Alle radici della resistenza agli antibiotici

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1 Workshop Sicurezza alimentare: passato, presente e futuro Rovigo, 18 maggio 2012 Valerio Giaccone Dipartimento di Medicina animale, Produzioni e Salute Università di Padova Alle radici della resistenza agli antibiotici

2 WHO Ogni anno nel mondo 1,4 miliardi di persone contraggono salmonellosi, con circa 3 milioni di morti

3 WHO Ogni anno i casi di campylobatteriosi umana sono circa 450 milioni

4 Unione Europea La malattia alimentare più frequente è la campylobatteriosi (oltre casi nel 2010)

5 Unione Europea Seconda in graduatoria la salmonellosi non tifoide con circa casi/anno

6 Unione Europea Seguono (distanziate) yersiniosi, patologie da VTEC e listeriosi

7 Quadri clinici Sovente, nei soggetti normoergici le MTA decorrono in forma asintomatica o si autolimitano nel giro di giorni

8 Quadri clinici Nei soggetti immunodepressi le MTA assumono spesso quadri clinici gravi (enterici o sistemici) anche mortali

9 Nei casi gravi al medico serve contare sugli antibiotici se il patogeno in causa non è diventato resistente

10 Quanti, fra i patogeni alimentari, sono resistenti agli antibiotici?

11 Cos è un antibiotico?

12 Secondo l EFSA È un farmaco che a basse concentrazioni ha un effetto tossico selettivo contro microrganismi patogeni

13 Secondo WHO Sostanza, naturale o di sintesi che in vivo uccide o inibisce la crescita di microrganismi agendo su bersagli specifici

14 EFSA o WHO? EFSA punta solo ai patogeni WHO definisce effetti contro dei generici microrganismi

15 In effetti gli antibiotici agiscono anche contro microrganismi NON patogeni (utili o neutri)

16 Gli antibiotici non curano le malattie bloccano o frenano la crescita dei patogeni in attesa di una reazione dell ammalato

17 Concetti di resistenza

18 Resistenza È una proprietà che una certa popolazione microbica possiede o non possiede

19 Vari significati Per il clinico un germe è resistente se nel paziente non soccombe al trattamento con l antibiotico

20 Vari significati Per il microbiologo un germe è resistente se possiede il meccanismo che inibisce o blocca l antibiotico

21 Vari significati Per un epidemiologo un germe è resistente se possiede i caratteri genomici di resistenza, intrinseca o acquisita

22 Resistenza di tipo La resistenza può essere a un singolo principio a più principi (multi-resistenza MAR)

23 Attenzione! Quasi tutti gli antibiotici sono efficaci (se lo sono) SOLO contro cellule batteriche in fase di attiva moltiplicazione

24 Attenzione! Gli antibiotici sono meno o poco efficaci contro i germi in fase di crescita stazionaria (Viable But Not Culturable VBNC)

25 Attenzione! La mancata crescita dei germi trattati con antibiotico può indurre a mal valutare un effetto di resistenza

26 Meccanismi d azione degli antibiotici

27 Gli antibiotici interagiscono con un singolo processo vitale dei microrganismi (da questo dipende la resistenza)

28 TARGETS DEGLI ANTIBIOTICI Da Carattoli A. Relazione a Workshop Antibiotici-Animali-Alimenti-Uomo S. Bonifacio (VR),28/10/2011

29 Casualità Batteri = predisposizione a rapida moltiplicazione = = facili mutazioni casuali nel loro genoma

30 Cambio bersaglio Fra i germi messi a contatto con l antibiotico qualche cellula sviluppa mutazione e diventa resistente

31 Risultato L antibiotico facilita la selezione del ceppo che ha sviluppato per caso quella resistenza

32 Domanda L antibiotico induce esso stesso la resistenza o seleziona una popolazione già resistente?

33 Risposta L antibiotico seleziona solo una sottopopolazione che è diventata, per mutazione, resistente

34 Genesi di resistenza In base al meccanismo d azione dell antibiotico i germi elaborano varie strategie per inattivarli

35 Azione su membrana cellulare Mutazione che attenua la permeabilità di membrana

36 Azione su pompa di efflusso Sintesi di una proteina di efflusso (trasposonica)

37 Mutazioni genetiche varie Il germe cambia il bersaglio dell antibiotico

38 Inattivazione dell antibiotico Sintesi di enzim che lisano l antibiotico

39 Come vedete molti dei meccanismi di resistenza dipendono da plasmidi

40 Plasmidi Molecole di DNA ad anello, capaci di replicare da sole Non codificano geni essenziali per la vita del batterio

41 Attenzione! Ogni fattore di resistenza è codificato da un gene Vari geni possono trovare posto tutti sullo stesso plasmide

42 Conseguenza La trasmissione di un solo plasmide può indurre il trasferimento ad altre cellule di varie resistenze

43 Verticale Due trasmissioni Orizzontale

44 Trasmissione verticale

45 Via più antica Nel genoma interviene una mutazione utile per il germe La mutazione rende il germe più vitale e tutta la progenie riceve questa capacità

46 Quante mutazioni? Si stima 1 mutazione/miliardo di cellule microbiche Può sembrare poco, invece è un indice di mutazione alto

47 HGT Horizontal gene transfer

48 HGT È la via più attuale e rapida di trasmissione di pacchetti genici da un clone all altro, anche di specie diverse

49 Esempio di pacchetto genico il trasposone Tn1546 Da Carattoli A. Relazione a Workshop Antibiotici-Animali-Alimenti-Uomo S. Bonifacio (VR),28/10/2011

50 HGT Può avvenire in tre modi coniugazione trasduzione trasformazione

51 Coniugazione Tra due batteri si crea un pilo di coniugazione attraverso cui passano, da donatore a ricevente, i geni

52 Trasformazione I batteri morti si lisano e liberano il DNA nell ambiente DNA è assorbito da una cellula viva che lo inserisce nel suo DNA

53 Trasduzione Il materiale genico è trasmesso da cellula donatrice a ricevete attraverso un virus batteriofago

54 MECCANISMI DI SCAMBIO GENICO TRASFORMAZIONE: trasferimento di DNA nudo aduna cellula ricevente TRASDUZIONE trasferimento di DNA mediato da batteriofagi CONIUGAZIONE: Sorlini C. Relazione a Workshop Antibiotici-Animali-Alimenti-Uomo S. Bonifacio (VR),28/10/2011

55 HGT per coniugazione

56 Trasferimento orizzontale Meccanismo di scambio Donatore Ricevente Trasformazione DNA di cellula morta Cellula viva Coniugazione DNA di cellula viva Cellula viva Trasduzione DNA fagico Cellula viva

57 E il DNA libero? DNA = molecola molto stabile resta libero nell ambiente per seguire poi una serie di vie di trasformazione

58 Destino del DNA libero nell ambiente Esposizione DNA Acquisizione nutrienti restrizione Ricircolarizzazione OriV degradazione batterio mutazioni riarrangiamenti cromosoma Ricombinazione plasmidi espressione selezione positiva neutra negativa Impatt ambientale Sorlini C. Relazione a Workshop Antibiotici-Animali-Alimenti-Uomo S. Bonifacio (VR),28/10/2011

59 Competenza 1 Stato fisiologico temporaneo del batterio che gli permette di assorbire DNA di grandi dimensioni attraverso la parete

60 Competenza 2 Il batterio raggiunge questo stato fisiologico grazie a una temporanea modificazione della sua parete

61 Competenza 3 Il DNA passa la parete a elica singola, l altra viene degradata Nel batterio DNA è ricostruito e incorporato nel DNA microbico

62 Competenza 4 Molti dei batteri patogeni per uomo e animali sono per natura competenti, cioè assorbono DNA ambientale

63 Il resistoma ambientale

64 Batteri nel mondo Si stima che sulla Terra ci siano, ogni minuto, circa 5 x 10 batteri 30

65 Batteri nel mondo Sono quasi tutti batteri non patogeni per uomo e animali Una maggioranza silenziosa che l uomo considera poco

66 Nel terreno 1 g di terreno contiene da a 10 ufc di microrganismi Sono microflore molto varie ( specie diverse)

67 Nel terreno Il 6% di questa microflora sono actinomiceti produttori di molti peptidi bioattivi

68 Stima 1 g di terreno può contenere 658 specie di actinomiceti con programmi genetici per composti bioattivi

69 Stima In teoria, anche il restante 94% di flore microbiche dovrebbe sintetizzare composti bioattivi

70 Conseguenza I batteri sono immersi in un laboratorio chimico che ne stimola la biodiversità e le continue mutazioni

71 Composti bioattivi Sono elementi di selezione evolutiva e stimolano i batteri a evolvere di continuo

72 Metagenoma Insieme di tutto il DNA che si può estrarre da una qualunque matrice (terreno, acque, feci, alimenti)

73 Resistoma Insieme di tutto il DNA presente in una matrice e che veicola elementi genici di resistenza agli antibiotici

74 Resistoma Il resistoma è una dotazione genetica patrimonio di tutti i microrganismi, non solo di quelli patogeni

75 Microflora di piante e animali Microflora negli alimenti Microflora intestino umano RESISTOMA Microflora del terreno

76 Il terreno è una riserva immensa di elementi genici di resistenza Questo resistoma è frutto di vari fattori

77 1. Cause naturali I batteri producono antibiotici naturali e hanno in sé dei geni di resistenza per essere immuni a quei principi

78 2. Cause naturali La resistenza è passata poi ad altri batteri che cercavano di difendersi dagli antibiotici naturali prodotti dai loro nemici

79 3. Cause umane L uso di antibiotici in vari settori non fa che aumentare la diffusione degli elementi di resistenza

80 Purtroppo oggi la resistenza nel terreno si estende anche agli antibiotici di sintesi

81 Prima di anni 70 Si credeva che la resistenza fosse un fenomeno limitato ai soli batteri patogeni

82 1973 Beneveniste e Davies scoprono che in natura sono presenti molti altri batteri banali che sono resistenti agli antibiotici

83 Oggi Le specie batteriche del terreno resistenti agli antibiotici sono tantissime

84 E gli antibiotici cosa c entrano?

85 Non si può parlare di batteri resistenti senza associarli agli antibiotici

86 Gli antibiotici esercitano una pressione selettiva negli ambienti in cui si trovano (terreno, animali, uomo )

87 Gli antibiotici uccidono i batteri sensibili e creano un ambiente poco competitivo, per cui i resistenti possono moltiplicare

88 Resistenza agli antibiotici in Salmonella

89 Salmonella 1 Registrati diversi profili di antibiotico-resistenza che può essere cromosomiale (intrinseca) o plasmidica

90 Salmonella 2 La loro antibiotico-resistenza è in continua espansione Causa: Uso eccessivo di antibiotici in zootecnia???

91 Pericolo Ceppi di Salmonella resistenti a uno o più antibiotici si diffondono rapidamente anche in vari Paesi dell Asia

92 Malaysia Adzitey e coll. (2011) analizzano 531 campioni di anatre vive, carni e prodotti derivati (uova) Adzitey et alii (2011) Prevalence and antibiotic resistance of Salmonella serovars in ducks, duck rearing and processing environments in Penang, Malaysia. Food Research International, in press

93 Malaysia 23,5% dei campioni è positivo per Salmonella 125 ceppi isolati 91 (73%) contengono geni di resistenza Adzitey et alii (2011) Prevalence and antibiotic resistance of Salmonella serovars in ducks, duck rearing and processing environments in Penang, Malaysia. Food Research International, in press

94 Preoccupante Sono in forte diffusione i ceppi di Salmonella MAR, multi-resistenti a tre o più antibiotici

95 Enter-Net 45% dei ceppi di Salmonella isolati e studiati è ormai multi-resistente a più antibiotici

96 Cina-Giappone Meng e coll. (2011) studiano Salmonella isolata da alimenti Salmonella può trasferire integroni a Streptococcus umani Meng et alii (2011) Characterization and horizontal transfer of class 1 integrons in Salmonella strains isolated from food products of animal origin. International Journal of Food Microbiology 149,

97 Spagna Alonso-Hernando e coll. (2009): i disinfettanti più usati selezionano ceppi salmonellari resistenti agli antibiotici Alonso-Hernando et alii (2009) Comparison of antibiotic resistance patterns in Listeria monocytogenes and Salmonella enterica strains pre-exposed and exposed to poultry decontaminants. Food Control 20,

98 Spagna Ceppi di Salmonella non resistenti, lo sono diventati dopo averli messi a contatto con basse dosi di disinfettanti Alonso-Hernando et alii (2009) Comparison of antibiotic resistance patterns in Listeria monocytogenes and Salmonella enterica strains pre-exposed and exposed to poultry decontaminants. Food Control 20,

99 Resistenza ad antibiotici in Campylobacter

100 Campylobacter Prima erano poco resistenti agli antibiotici Oggi stanno rapidamente bruciando le tappe

101 Campylobacter Molti ceppi sono resistenti a tetracicline, eritromicina e fluoroquinoloni

102 Svizzera Frediani-Wolf e Stephan (2003) valutano 195 ceppi di C. jejuni isolati da carni avicole prelevate al dettaglio

103 Svizzera Su 195 ceppi di C. jejuni 61 (il 31,3%) risultavano resistenti a uno o più degli antibiotici testati

104 Polonia Maćkiw e coll. (2011) valutano resistenza di C. coli e C. jejuni a fluoroquinoloni, eritromicina e gentamicina Maćkiw et alii (2011) Antibiotic resistance in Campylobacter jejuni and Campylobacter coli isolated from food in Poland. Food Control in press.

105 Polonia Su 218 campioni di carni vendute al dettaglio isolano 143 ceppi di Campylobacter (75% C. coli e 24% C. jejuni) Maćkiw et alii (2011) Antibiotic resistance in Campylobacter jejuni and Campylobacter coli isolated from food in Poland. Food Control in press.

106 Polonia 98% dei ceppi è resistente ai fluoroquionoloni 10 su 143 ceppi sono resistenti ad almeno 3 antibiotici Maćkiw et alii (2011) Antibiotic resistance in Campylobacter jejuni and Campylobacter coli isolated from food in Poland. Food Control in press.

107 Resistenza agli antibiotici in Listeria

108 Al momento i ceppi di L. monocytogenes che circolano negli alimenti sono ancora poco resistenti agli antibiotici

109 Però dati recenti segnalano che anche Listeria sta diventando sempre più resistente agli antibiotici

110 Problema 1 La terapia della listeriosi sistemica si basa sui beta-lattamici (gentamicina)

111 Problema 2 Dimostrato che gli enterococchi del nostro intestino trasmettono a Listeria geni di resistenza a gentamicina

112 Conseguenza Listeria può diventare resistente agli antibiotici assumendo geni da batteri saprofiti

113 In Italia Pesavento e coll. (2010) campioni di alimenti analizzati per Listeria

114 In Italia Analizzati campioni di carni crude (bovino, suino, pollame) verdure di IV gamma e prodotti di gastronomia

115 In Italia Isolati 168 ceppi di Listeria 40 ceppi di L. monocytogenes

116 In Italia 51 ceppi su 168 (30,4%) resistenti a 1 o più antibiotici Tutti sono resistenti a antibiotici a di 1 scelta (gentamicina)

117 In Italia Ceppi resistenti più diffusi nei prodotti di gastronomia che nelle carni crude

118 Dimostrato Listeria può trasmettere la resistenza alla meticillina agli Enterococcus presenti nel nostro intestino

119 In Spagna 1 Alonso-Hernando e coll. (2012) studiano i profili di resistenza in L. monocytogenes isolati da pollame nel 1993 e nel 2006 Alonso-Hernando et alii (2012) Increase over time in the prevalence of multiple antibiotic resistance among isolates of Listeria monocytogenes from poultry in Spain. Food Control 23,

120 In Spagna 2 Le prevalenze dei ceppi isolati nei due anni sono praticamente uguali Alonso-Hernando et alii (2012) Increase over time in the prevalence of multiple antibiotic resistance among isolates of Listeria monocytogenes from poultry in Spain. Food Control 23,

121 In Spagna : i ceppi MAR erano 37,2% 2006: i ceppi MAR sono 96% Alonso-Hernando et alii (2012) Increase over time in the prevalence of multiple antibiotic resistance among isolates of Listeria monocytogenes from poultry in Spain. Food Control 23,

122 In Spagna sono aumentati i ceppi di Listeria resistenti a gentamicina, streptomicina, neomicina, enrofloxacin, ciprofloxacin e furazolidone Alonso-Hernando et alii (2012) Increase over time in the prevalence of multiple antibiotic resistance among isolates of Listeria monocytogenes from poultry in Spain. Food Control 23,

123 Resistenza agli antibiotici in E. coli

124 E. coli 1 Risultati discordanti da un paese all altro I dati variano in base a Paese, antibiotico e matrice considerati

125 E. coli 2 Nei ceppi isolati dalla matrice pollo è diffusa la resistenza a fluoroquinoloni

126 E. coli 3 Cominciano a diffondersi anche per E. coli i ceppi multi-resistenti

127 Resistenza agli antibiotici dei batteri lattici

128 Una volta i LAB erano MOLTO sensibili agli antibiotici giudicati come GRAS

129 Oggi Sappiamo che anche i LAB sono resistenti agli antibiotici o lo possono diventare

130 Quindi i LAB sono per loro natura intrinsecamente resistenti ad alcuni antibiotici

131 Ma soprattutto i LAB diventano resistenti per acquisizione di geni di resistenza da altre fonti

132 Dimostrato Nel genoma di Lactobacillus, Lactococcus, S. thermophilus sono presenti geni di resistenza agli antibiotici

133 Irlanda Toomey e coll. (2010) hanno scoperto che i LAB possono trasmettere geni di resistenza a patogeni enterici Toomey et alii (2010) Characterisation and transferability of antibiotic resistance genes from lactic acid bacteria isolated from Irish pork and beef abattoirs. Research in Microbiology 161,

134 Il punto finale

135 Punto 1 L antibiotico-resistenza non è un fenomeno imprevedibile Già Fleming l aveva prevista

136 Punto 2 La resistenza agli antibiotici è trasmessa per via orizzontale da un sistema di geni e integroni chiamato trasposoma

137 Punto 3 La resistenza agli antibiotici dei patogeni alimentari non è la causa dei problemi, ma solo un effetto manifesto

138 Punto 4 La resistenza agli antibiotici dei patogeni alimentari è solo l anello finale di una catena di resistenze

139 Punto 5 Geni di resistenza agli antibiotici sono rilevabili nel terreno e nel genoma di batteri commensali, compresi i LAB

140 Punto 6 Geni di resistenza passano da un patogeno all altro ma anche da commensali a patogeni nel nostro intestino

141 Conclusione Gli alimenti sono un veicolo di immissione nel corpo umano di microflore NON patogene, ma con geni della resistenza

142 Finora abbiamo solo guardato ai batteri patogeni come protagonisti dell antibiotico-resistenza

143 Da oggi dobbiamo pensare che la resistenza agli antibiotici nasce dagli humili

144 Che possiamo fare? Conoscere i difetti

145 Un medico deve conoscere il male per fare del bene Quindi buon lavoro a tutti!

146 A proposito di geni: Grazie!