Le basi gene*che dell autofagia

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1 Le basi gene*che dell autofagia 8 maggio 2017 Seminari Laboratorio di Gene*ca Molecolare Umana Prof. Zollo Dr. Susanna Ambrosio Federico II Naples

2 Il ricercatore giapponese Yoshinori Ōhsumi, vincitore il p r e m i o N o b e l p e r l a Medicina nel 2016 «per le sue scoperte dei meccanismi di autofagia» «Il corpo umano vive adraverso questo processo di autodecomposizione, che è una forma di cannibalismo. Cerca di mantenere un equilibrio delicato fra costruzione e distruzione. E questo è quello che in fondo caraderizza la vita» (Yoshinori Ōhsumi)

3 L autofagia man*ene le cellule pulite Le scoperte di Ohsumi, hanno aperto la strada alla comprensione dell'importanza dell'autofagia in diversi processi cellulari fondamentali, come quelli in risposta alle infezioni, nonché al suo ruolo nell'insorgenza di patologie, comprese le malattie neurodegenerative e il cancro.

4 Cos è l autofagia? È un processo catabolico adraverso il quale la cellula si libera delle parq danneggiate di se stessa, avviandole alla degradazione lisosomiale. È un meccanismo essenziale per le nostre cellule che permede la degradazione e il riciclo dei componen* cellulari, nonché lo smalqmento di baderi e virus intracellulari nel corso di un'infezione. A livelli basali è agva in tuhe le cellule e permede il fisiologico turnover di proteine e organelli, contrastando il processo dell'invecchiamento cellulare. Può essere tudavia regolata da diversi s*moli extracellulari, quali vari Qpi di stress, livelli di ormoni e fadori di crescita e carenza di nutrienq.

5 Tipi di Autofagia MACROAUTOFAGIA: è il meccanismo principale, finalizzato allo smalqmento di organuli e proteine danneggiaq. QuesQ vengono inglobaq da un autofagosoma e, dopo che esso si fonde con un lisosoma, vengono degradaq dagli enzimi lisosomiali. MICROAUTOFAGIA: il materiale citoplasmaqco da degradare è diredamente inglobato dal lisosoma adraverso delle invaginazioni della membrana lisosomiale. AUTOFAGIA CHAPERONE- MEDIATA: è un processo complesso in cui le proteine da degradare si legano ad un chaperone molecolare che le marca e fa sì che esse vengano riconosciute e smalqte dal lisosoma

6 MACROAUTOFAGIA È il meccanismo autofagico principale, finalizzato allo smalqmento di organuli e proteine danneggiaq o vecchi. QuesQ vengono inglobaq da un autofagosoma, una strudura delimitata da doppia membrana, e, dopo che esso si fonde con un lisosoma, vengono degradaq dagli enzimi lisosomiali. Una volta digerito in macromolecole semplici, il contenuto dell autolisosoma viene rilasciato nel citoplasma, in modo che la cellula possa riciclarlo.

7 Vacuoli autofagici visq al TEM ADraverso la microscopia elehronica è possibile seguire la stadiazione dei vacuoli autofagici. Questa tecnica permede l osservazione del contenuto dei vacuoli e la loro localizzazione nella cellula. AVi= vacuolo autofagico iniziale; si caraderizza per la presenza della doppia membrana e del contenuto ancora integro. AVd= vacuolo autofagico degrada*vo; si caraderizza per il contenuto parzialmente degradato, che appare più eledron- denso

8 La formazione dell autolisosoma è un processo multi-step: Lo step iniziale della maturazione di un autofagosoma consiste nella elongazione di una piccola strudura di membrana, chiamata fagoforo, che si riqene si origini dal reqcolo endoplasmaqco; questa si estende da entrambi i laq e si richiude adorno al target da eliminare, dando luogo all'autofagosoma. La nucleazione della vescicola che originera l autofagosoma dipende dall afvita della chinasi Vps34 (PI3K class III) e dalla sua associazione con le proteine Beclin 1 e p150/vps35. A questa operazione segue la chiusura dell autofagosoma operata da due sistemi di coniugazione simili all ubiquiqna (ATG5 ATG12 e LC3- II). Il primo è afvato da ATG7 e porta alla formazione di un complesso mulqmerico composto da ATG5 ATG12- ATG16, la cui azione è fondamentale per dirigere l inserimento della proteina LC3 nella membrana dell autofagosoma. Dopo la formazione di una strudura sferica, il complesso ATG12- ATG5- ATG16L1 dissocia dagli autofagosomi. LC3 è cleavato dalla proteasi ATG4, liberando LC3 citosolico e permedendo la fusione finale dell autofagosoma con il lisosoma, adraverso le proteine LAMP.

9 La formazione di LC3- II come marker autofagico LC3 è comunemente usato come marker di formazione autofagosomica in immunocitochimica, poiché è parte essenziale delle vescicole e resta associato a queste fino al momento della fusione con il lisosoma. LC3 viene inizialmente sinte*zzato come precursore citosolico (prolc3), per essere poi successivamente processato a LC3- I da ATG4 La forma agva citosolica di LC3 (LC3I) viene modificata nella forma LC3- II che interagisce e si coniuga con la fosfa*diletanolammina (PE). Questa coniugazione induce una modificazione conformazionale in LC3 che è essenziale per il suo legame alla membrana dei corpi autofagici. Il complesso LC3- fosfa*dil- etanolammina (LC3- PE) posto sull'esterno della membrana è rimosso prima della fusione con i lisosomi, mentre quello localizzato all'interno della membrana rimane rilevabile fino alla degradazione da parte delle idrolasi.

10 La formazione di LC3- II come marker autofagico Per Western Blofng è possibile monitorare i livelli di LC3- II (sodo- forma lipidata) poiché migra più velocemente nell SDS page rispedo alla forma solubile. L aumento di LC3- II, tudavia, può derivare sia da un aumentata formazione di autofagosomi che dal blocco della loro degradazione.

11 Aumento di LC3- II: nuova formazione o accumulo di autofagosomi?

12 Per determinare se un parqcolare tradamento X altera il completo flusso autofagico, bisogna paragonare il tradamento X più il tradamento con un inibitore lisosomiale (Bafilomycin) ai tradamenq singoli: NT rispeho a Baf=livelli basali di autofagia. L aumento di livelli di LC3- II in presenza di Bafilomycin è indicaqvo di un flusso autofagico basale. X+Baf>X. Un effedo addiqvo nei livelli di LC3- II in presenza di Bafilomycin può indicare che il trahamento X agva il flusso autofagico. X+Baf>Baf. Livelli di LC3- II più alq nel tradamento X insieme alla Bafilomycin rispedo a Bafilomycin sa sola possono indicare che il trahamento X aumenta la sintesi di autofagosomi. X+Baf=X. Se il tradamento X aumenta i livelli di LC3- II ma non si osservano differenze tra tradamento X da solo e in combinazione con Bafilomycin allora il trahamento X induce un blocco autofagico alla fine del processo (fusione con lisosoma). X+Baf=Baf. Se il tradamento X da solo aumenta i livelli di LC3- II, ma il tradamento X insieme alla Bafilomycin non aumenta ulteriormente rispedo alla Bafilomycin da sola, questo indica che il trahamento X induce un blocco completo del flusso autofagico (dalla formazione dell autofagosoma).

13 mcherry- GFP- LC3 Autophagy reporter

14 mcherry- GFP- LC3 Autophagy reporter AUTOFAGIA BASALE INDUZIONE DI AUTOFAGIA BLOCCO DI AUTOFAGIA Questo saggio è ad oggi considerato il più affidabile per determinare e monitorare cambiamen* nel flusso autofagico in seguito a determina* trahamen*.

15 Com è regolata l autofagia?

16 L autofagia è regolata da diversi pathway molecolari che determinano l'afvazione enzimaqca di un complesso mulqproteico regolatorio (contenente formato Vps34, Beclin1, Vps15, Ambra1 e Atg14) che facilita il reclutamento di altre proteine ATG, tra cui LC3, sul nascente autofagosoma. Stress s*muli Starva*on c- Jun N- terminal kinases mtor AMPK ULK1 FORMAZIONE DI AUTOFAGOSOMI

17 JNK- 1 agva l autofagia in seguito a stress ossida*vo L autofagia è attivata da importanti pathway di signalling cellulare, inclusi pathway di risposta allo stress, tra cui quello di JNK-1, che promuove l autofagia fosforilando Bcl-2, e di conseguenza promuovendo l interazione di Beclin-1 con VPS34, in seguito a stress ossidativo. Beclin- 1 VPS34 Autophagy

18 mtorc1 è un interruhore del metabolismo cellulare Il principale regolatore negaqvo dell autofagia è mtorc1, un complesso spesso è descrido come un sensore della disponibilità di nutrienq. In condizioni di abbondanza di nutrienq infaf, il complesso mtorc1 è afvo e fosforila le proteine ULK (ULK1 e ULK2), inafvandole. In mancanza di nutrienq, mtorc1 viene inibito, con conseguente defosforilazione e all afvazione di ULK1 e ULK2 e alla loro localizzazione nei pressi del fagoforo.

19 mtorc1 regola l autofagia a livello trascrizionale ahraverso TFEB MTORC1 INHIBITOR CONTROL

20 Crosstalk tra autofagia e apoptosi In seguito ad uno stress, la cellula induce molto rapidamente l autofagia come meccanismo di sopravvivenza, nel tentaqvo di rimuovere il danno. Se il danno è troppo grave, successivamente viene indoda l apoptosi (morte programmata di Qpo I). L autofagia può diventare a sua volta un «vero» meccanismo di morte quando, ad esempio, l apoptosi non funziona o è inibita. La permanenza di un danno irreparabile porta ad una afvazione prolungata dell autofagia che causa una forma parqcolare di morte programmata cellulare (definita di Qpo II). I componenq del macchinario apoptoqco possono avere un impado importante sull autofagia adraverso interazioni molecolari con proteine Qpiche dell autofagia. L esempio meglio caraderizzato di questa relazione è la doppia funzione della proteina Bcl- 2 nell inibizione di entrambi i pathway.

21 Ruolo dell autofagia nel cancro Il contributo dell autofagia nel cancro è estremamente complesso; tale processo puo avere sia la funzione di promotore che di soppressore tumorale. Questo paradosso puo essere spiegato con i disqnq ruoli che l autofagia puo assumere durante la progressione del tumore, a seconda del Qpo di tumore, del contesto e della stadiazione. Mentre evidenze geneqche suggeriscono la funzione di tumor suppressor dell autofagia negli stadi iniziali della trasformazione tumorale, ci sono altredante prove che l autofagia può anche essere uqlizzata dalle cellule tumorali come meccanismo di sopravvivenza durante durante la progressione tumorale e la metastasi.

22 The Lysine- specific demethylase 1 (LSD1) is a epigene*c regulator of transcrip*on found in both repressor and ac*vator complexes. CoREST NuRD PKC AR ER LSD1 LSD1 LSD1 LSD1 K4me 2 K4me 2 K9me 2 K9me 2 H3 H3 REPRESSION ACTIVATION

23 LSD1 inhibi*on strikes mtorc1 ac*vity

24 LSD1 inhibi*on induces TFEB nuclear localiza*on

25 LSD1 inhibi*on leads to LC3 lipida*on

26 mcherry- GFP- LC3 Autophagy reporter

27 SESTRIN2 (SESN2) is involved in mtorc1 pathway (up- regulated gene in RNA- seq) SESN2 member of the sestrin family of PA26- related proteins involved in cellular response to different stress condi*ons nega*vely regulates mtorc1 ac*vity

28 Sestrin2 is a LSD1 nega*ve target gene LSD1 H3Ac H3K27me3 % input Kb TSS % input Kb TSS % input Kb TSS Ctrl TCP silsd1 sictrl

29 SESN2 overexpression recapitulates the effects of LSD1 inhibi*on

30 Silencing SESN2 reduces autophagy induced by LSD1 inhibi*on

31 Conclusions: 1) LSD1 binds the promoter region of SESN2 gene and inhibits its expression. 2) LSD1 inhibi*on relieves SESN2 repression with concomitant block of mtorc1 ac*vity and autophagy induc*on in NB cells. LSD1 LSD1 targe*ng LSD1 SESN2 SESN2