Bioinformatica (3) Banche dati biologiche. Dott. Alessandro Laganà
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1 Bioinformatica (3) Banche dati biologiche Dott. Alessandro Laganà
2 Banche dati biologiche Organismi e sequenze biologiche Rappresentazione digitale dei dati biologici e formati Banche dati generiche: NCBI, EMBL, DDBJ NCBI: Entrez, Nucleotide, Gene, Protein BLAST Pubmed 2 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
3 Gli organismi viventi: classificazione Nelle scienze biologiche la classificazione è un concetto che si riferisce alle modalità con le quali i biologi raggruppano e categorizzano gli organismi viventi. La filogenesi è il processo evolutivo degli organismi viventi dalla loro comparsa sulla terra a oggi La classificazione filogenetica è un sistema artificiale che consente di identificare i gruppi tassonomici degli organismi viventi sulla base dei loro rapporti evolutivi 3 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
4 Gli organismi viventi: classificazione La moderna classificazione scientifica è il frutto della categorizzazione operata da Linneo e riletta secondo le teorie di Darwin Col sistema linneano ogni organismo viene posizionato, mediante una scala gerarchica, in una serie di gruppi tassonomici, detti taxa (taxon al singolare). Le suddivisioni principali, dal più generico al più specifico, sono: Dominio, Regno, Phylum, Classe, Ordine, Famiglia, Genere e Specie. 4 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
5 Classificazione: esempi Drosophila melanogaster (moscerino della frutta) Dominio Regno Eukaryota Animalia Homo sapiens Dominio Eukaryota Regno Animalia Phylum Chordata Phylum Arthropoda Classe Mammalia Classe Insecta Ordine Primates Ordine Famiglia Genere Diptera Drosophilidae Drosophila Famiglia Genere Hominidae Homo Specie melanogaster Specie sapiens 5 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
6 Organismi: nomenclatura La nomenclatura binomiale è una convenzione standard utilizzata in biologia per conferire il nome ad una specie. Il nome scientifico di una specie viene coniato dalla combinazione di due nomi: il nome del genere a cui appartiene la specie un epiteto che caratterizza e distingue quella specie dalle altre appartenenti a quel genere. Il primo termine (nome generico) porta sempre l' iniziale maiuscola, mentre il secondo termine (nome specifico) viene scritto in minuscolo; entrambi i nomi vanno inoltre scritti in corsivo 6 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
7 Nomenclatura: esempi Genere Specie Nome comune Apis mellifera Ape Arabidopsis thaliana Arabetta comune Bombyx mori Baco da seta Bos taurus Toro Canis familiaris Cane domestico Drosophila melanogaster Moscerino della frutta Gallus gallus Gallo Homo sapiens Uomo Macaca mulatta Macaco Mus musculus Topo Ovis aries Pecora Pan troglodytes Scimpanzè Rattus norvegicus Ratto Zea mays Mais 7 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
8 I Geni Il gene è l unità ereditaria e funzionale degli organismi viventi; ad esso sono associate molteplici informazioni: Analisi Filogenetica Struttura Sequenze omologhe in altri genomi Proteina (Funzione) Sequenza Localizzazione genomica 8 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
9 Le sequenze biologiche Le sequenze nucleotidiche vengono rappresentate mediante stringhe su un alfabeto di 4 caratteri (A, C, G, T), nelle quali ciascun carattere rappresenta un singolo nucleotide. Analogamente le sequenze proteiche (o aminoacidiche) vengono rappresentate mediante stringhe su un alfabeto di 20 caratteri, ciascuno dei quali rappresenta un singolo aminoacido. 9 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
10 L alfabeto di DNA e RNA A C G T DNA Adenina Citosina Guanina Timina A C G U RNA Adenina Citosina Guanina Uracile
11 L alfabeto delle proteine A Alanina C Cisteina D Acido Aspartico E Acido Glutammico F Fenilalanina G Glicina H Istidina I Isoleucina K Lisina L Leucina M Metionina N Asparagina P Prolina Q Glutammina R Arginina S Serina T Treonina Y Tirosina V Valina W Triptofano
12 Lo Standard IUB/IUPAC Acidi Nucleici A Adenina R G o A (Purine) B G T C C Citosina Y T o C (Pirimidine) D G A T G Guanina K G o T H A C T T Timina M A o C V G C A U Uracile W A o T N A C G T (Any) - Gap Aminoacidi A Alanina B Acido Aspartico o Asparagina C Cisteina D Acido Aspartico E Acido Glutammico F Fenilalanina G Glicina H Istidina I Isoleucina K Lisina L Leucina M Metionina N Asparagina P Prolina Q Glutammina R Arginina S Serina T Treonina U Selenocisteina V Valina W Triptofano Y Tirosina Z Acido Glutammico o Glutammina X Qualsiasi (Any) * Stop traduzione - Gap 12 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
13 Outline Organismi e sequenze biologiche Rappresentazione digitale dei dati biologici e formati Banche dati generiche: NCBI, EMBL, DDBJ NCBI: Entrez, Nucleotide, Gene, Protein BLAST Pubmed 13 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
14 Motivazioni Lo sviluppo delle biotecnologie molecolari ha portato alla produzione di enormi quantità di dati biologici. Le banche dati sono progettate come contenitori costruiti per immagazzinare dati in modo efficiente e razionale al fine di renderli facilmente accessibili a tutti gli utenti: ricercatori, medici, biologi, studenti, etc... Il fine ultimo è quello di recuperare ed analizzare questi dati mediante gli appositi tool di cui ciascun database dispone. 14 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
15 I Database Biologici Numerose sono oggi le banche dati biologiche esistenti: Banche dati primarie (sequenze nucleotidiche e aminoacidiche) Banche dati specializzate (domini e motivi proteici, strutture proteiche, geni, trascrittoma, profili di espressione, pathways metaboliche, etc) 15 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
16 Organizzazione delle banche dati Le banche dati biologiche raccolgono informazioni e dati derivati da: Letteratura; Analisi di laboratorio (in vitro e in vivo); Analisi bioinformatiche (in silico). Ogni banca dati è caratterizzata da un elemento biologico centrale che costituisce l oggetto intorno al quale viene costruita la entry principale della banca dati. 16 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
17 Organizzazione delle banche dati (2) Ciascuna entry raccoglie quindi le informazioni che caratterizzano l elemento centrale (attributi). Molte banche dati biologiche sono fruibili da parte della comunità scientifica in formato flat-file, cioè file sequenziali nei quali ogni classe di informazione è riportata su una o più linee consecutive identificate da un particolare codice. Tali file sono dunque semplici file di testo strutturati in modo tale da essere analizzabili mediante opportuni tool in grado di estrarre le informazioni di interesse. 17 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
18 Database e tool bionformatici La maggior parte delle banche dati mettono a disposizione dei tool bioinformatici per l elaborazione di questi dati, tra i quali: Tool per lo screening di banche dati (BLAST, FASTA); Tool per l allineamento multiplo di sequenze (ClustalW, AntiClustAl, T-Coffee, ProbCons ); Tool per l identificazione di esoni ed elementi regolativi che caratterizzano un gene Gene and Promoter Prediction (GenScan, Promoser, ); 18 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
19 Il problema della nomenclatura Uno dei principali problemi legati alle banche dati biologiche è quello della nomenclatura. Uno stesso gene può avere diversi nomi (Es. TRF2 è anche noto come TLP o TLF), o uno stesso nome può individuare diversi geni (Es. TRF sta per TBP Related Factor ma anche per Transferrina o ancora per Telomeric Repeat Binding Factor). Occorre quindi un modo per individuare univocamente i geni e le proteine, e per gestire la grande quantità di informazioni ad essi legate: nelle banche dati primarie ogni elemento (gene, sequenza, etc) è individuato univocamente da un accession number. 19 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
20 Outline Organismi e sequenze biologiche Rappresentazione digitale dei dati biologici e formati Banche dati generiche: NCBI, EMBL, DDBJ NCBI: Entrez, Nucleotide, Gene, Protein BLAST Pubmed 20 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
21 Banche dati primarie Le banche dati primarie contengono sequenze nucleotidiche (DNA e RNA) e aminoacidiche (proteine). Esistono tre banche dati primarie: GenBank (NCBI National Center for Biotechnology Information). EMBL datalibrary (EMBL European Molecular Biology Laboratory). DDBJ (DNA Database of Japan) Questi istituti cooperano tra loro al fine di condividere e rendere pubblicamente disponibili tutti i dati di cui dispongono e differiscono tra loro solamente per il formato con cui tali dati vengono rilasciati. 21 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
22 Outline Organismi e sequenze biologiche Rappresentazione digitale dei dati biologici e formati Banche dati generiche: NCBI, EMBL, DDBJ NCBI: Entrez, Nucleotide, Gene, Protein BLAST Pubmed 22 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
23 NCBI NCBI (National Center for Biotechnology Information) è l istituto americano che ospita GenBank, una delle tre banche dati primarie di sequenze nucleotidiche ( NCBI offre anche svariati strumenti per l analisi di dati biologici tra cui BLAST, un tool che permette di effettuare ricerche per similarità nei database di sequenze. 23 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
24 I principali DB di NCBI Gene Contiene dati inerenti i geni di tutte le specie caratterizzate, quali la struttura genica ed il contesto genomico, le ontologie, le interazioni con altri geni ed i link alle sequenze ed alla relative pubblicazioni scientifiche. Nucleotide Contiene le sequenze nucleotidiche di tutte le specie caratterizzate, siano esse codificanti o meno. Protein Ha la stessa struttura di Nucleotide ma è relativo alle sequenze aminoacidiche. Pubmed E il database delle pubblicazioni scientifiche di carattere biologico e biomedico. Per ogni articolo è disponibile l abstract. Pubmed Central contiene articoli completi scaricabili gratuitamente. 24 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
25 Entrez 25 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
26 Esempio di ricerca: BAX Ricerchiamo i dati relativi al gene BAX in Homo sapiens utilizzando Entrez:
27 Esempio: BAX Database: Gene
28 Esempio: BAX su Gene Informazioni generali La prima parte della pagina contiene il simbolo (BAX) ed il nome ufficiale del gene (BCL2-associated X protein). Vengono specificati il tipo di gene (Protein coding codificante per proteina), l organismo (Homo sapiens) e la tassonomia (lineage). Viene inoltre data una panoramica sulle funzioni principali del gene (summary). 28 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
29 Esempio: BAX su Gene Regioni genomiche, trascritti e prodotti In questa sezione viene mostrato il grafico della struttura del gene. Ogni riga rappresenta una variante di splicing (le varianti differiscono nel numero e nelle dimensioni degli esoni, indicati da rettangolini, gli introni sono rappresentati dalle linee sottili). I rettangolini (esoni) possono essere rossi (codificanti) o blu (non codificanti: UTR). A sinistra di ogni isoforma è presente il link alla sequenza nucleotidica dell mrna maturo relativo. A destra di ogni isoforma è presenta il link alla sequenza della proteina corrispondente. In alto è presente il link alla sequenza completa del gene (UTR, esoni ed introni). E possibile cliccare sui singoli elementi della figura per ottenere la sequenza relativa. 29 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
30 Esempio: BAX su Gene Contesto genomico Il grafico del contesto genomico mostra la regione genomica che contiene il gene ed i geni limitrofi. Le frecce indicano il filamento (destra: senso, sinistra: antisenso). In questo caso BAX si trova sul filamento senso. Interazioni con HIV ed altre proteine cellulari In una sezione successiva sono mostrate le interazioni della proteina BAX con HIV. Segue la lista delle interazioni note di BAX con tutte le proteine cellulari. Altre informazioni Di seguito sono riportati i fenotipi patologici correlati a BAX (Colorectal cancer e T-cell acute lymphoblastic leukemia), i link alle pathway in cui BAX è coinvolto (Database KEGG) e le annotazioni ontologiche di BAX (Processi, funzioni e localizzazione cellulare). 30 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
31 Selezionando nella tendina in alto (Display) la voce Gene Table, si ottiene la tabella numerica con le informazioni sulla struttura del gene. 31 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
32 Esempio: BAX su Nucleotide Cliccando sui link a sinistra delle isoforme, nella struttura genica, si può ottenere direttamente la sequenza dell mrna (In formato Fasta) o la pagina di Genbank relativa a BAX (Database Nucleotide). GenBank Informazioni generali Tra le informazioni più rilevanti troviamo il LOCUS (NM_138764), ovvero il codice identificativo univoco della sequenza, la lunghezza della sequenza (986 bp base pairs) ed il tipo di sequenza (mrna). Segue la lista delle pubblicazioni relative a BAX. Vengono dati dettagli sulle regioni della sequenza La sequenza codificante (CDS) è compresa tra 70 e 564. Ciò significa che le sequenze 5 UTR e 3 UTR andranno rispettivamente da 1 a 69 e da 565 a 986. In fondo alla pagina viene riportata la sequenza nucleotidica, alla quale si può accedere anche in formato FASTA cliccando sul link corrispondente nella stessa pagina, in alto. 32 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
33 Esempio: BAX su Protein Cliccando sui link a destra delle isoforme, nella struttura genica, si può ottenere direttamente la sequenza della proteina (In formato Fasta) o la pagina di GenPept relativa a BAX (Database Proteine). GenPept Informazioni generali Tra le informazioni più rilevanti troviamo il LOCUS (NP_620119), ovvero il codice identificativo univoco della sequenza e la lunghezza della sequenza (164 aa aminoacidi). Segue la lista delle pubblicazioni relative a BAX. In fondo alla pagina viene riportata la sequenza aminoacidica, alla quale si può accedere anche in formato FASTA cliccando sul link corrispondente nella stessa pagina, in alto. 33 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
34 Outline Organismi e sequenze biologiche Rappresentazione digitale dei dati biologici e formati Banche dati generiche: NCBI, EMBL, DDBJ NCBI: Entrez, Nucleotide, Gene, Protein BLAST Pubmed 34 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
35 Una delle operazioni più comuni ed utili su una base di dati biologica è la ricerca di sequenze simili ad una sequenza data in input. Il tool più popolare per questo tipo di ricerche è BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). BLAST esegue confronti fra coppie di sequenze alla ricerca di regioni di similarità, piuttosto che un allineamento globale tra le intere sequenze. BLAST può eseguire migliaia di confronti fra sequenze in pochi minuti e in poco tempo è possibile confrontare una sequenza query con l intero database per ricercare tutte le sequenze simili ad essa. 35 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
36 L implementazione ufficiale dell algoritmo BLAST si trova sul sito dell NCBI: Sono disponibili numerosi tipi di BLAST; quelli su cui concentreremo la nostra attenzione sono: BLASTN (Nucleotidi Nucleotidi); BLASTP (Proteine - Proteine); TBLASTN (Translated BLAST Nucleotide); BL2SEQ (Blast 2 sequences). 36 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
37 - Selezioniamo nucleotide blast - Inseriamo la sequenza (o scegliamo un file da uploadare) - Scegliamo database e organismo - Scegliamo il programma (blastn) 37 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
38 E possibile utilizzare un filtro per mascherare segmenti a bassa complessità composizionale, ovvero il cui matching avrebbe scarso significato biologico. E possibile cambiare la soglia di significanza statistica. Ogni match trovato ha un valore di significanza statistica, che indica quanto è statisticamente probabile che quel match sia casuale. E possibile variare la soglia così che matches con significanza maggiore della soglia impostata non vengano visualizzati. Abbassando la soglia avremo in output un minor numero di matches ma più significativi, avendo eliminato tutti quei matches che hanno un alta probabilità di essere casuali. 38 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
39 E anche possibile cambiare la dimensione delle word della query che BLAST va a ricercare nel database (la minima lunghezza che rappresenta un match). Il valore di default per le sequenze nucleotidiche è 11, per quelle proteiche Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
40 Una volta settati i parametri, cliccando prima su BLAST e successivamente su FORMAT si ottiene il risultato della ricerca: 40 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
41 BLAST fornisce in output la distribuzione dei matches trovati, assegnando a colori diversi i diversi scores: ovviamente uno score maggiore indica un match più significativo. Cliccando sulle barre colorate si ottiene l allineamento corrispondente. 41 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
42 L allineamento migliore mostra un match del 100%: abbiamo ritrovato lo stesso BCL2 nel database. Abbiamo il link alla sequenza trovata ed alla pagina corrispondente in Gene. Un trattino indica il match dei caratteri delle due sequenze. 42 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
43 L assenza del trattino invece indica un mismatch: 43 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
44 BLASTP è la versione di BLAST per le proteine. Funziona esattamente come la versione per le sequenze nucleotidiche. TBLASTN confronta la proteina query con il database di sequenze nucleotidiche; per effettuare questo tipo di confronto viene utilizzato un database contenente tutte le sequenze nucleotidiche tradotte in sequenze aminoacidiche secondo tutte le possibili ORF, che sono 6 (3 per ciascun filamento). Queste vengono confrontate con la proteina query. I parametri sono essenzialmente gli stessi visti per BLASTN. 44 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
45 Blast2Seq è un tool della famiglia BLAST che permette di eseguire l allineamento di una coppia di sequenze utilizzando l algoritmo di allineamento locale di BLAST. 45 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
46 Diamo in input la sequenza della proteina TBP dell uomo e quella di TBP della Drosophila: 46 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
47 Blast2Seq: Risultati 47 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
48 La figura Dot Matrix mette in evidenza i segmenti allineati: in questo caso sono state allineate le parti C-terminali delle due sequenze, con identità pari all 89% (Il famoso dominio a sella mediante il quale TBP interagisce con il DNA e che risulta altamente conservato rispetto al resto della sequenza). 48 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
49 Ricercare i seguenti geni, e le relative proteine, su NCBI o Ensembl e blastare le sequenze ottenute per cercare eventuali omologie all interno della stessa specie (geni paraloghi) o in specie diverse (geni ortologhi): DIABLO in Drosophila melanogaster MAGED2 in Homo sapiens MAGED4 in Homo sapiens P53 in Homo sapiens P73 in Homo sapiens BCL2 in Homo sapiens 49 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
50 Outline Organismi e sequenze biologiche Rappresentazione digitale dei dati biologici e formati Banche dati generiche: NCBI, EMBL, DDBJ NCBI: Entrez, Nucleotide, Gene, Protein BLAST Pubmed 50 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
51 PubMed PubMed e una banca dati che permette di ottenere informazioni di tipo bibliografico nel campo della medicina e altre discipline di tipo biologico e naturalistico Il database contiene i riferimenti bibliografici a partire dagli anni 50 e viene aggiornato giornalmente Gli articoli provengono da riviste scientifiche di tutto il mondo ma la maggior parte delle voci sono in lingua inglese o hanno almeno il riassunto in inglese L accesso al testo completo degli articoli può essere gratuito o a pagamento a seconda della casa editrice PubMed è accessibile al seguente indirizzo: 51 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
52 PubMed 52 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
53 Risultati di una ricerca in PubMed Avviando una ricerca in PubMed viene mostrata una lista con i riferimenti bibliografici, in forma di semplici citazioni elencate in ordine cronologico di immissione nella banca dati con in testa i dati più recenti. Accanto ad ogni citazione compare un icona che segnala la presenza/assenza dell abstract e/o del full text: foglietto vuoto: citazione priva di abstract; foglietto scritto: citazione con abstract; foglietto evidenziato in verde: citazione con link al sito dell editore, che offre gratuitamente il full text; foglietto evidenziato in arancio e verde: citazione con full text disponibile nell'archivio centrale di PubMed. 53 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
54 Risultati di una ricerca in PubMed 54 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
55 L'uso dei limiti in PubMed 55 Bioinformatica (3): Banche dati biologiche
4. Ricerca di sequenze in banche dati e allineamento multiplo
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