Turn-over delle proteine

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1 Prof. Giorgio Sartor Turn-over delle proteine Copyright by Giorgio Sartor. All rights reserved. M07 - Versione 1.4 nov 2013 Turn-over delle proteine Le proteine cellulari vengono regolarmente degradate e sintetizzate. Il tempo di semi-vita di un enzima nel fegato di ratto varia da 10 minuti a una settimana. In media il tempo di semi-vita di una proteina è correlato con il residuo -terminale: Proteine con -terminale come Met, Ser, Ala, Thr, Val, o Gly hanno un tempo di semi-vita maggiore di 20 ore. Proteine con -terminale Phe, Leu, Asp, Lys, o Arg hanno un tempo di semi-vita di 3 minuti o meno. gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine - 2-1

2 Turn-over delle proteine È stato dimostrato che le proteine ricche in Pro (P), Glu (E), Ser (S) and Thr (T), chiamate proteine PEST, sono degradate più rapidamente che le altre proteine. La degradazione di specifiche proteine può essere regolata: egli eucarioti il ciclo cellulare è controllato, alcuni enzimi regolatori del ciclo sono degradati in fasi particolari del ciclo cellulare in risposta a segnali intra o extra-cellulari. gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine Proteolisi: meccanismo generale n n+1 n n+1 '' '' ' u: C'' u+ ' C'' n n+1 '' n n+1 '' ' u: C'' 2 ' u C'' gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine - 4-2

3 Enzimi proteolici Classi di enzimi proteolitici: Proteasi a serina: enzimi digestivi come tripsina, chimotripsina, elastasi... Differiscono nella specificità del substrato: Chimotripsina: privilegia il taglio del legame peptidico nel quale l AA che impegna il C= ha una catena laterale. Tripsina: preferisce un AA carico positivamente (Lys o Arg) nella stessa posizione. gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine Enzimi proteolici: proteasi a serina Il sito attivo (tripsina bovina 3BTK) è fatto da un residuo di serina (Ser195), uno di istidina (is57) e uno di aspartato (Asp102). Durante la catalisi vi è un attacco nucleofilo del della serina sul carbonio del carbonile del legame peptidico che deve essere tagliato. Durante la reazione un + è trasferito dalla serina all anello imidazolico dell istidina, l aspartato forma un legame con l istidina. Ser195 is57 Asp102 gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine - 6-3

4 Centro catalitico Asp102 is57 Ser195 gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine Meccanismo delle proteasi a serina Asp102 E is57 Ser195 Gly193 Sito Specifico gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine - 8-4

5 Meccanismo delle proteasi a serina Asp102 ES is57 Ser195 Gly193 Sito Specifico gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine Meccanismo delle proteasi a serina Asp102 Intermedio tetraedrico + is57 Ser195 Gly193 Sito Specifico gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine

6 Meccanismo delle proteasi a serina Asp102 + is57 Ser195 Gly193 Sito Specifico gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine Meccanismo delle proteasi a serina Asp102 is57 Ser195 Gly193 Acilenzima Sito Specifico gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine

7 Meccanismo delle proteasi a serina Asp102 is57 Sito Specifico Ser195 Gly193 gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine Meccanismo delle proteasi a serina Asp102 is57 Ser195 Gly193 Sito Specifico gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine

8 Meccanismo delle proteasi a serina Asp102 is57 + Intermedio tetraedrico Ser195 Gly193 Sito Specifico gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine Meccanismo delle proteasi a serina Asp102 is57 + Ser195 Gly193 Sito Specifico gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine

9 Meccanismo delle proteasi a serina Asp102 is57 Ser195 Gly193 Sito Specifico gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine Meccanismo delle proteasi a serina Asp102 is57 Ser195 Gly193 Sito Specifico gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine

10 Meccanismo delle proteasi a serina gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine Proteasi a serina (1AX) gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine

11 Proteasi a serina (1AX) Gly193 Ser195 is57 gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine Enzimi proteolici: proteasi a aspartato Le proteasi ad aspartato comprendono: La pepsina (enzima digestivo). Alcune proteasi lisosomiali. L enzima renale renina. Le proteasi dell IV. Due residui di aspartato sembra partecipino alla catalisi acido/base nel sito attivo. Un aspartato accetta + da una molecola di 2 nel sito attivo che attacca il carbonio carbonilico del legame peptidico. Simultaneamente l altro aspartato cede l + all ossigeno del carbonile del legame peptidico. gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine

12 Pepsina Secreta dalle cellule della mucosa gastrica (che secernono anche Cl) come pepsinogeno inattivo (40 kd): Pepsinogeno p acido Pepsina -42AA -AA-AA-AA-AA- AA + AA-AA + AA-AA-AA Taglia con maggior frequenza legami tra aminoacidi aromatici, Met, Leu e produce peptidi e pochi aminoacidi liberi. gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine Meccanismo delle proteasi ad aspartato gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine

13 Enzimi proteolici: metallo proteasi Appartengono alla classe delle proteasi a Zinco (metalloproteasi): La carbossipeptidasi (enzima digestivo). Le metalloproteasi della matrice (collagenasi), coinvolte nella degradazione della matrice extra cellulare durante la crescita dei tessuti. Una proteasi lisosomiale. el sito attivo è presente uno zinc binding motif, con due residui di istidina il cui imidazolo complessa lo ione Zn ++. ella catalisi lo Zn ++ interagisce con l ossigeno del C= promuovendo l attacco nucleofilo dell ossigeno di una molecola di acqua nel sito attivo al carbonio del C=. ella carbossipeptidasi un residuo di glutamato facilita la reazione estraendo un + dall acqua. gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine Peptidasi intestinali Procarbossipeptidasi A e B Carbossipeptidasi A B Leucina aminopetidasi Lys Arg 3 + Leu gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine

14 Metallo (zinco) proteasi Uno ione Zn ++ è coordinato con due atomi di azoto di due is, il carbonile di un Glu e 2 Lo ione Zn ++ promuove l attacco nucleofilo sul carbonio carbonilico da parte dell atomo di ossigeno dell acqua legata nel sito attivo Il residuo di Glu agisce come base facilita la reazione estraendo un + dall 2. Zn ++ gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine Enzimi proteolici: proteasi a cisteina Appartengono alla classe delle proteasi a Cisteina: La papaina (della Carica Papaya). Alcune protesi lisosomiali (catepsine). Le caspasi che si occupano della degradazione delle proteine dell apoptosi (morte cellulare programmata). Le proteasi lisosomiali a cisteina sono omologhe alla papaina. Sono una famiglia molto grande con svariata specificità di substrato. Le caspasi tagliano il lato carbossilico di un aspartato. Il meccanismo delle proteasi a cisteina si pensa che coinvolga la deprotonazione del S di una cisteina da parte di un residuo vicino di istidina seguito da un attacco nucleofilo dello zolfo al carbonio carbonilico. gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine

15 Attivazione delle proteasi Attivazione delle proteasi: La maggior parte delle protesi sono sintetizzate come proenzimi di maggiori dimensioni. L attivazione consiste nella rimozione di un segmento inibitorio nel proenzima. L attivazione può avvenire dopo che la proteasi è stata secreta nell apposito compartimento cellulare o nella matrice extracellulare. In alcuni casi (attivazione dell apoptosi) l attivazione può essere a cascata e portare all attivazione di proteasi specifiche. gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine Degradazione delle proteine Ci sono tre principali sistemi di degradazione delle proteine (nel muscolo): Ubiquitina-proteosoma Le proteine sono marcate per la degradazione da unità di ubiquitina. I proteosoma 20S inattivo viene attivato da una proteina regolatrice diventando proteosoma 26S Il proteosoma 26S rompe la proteina in peptidi I peptidi sono scissi in aminoacidi liberi da altri processi nella cellula Lisosomi Le proteine entrano nei lisosomi via endocitosi La catepsina e le proteasi degradano i legami peptidici in ambiente acido. Calpaina Proteasi attivate da calcio nel citosol della cellula I differenti isomeri sono attivati da differenti concentrazioni di calcio. gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine

16 Sistema Ubiquitina-proteosoma Ubiquitina: Le proteine sono marcate per la proteolisi selettiva dall ubiquitina, una proteina ubiquitaria altamente conservata. Si forma un legame isopeptidico tra il carbossiterminale dell ubiquitina e un gruppo 2 di una lisina della proteina da degradare. Il processo è ATP dipendente. Sono coinvolti tre enzimi (E1, E2 e E3). gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine Sistema Ubiquitina-proteosoma Inizialmente il carbossiteminale dell ubiquitina è legato con un legame tioestere al Ubiquitin- Activating Enzyme (E1) attraverso una reazione ATP dipendente L ubiquitina vien quindi trasferita ad un gruppo sulfidrilico del Ubiquitin-Conjugating Enzyme (E2). Una Ubiquitin-Protein Ligase (E3) trasferisce l ubiquitina attivata al gruppo ε-amino di una lisina formando un legame isopeptidico. Ci sono diverse ligasi dell ubiquitina che differiscono per la specificità. gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine

17 Sistema Ubiquitina-proteosoma Più ubiquitine sono legate per formare una catena. La Gly carbossiterminale forma un legame con il gruppo ε-amino della Lys48 di una catena adiacente di ubiquitina. 1UBQ gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine Sistema Ubiquitina-proteosoma gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine

18 Sistema Ubiquitina-proteosoma Alcune proteine (per esempio le cicline, coinvolte nella regolazione del ciclo cellulare) presentano una sequenza chiamata destruction box, riconosciuta da un dominio del corrispondente E3. L interazione dell ubiquitina ligasi con il suo bersaglio è regolata, in alcuni casi, dalla fosforilazione della proteina bersaglio e può coinvolgere altre proteine adattatrici. 2 C gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine Sistema Ubiquitina-proteosoma Alcune proteine (per esempio le cicline, coinvolte nella regolazione del ciclo cellulare) presentano una sequenza chiamata destruction box, riconosciuta da un dominio del corrispondente E3. L interazione dell ubiquitina ligasi con il suo bersaglio è regolata, in alcuni casi, dalla fosforilazione della proteina bersaglio e può coinvolgere altre proteine adattatrici. gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine

19 E1-E2-E3 gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine E1-E2-E3 E1 è l enzima che attiva il processo attivando la molecola di ubiquitina attraverso un legame ad un S di una Cys. Il processo richiede ATP. Diversi E2 ricevono la molecola di ubiquitina così attivata e vengono riconosciuti da diversi E3 è un enzima che riconosce, e lega, la proteina da ubiquitinare e trasferisce su di essa l ubiquitina legandola ad una Lys bersaglio. gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine

20 E1-E2-E3 14 1FXT 1FQV 1LDK gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine E3 ECT: olologous to E6 AP C Terminus IG: eally Interesting ew Gene gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine

21 gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine Sistema Ubiquitina-proteosoma La degradazione selettiva di una proteina avviene nel proteosoma. Un complesso proteico presente nella cellula. Il core complex del proteosoma, ha un coefficiente di sedimentazione di 20S ed è costituito di 14 subunità di due tipi (α 7 β 7 ). Le sette subunità α formano un anello a struttura cilindrica. Le sette subunità β formano l anello centrale. α 7 β 7 { α β 1JD2 α 7 β 7 { β α gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine

22 Sistema Ubiquitina-proteosoma Il core complex del proteosoma racchiude una cavità fatta di tre compartimenti collegati da uno stretto passaggio. L attività proteasica è associata a tre delle subunità β ognuna con differente specificità per il substrato. α β β α gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine Sistema Ubiquitina-proteosoma 1. Una subunità β ha una attività simile alla chimotripsina con preferenza per Tyr o Phe come AA al carbonile del legame peptidico. 2. Una subunità β ha una attività simile alla tripsina con preferenza per Arg o Lys al carbonile del legame peptidico. 3. Una subunità β ha una attività post-glutamil con preferenza per glutamato o altro residuo acido. on sono coinvolti residui di cisteina o serina. L attività idrolasica del proteosoma costituisce una famiglia di proteasi a treonina. gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine

23 Sistema Ubiquitina-proteosoma ella struttura del core complex del proteosoma non ci sono apparenti aperture verso l esterno. È presente un cap complex ( cappello ) che apra il passaggio verso l esterno e permetta alla proteina di entrare consumando ATP. È stato cristallizzato il core complex 20S del proteosoma con il cap complex 11S. L interazione del cap complex 11S altera la conformazione del dominio -terminale delle subunità α del core complex permettendo l accesso dall esterno. gsartor v.1.3 1FT M07 - Turn-over delle proteine Sistema Ubiquitina-proteosoma Ad ognuna delle estremità del core complex un motore ad ATP svolge la proteina da degradare e la inserisce nel core complex Al di sopra di questo ci sono i sistemi di controllo che riconoscono la proteina etichettata con ubiquitina. gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine

24 gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine

25 gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine Differente cappello Alcune cellule usano il core del proteosoma corredandolo con un cappello diverso a secondo delle proprie necessità. on usano ATP per procedere all inserimento della proteina da degradare. on è molto chiara la funzione di questi sistemi che sembrano avere una predilezione per peptidi più corti e per proteine normalmente non foldate. gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine

26 Caspasi Le caspasi sono le proteine che eseguono l apoptosi. Sono delle proteasi a cisteina che usano il gruppo S come nucleofilo per l idrolisi del legame peptidico. Idrolizzano il legame peptidico a livello di residui di Asp. gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine Caspasi Esistono almeno una dozzina di Caspasi conosciute ognuna delle quali svolge una funzione definita Caspasi-1 (interleukin-1β-converting enzyme) è stata la prima ad essere identificata. on è coinvolta nell apoptosi. Come le altre Caspasi è fatta di due catene ognuna delle quali viene tagliata in due pezzi. Caspasi-9 è legata ad un inibitore che la mantiene inattiva. Viene attivata ad un altra subunità. La Caspasi-9 è un iniziatore di apoptosi che attiva un effettore come la Caspasi-3 la quale, insieme ad altri effettori, inizia il lavoro di disassemblaggio della cellula. Caspasi-1 (1ice) Caspasi-9 (1nw9) Caspasi-3 (1pau) gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine

27 Lisosomi I lisosomi contengono enzimi idrolitici che degradano le proteine e altre sostanze catturate per endocitosi. I lisosomi hanno un valore di p interno basso (acido a causa di un trasporto di protoni pilotato da una V-ATPasi. Tutti gli enzimi idrolitici lisosomali hanno un optimum a p acido. Le catepsine (proteasi a cisteina) sono attivate dalla scissione di proenzimi che può essere catalizzata da altri enzimi lisosomali o dall ambiente acido Enzimi idrolitici p acido ATP + ADP + P i gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine Lisosomi: sistemi di protezione Le cistatine inibiscono le catepsine lisosomali. Sono presenti nel citosol e nello spazio extracellulare. Le cistatine si legano al sito attivo delle catepsine competendo con il substrato e proteggono la cellula dalle catepsine eventualmente uscite dai lisosomi. Autofagia: se una porzione del citoplasma viene incapsulata dai lisosomi si ha la degradazione delle proteine. Questo meccanismo non è il meccanismo di elezione per la degradazione selettiva delle proteine. gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine

28 Calpaine ei mammiferi le calpaine più conosciute solo le Calpaina-1 e Calpain-2 (micro-calpaina e M-calpaina), sono espresse ubiquitariamente. L attività delle calpaine e è strettamente controllata dall inibitore endogeno calpastatina che è una proteina intrinsecamente non strutturata che si lega alle calpaine in modo reversibile e solo in presenza di Ca ++. on è ancora ben chiaro come una proteina non strutturata possa funzionare da inibitore delle proteasi senza essere a sua volta scissa in peptidi. Ciò che si osserva è che la Calpastatina occupa entrambi i lati del sito catalitico senza interagire con esso direttamente gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine M-Calpaina 3BW Calpastatina 1DF0 gsartor v.1.3 M07 - Turn-over delle proteine

29 Apoptosi gsartor v.1.4 M07 - Turn-over delle proteine Crediti e autorizzazioni all utilizzo Questo materiale è stato assemblato da informazioni raccolte dai seguenti testi di Biochimica: CAMPE Pamela, AVEY ichard, FEIE Denise. LE BASI DELLA BICIMICA [ISB ] Zanichelli ELS David L., CX Michael M. I PICIPI DI BICIMICA DI LEIGE - Zanichelli GAETT eginald., GISAM Charles M. BICIMICA con aspetti molecolari della Biologia cellulare - Zanichelli VET Donald, VET Judith G, PATT Charlotte W FDAMETI DI BICIMICA [ISB ] - Zanichelli E dalla consultazione di svariate risorse in rete, tra le quali: Kegg: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes Brenda: Protein Data Bank: ensselaer Polytechnic Institute: Il materiale è stato inoltre rivisto e corretto dalla Prof. Giancarla rlandini dell Università di Parma alla quale va il mio sentito ringraziamento. Questo ed altro materiale può essere reperito a partire da: oppure da gsartor.org/ Il materiale di questa presentazione è di libero uso per didattica e ricerca e può essere usato senza limitazione, purché venga riconosciuto l autore usando questa frase: Materiale ottenuto dal Prof. Giorgio Sartor Università di Bologna Alma Mater Giorgio Sartor - giorgio.sartor@unibo.it 29