ricerca e sviluppo e per i responsabili dell assicurazione di qualità, come suggerito dal Regolamento (CE) 2073/2005. Gli strumenti della microbiologia predittiva sono da tempo in uso nei laboratori di ricerca e sviluppo di molte multinazionali del settore alimentare (che hanno contribuito in maniera fondamentale allo sviluppo di alcuni dei software e dei database utilizzati in questo campo), mentre la loro diffusione nelle piccole e medie aziende è tuttora limitata. Per tale motivo, ci siamo sforzati di realizzare un testo che potesse essere utile ai ricercatori, ai tecnici e ai professionisti operanti in realtà di dimensioni minori, fornendo loro le basi teoriche e pratiche per accedere facilmente a tutti gli strumenti on line già disponibili e per progettare esperimenti, da semplici a complessi, per la valutazione della sicurezza igienica di alimenti e processi, l ottimizzazione della formulazione di nuovi alimenti, la valutazione della shelf life dei prodotti e la valutazione qualitativa e quantitativa del rischio microbiologico. L impostazione del testo è quindi sostanzialmente didattica e applicativa: senza sacrificare la qualità e la correttezza scientifica dei contenuti, viene fornito un quadro completo della disciplina, fruibile a diversi livelli, e la ricca bibliografia aggiornata consente di approfondire tutti gli argomenti presentati. Anche se una buona formazione di base in microbiologia degli alimenti e alcuni fondamenti di matematica e statistica sono certamente utili per il lettore, i concetti essenziali per la comprensione degli argomenti sono ripresi più volte nel corso della trattazione. Organizzazione del volume Il libro è articolato in quattordici capitoli, molti dei quali sono corredati da materiale per le esercitazioni pratiche scaricabile dal sito con numerosi esempi passo-passo, che accompagnano i lettori nella progettazione, esecuzione e analisi di esperimenti di microbiologia predittiva. Il primo capitolo cui ha contribuito uno dei ricercatori più prestigiosi del settore fornisce un ampia panoramica della materia e delinea il quadro scientifico, storico, ma anche filosofico, entro il quale si è sviluppata la microbiologia predittiva, dalle origini ai giorni nostri. I capitoli 2 e 3 presentano i concetti basilari della microbiologia predittiva. Nel capitolo 2 sono richiamati i principi di ecologia microbica quantitativa degli alimenti, ponendo in evidenza gli effetti dei principali fattori tecnologici e ambientali considerati nell industria alimentare sulla crescita e sulla sopravvivenza dei microrganismi. Il capitolo 3 introduce i concetti fondamentali della modellazione dei fenomeni biologici e delinea i passaggi logici e operativi necessari tra l acquisizione dei dati sperimentali e la costruzione di modelli, empirici prima e meccanicistici poi; nello stesso capitolo è anche sintetizzata la classica distinzione tra modelli primari, secondari e terziari, che sarà ripresa nei capitoli successivi.

6 Prefazione VII I capitoli 4 e 5 sono prevalentemente dedicati alla descrizione dettagliata dei modelli primari per la crescita, l inattivazione e la sopravvivenza dei microrganismi. Il capitolo 4 presenta i principali modelli primari per la crescita microbica e fornisce le basi per la pianificazione e l esecuzione di esperimenti di modellazione della crescita. Questo capitolo è fondamentalmente indirizzato alla valutazione delle variazioni nel tempo della numerosità delle popolazioni microbiche (o di un parametro a esse associato) in condizioni in cui tutte le variabili fisiche, chimiche e ambientali sono strettamente controllate. Vengono inoltre discusse le metodologie per la raccolta delle osservazioni sperimentali necessarie per la costruzione di modelli. Sono infine descritti i principali modelli empirici (come l equazione di Gompertz) e i più importanti modelli meccanicistici (come quello di Baranyi e Roberts), per terminare con la discussione di modelli dinamici, e in particolare di quelli in grado di integrare gli effetti di temperature variabili. Il capitolo 5 è dedicato ai modelli utilizzati per descrivere la diminuzione del numero di microrganismi, sia quando è determinata dall applicazione di processi di sanificazione come i trattamenti termici, che causano direttamente la morte delle cellule sia quando è dovuta alla persistenza di condizioni sfavorevoli non solo alla moltiplicazione dei microrganismi, ma anche alla loro sopravvivenza (inattivazione). Oltre ai classici e tradizionali modelli applicati nell industria (basati sulle cinetiche di morte di primo ordine), in questo capitolo sono descritti gli approcci emersi negli ultimi anni, che rendono conto delle cinetiche non lineari o probabilistiche dell abbattimento microbico, con particolare enfasi sull inattivazione causata da trattamenti termici, senza dimenticare i modelli di inattivazione con altri trattamenti fisici. I capitoli 6, 7 e 8 sono dedicati, rispettivamente, ai modelli per la valutazione dell effetto delle condizioni ambientali sui parametri dei modelli primari di crescita, alla modellazione probabilistica della crescita/assenza di crescita e ai cosiddetti modelli terziari, cioè strumenti informatici per la microbiologia predittiva Nel capitolo 6 sono discussi i modelli secondari, nei quali i parametri della crescita microbica sono descritti in relazione al variare di parametri fisico-chimici e ambientali. In questo contesto viene anche presentato il cosiddetto gamma concept, cioè l impostazione metodologica secondo la quale l effetto dei diversi fattori che influiscono sulle performance microbiche è di tipo additivo. Nello stesso capitolo vengono inoltre esaminati alcuni aspetti di grande importanza pratica per chi voglia applicare la microbiologia predittiva a prodotti reali, come l adozione di disegni sperimentali per valutare l effetto contemporaneo di più variabili e l utilizzo di modelli cardinali. Sono infine discusse alcune applicazioni delle reti neuronali artificiali e di modelli che prevedono la modellazione secondaria in condizioni dinamiche. Il capitolo 7 è in gran parte dedicato all applicazione di modelli per la valutazione della probabilità che un evento abbia luogo, e in particolare ai modelli logit applicati all esplorazione della cosiddetta interfaccia sviluppo/non sviluppo dei microrganismi in rapporto alle condizioni fisico-chimiche che connotano l ambiente. Si tratta di un tema di fondamentale importanza per l individuazione delle combinazioni di fattori che prevengono in maniera assoluta la sopravvivenza o la crescita di microrganismi patogeni. Il capitolo 8 passa in rassegna i principali software e database per la microbiologia predittiva attualmente disponibili. I diversi strumenti, stand alone e on line, vengono approfonditamente discussi, descrivendone le peculiarità, le potenzialità e le fondamentali modalità di utilizzo

7 VIII Prefazione I capitoli 9, 10 e 11 mettono in relazione le conoscenze fornite nei capitoli precedenti con le tecniche utilizzate nella produzione e nello sviluppo dei prodotti alimentari e nella valutazione della loro sicurezza. Nel capitolo 9 i modelli predittivi per la crescita si integrano con i fenomeni fisici e chimico-fisici connessi ai materiali e alle tecnologie di confezionamento, per la realizzazione di packaging in grado di prevenire la contaminazione microbica ed estendere la shelf life dei prodotti Il capitolo 10 illustra il ruolo determinante dei modelli per l inattivazione e la sopravvivenza microbica nella progettazione e nel dimensionamento degli impianti per i trattamenti termici, tuttora fondamentali per l industria alimentare. Il capitolo 11 è specificamente dedicato all utilizzo dei modelli qualitativi e quantitativi per la valutazione del rischio microbiologico, un settore che sta assumendo una rilevanza sempre maggiore nell ambito della sicurezza alimentare. Gli ultimi tre capitoli forniscono alcuni richiami di statistica per la microbiologia predittiva, utili per la consultazione del volume. Nel capitolo 12 sono richiamati alcuni fondamentali concetti statistici, necessari per la progettazione dei disegni sperimentali e la rappresentazione dei risultati. Il capitolo 13 fornisce una base sistematica sulle procedure di regressione lineare, non lineare e logistica. Il capitolo 14 è dedicato all utilizzo di R, un ambiente open source per l analisi statistica particolarmente adatto alle esigenze della modellazione. I materiali scaricabili dal sito e le relative modalità di accesso sono presentati a fine volume, nell indice degli Allegati on line. Ringraziamo in primo luogo tutti i colleghi che hanno voluto partecipare con noi alla non semplice preparazione di questo testo, condividendo lo sforzo di tradurre in un linguaggio comprensibile a studenti e operatori del settore argomenti apparentemente astratti o tradizionalmente confinati a una cerchia di addetti ai lavori. Un ringraziamento particolare ad Angela Tedesco, per averci pazientemente supportato durante il lungo tragitto necessario per la realizzazione di questo libro, e alla casa editrice Springer, per averne compreso l importanza. Infine, saremo riconoscenti a tutti i colleghi e i lettori che vorranno segnalarci i loro commenti e suggerimenti. Aprile, 2013 Fausto Gardini Eugenio Parente

8 Indice 1 La microbiologia predittiva tra passato e futuro... 1 József Baranyi, Elena Cosciani-Cunico 1.1 Cenni storici Gli ingredienti per la microbiologia predittiva I modelli primari dinamici Struttura matematica Interpretazione biologica Errore moltiplicativo e accuratezza della predizione Prevedere il futuro della microbiologia predittiva Bibliografia Fattori che influenzano il metabolismo dei microrganismi negli alimenti Francesca Patrignani, Giulia Tabanelli 2.1 Introduzione Fattori intrinseci ph e potere tampone del mezzo Attività dell acqua (a w ) Potenziale di ossido-riduzione Presenza o assenza di ossigeno Composizione del mezzo Presenza di antimicrobici naturali Struttura del mezzo Fattori estrinseci Temperatura di conservazione Umidità relativa dell ambiente Fattori di processo Trattamenti ad alte temperature Controllo delle atmosfere di conservazione Conservanti Processi alternativi ai trattamenti termici Fattori impliciti Bibliografia... 34

9 X Indice 3 Principi di modellazione in microbiologia Eugenio Parente 3.1 Esperimenti e modelli: Alice e il bruco Da semplice a complesso, da empirico a meccanicistico I livelli della modellazione in microbiologia predittiva Conclusioni Appendice: Simboli e sigle utilizzati nel capitolo Bibliografia Modelli primari per la crescita microbica Eugenio Parente 4.1 La crescita microbica Modi di crescita La curva di crescita Dal laboratorio agli alimenti: progettazione e realizzazione di esperimenti per la modellazione della cinetica di crescita La teoria della crescita esponenziale Modelli empirici, dinamici e meccanicistici per la curva di crescita Modelli empirici Modelli dinamici e meccanicistici per la crescita Modello trilineare (o trifasico) di Buchanan e colleghi Modello dinamico (D-model) di Baranyi e Roberts Modelli dinamici multicompartimento Modelli dinamici per la crescita, il consumo di substrati e la produzione di metaboliti Modelli di crescita per due o più popolazioni: modellazione della competizione e dell amensalismo Gli approcci stocastici per la modellazione della fase lag In definitiva: quale modello? Appendice: Simboli e sigle utilizzati nel capitolo Bibliografia Modellazione delle cinetiche di inattivazione cellulare Fausto Gardini, Sylvain L. Sado Kamdem 5.1 Introduzione L approccio classico: cinetiche di primo ordine Cinetiche non lineari Il modello di Weibull Il modello lognormale I modelli di Baranyi e Roberts e di Gompertz

10 Indice XI 5.4 Adattabilità a condizioni non isoterme Il modello dinamico di Weibull Modellazione dell inattivazione Modellazione di trattamenti non termici Come realizzare curve di abbattimento termico Appendice: Principali simboli e sigle utilizzati nel capitolo Bibliografia Modelli secondari per lo sviluppo microbico Fausto Gardini, Eugenio Parente 6.1 Introduzione La raccolta e l analisi dei dati per i modelli secondari Disegni sperimentali Validazione e scelta dei modelli secondari Equazioni polinomiali Il modello di Ratkowsky Gamma concept e modelli cardinali Interazioni tra diversi fattori Modelli basati sull equazione di Arrhenius Modelli secondari per la fase lag Reti neuronali artificiali Modelli secondari dinamici: modellazione della crescita o della morte in condizioni dinamiche Appendice: Principali simboli e sigle utilizzati nel capitolo Bibliografia Modelli probabilistici per la microbiologia degli alimenti Fausto Gardini, Rosalba Lanciotti 7.1 Introduzione Modelli logit Modelli logit modificati Un caso di studio Bibliografia Modelli terziari: software e database per la microbiologia predittiva Eugenio Parente, Annamaria Ricciardi 8.1 Dai dati alle interfacce Database e interfacce di database Interfacce di modelli ComBase Predictor Pathogen Modeling Program

11 XII Indice Sym Previus Applicazioni specifiche Strumenti di calcolo per l elaborazione di dati e per la creazione di modelli primari e secondari Conclusioni e prospettive Bibliografia Ruolo del packaging nel controllo delle alterazioni microbiche degli alimenti Luciano Piergiovanni, Sara Limbo 9.1 Introduzione Prevenzione della contaminazione microbica Contaminazione del packaging e proprietà di superficie Ermeticità del packaging Regolazione della crescita microbica Teoria della permeazione degli aeriformi Parametri di misura della permeabilità Velocità di trasmissione dei gas Velocità di trasmissione del vapor d acqua Modelli predittivi di concentrazioni critiche di ossigeno Modelli predittivi di assorbimenti critici di umidità Imballaggi attivi per inibire la crescita microbica Assorbitori di ossigeno Imballaggi antimicrobici Appendice: Principali simboli e sigle utilizzati nel capitolo Bibliografia Modellazione del trasferimento termico e della cinetica di morte termica Mauro Moresi 10.1 Introduzione Cinetica di morte termica Processi industriali per il trattamento termico degli alimenti Esempi di processi di sterilizzazione Alimenti sfusi omogenei Sospensioni alimentari sfuse Alimenti confezionati omogenei Sospensioni alimentari confezionate Curve di morte termica non convenzionali Esempio di processo di sterilizzazione con cinetica di morte microbica generalizzata Conclusioni Appendice: Principali simboli e sigle utilizzati nel capitolo Bibliografia

12 Indice XIII 11 Microbiologia predittiva e valutazione del rischio microbiologico nel settore alimentare Nicoletta Belletti, Sara Bover-Cid 11.1 Introduzione La valutazione del rischio microbiologico Identificazione del pericolo Caratterizzazione del pericolo (caratterizzazione dose-risposta) Valutazione dell esposizione Caratterizzazione del rischio Differenti approcci alla VRM L approccio qualitativo L approccio quantitativo Variabilità e incertezza nella VQRM Strumenti informatici per la VRM Conclusioni Bibliografia Test statistici, analisi della varianza e disegni sperimentali Vincenzo Trotta 12.1 Applicazione dei test statistici Il χ 2 come indice di dispersione Campionamento da una distribuzione normale Distribuzione t di Student Stima dell intervallo fiduciario di μ Confronto tra due campioni Distribuzione F di Fisher Confronto tra le medie di più campioni Modelli lineari ANOVA multifattoriali Analisi della varianza fattoriali Analisi della varianza gerarchiche (nested ANOVA) Disegni sperimentali Disegni a blocchi completamente randomizzati Disegni a blocchi randomizzati generalizzati Disegni con misure ripetute Disegni parzialmente nested Modelli lineari generalizzati Bibliografia Procedure di regressione lineare e non lineare Carlo Trivisano, Enrico Fabrizi 13.1 Introduzione Stima dei parametri e inferenza: modello di regressione lineare

13 XIV Indice 13.3 Stima dei parametri e inferenza: modello di regressione non lineare Modelli di regressione per variabili binarie (probabilità) Bibliografia La regressione in R Carlo Trivisano, Enrico Fabrizi, Vincenzo Trotta 14.1 Introduzione Regressione lineare e non lineare in R Regressione logistica in R Bibliografia Indice degli Allegati on line Indice analitico Gli indirizzi internet citati nel testo e nelle bibliografie dei capitoli sono stati verificati nel mese di aprile 2013.

14 Elenco degli Autori József Baranyi Institute of Food Research Norwich Research Park Norwich, United Kingdom Nicoletta Belletti IRTA Food Safety Programme Monells, España Sara Bover-Cid IRTA Food Safety Programme Monells, España Elena Cosciani-Cunico Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell Emilia-Romagna Brescia Enrico Fabrizi Dipartimento di Scienze Economiche e Sociali, Università Cattolica del Sacro Cuore Piacenza Fausto Gardini Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroalimentari Università degli Studi di Bologna Bologna Rosalba Lanciotti Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroalimentari Università degli Studi di Bologna Bologna Sara Limbo Dipartimento di Scienze per gli Alimenti, la Nutrizione e l Ambiente DeFENS Università degli Studi di Milano Milano Mauro Moresi Dipartimento per l Innovazione dei Sistemi Biologici, Agroalimentari e Forestali (DIBAF) Università degli Studi della Tuscia Viterbo Eugenio Parente Scuola di Scienze Agrarie, Forestali, Alimentari ed Ambientali, Università degli Studi della Basilicata Potenza Istituto di Scienze dell Alimentazione, CNR Avellino Francesca Patrignani Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroalimentari Università degli Studi di Bologna Bologna Luciano Piergiovanni Dipartimento di Scienze per gli Alimenti, la Nutrizione e l Ambiente DeFENS Università degli Studi di Milano Milano Annamaria Ricciardi Scuola di Scienze Agrarie, Forestali, Alimentari ed Ambientali, Università degli Studi della Basilicata Potenza

15 XVI Sylvain L. Sado Kamdem Departément de Biochimie Faculté des Sciences Université de Yaoundé Yaoundé, Cameroun Giulia Tabanelli Centro Interdipartimentale di Ricerca Industriale agroalimentare (CIRI) Università degli Studi di Bologna Bologna Carlo Trivisano Dipartimento di Scienze Statistiche Università degli Studi di Bologna Bologna Elenco degli Autori Vincenzo Trotta Dipartimento di Scienze Università degli Studi della Basilicata Potenza