Mappatura dei cromosomi eucariotici

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1 Mappatura dei cromosomi eucariotici

2 Mendel -> i caratteri di un individuo sono specificati da geni e sono ereditari Ma dove sono i geni nella cellula? Morgan -> alcuni caratteri vengono trasmessi di generazione in generazione allo stesso modo di come vengono trasmessi i cromosomi sessuali (ovvero alcuni caratteri sono specificati da particolari cromosomi che determinano il sesso dell individuo) I geni sono sui cromosomi?

3 Esperimento di Bridges Prova cruciale della teoria cromosomica atteso X R X b occhi rossi ½ X b Y occhi bianchi ½

4 ma da incroci su larga scala si puo generare una progenie eccezionale xbxb xry X R X b occhi rossi ½ X b Y occhi bianchi ½ + occhi bianchi X b X b? occhi rossi, sterili atteso Progenie eccezionale primaria, 0.05%

5 Progenie eccezionale secondaria X b X b? X R Y X R X b occhi rossi ½ X b Y occhi bianchi ½ atteso + occhi bianchi X b X b? occhi rossi, fertili Progenie eccezionale secondaria, 4%

6 Determinazione del sesso in Drosophila

7 Determinazione cromosomica del sesso in Drosophila e nell uomo Cromosomi sessuali Specie XX XY XXY XO Drosophila Homo Sapiens

8 Determinazione del sesso in Drosophila Rapporto X:A

9 spiegazione

10 Origine della progenie eccezionale primaria

11 Origine della progenie eccezionale secondaria X b X b Y x X R Y Gameti X b X b /Y X b /X b Y X R /Y X Y X Y X b X b XX b X b X b X b Y X b XX b X b Y Y XY YY X b Y XX b Y X b YY 4%

12 Bridges confermo la sua ipotesi con osservazioni citologiche dirette Le eccezionali primarie avevano cromosomi sessuali di tipo X b X b Y I eccezionali primari avevano cromosomi sessuali di tipo X R O

13 I geni sono sui cromosomi e questo spiega la segregazione meiotica di caratteri indipendenti nella formazione dei gameti AaBb A e B su cromosomi diversi-> segregazione indipendente

14 E se i geni si trovano sullo stesso cromosoma? Geni associati

15 Geni su cromosomi diversi Geni associati

16 Esperimento di Bateson & Punnett -Studio di altri 2 caratteri del Lathyrus odoratus 1) colore del fiore (porpora/rosso) PP pp 2) forma del granulo pollinico (lungo/tondo) LL ll

17 Incrocio P PP/LL x pp/ll F1 Pp/Ll autofecondazione osservati attesi (Mendel) F2 Porpora lungo P-/L (9) Porpora corto P-/ll (3) Rosso lungo pp/l (3) Rosso corto pp/ll (1)

18 Osservazioni I 2 caratteri non assortiscono in modo indipendente ma sono accoppiati (maggiore frequenza dei fenotipi identici ai parentali) Deviazione dalla seconda legge di Mendel Accoppiamento dei caratteri (Coupling) La comprensione del fenomeno si ottenne con gli esperimenti di Morgan fatti su Drosophila

19 Pp/Ll Caratteri indipendenti Caratteri accoppiati parentale PL PL Alta probabilita ricombinante Pl Pl Bassa probabilita ricombinante pl pl Bassa probabilita parentale pl pl Alta probabilita Stessa probabilita

20 Esperimento di Morgan. I Studio di altri 2 caratteri 1) colore dell occhio 2) grandezza dell ala P x Occhio rosso pr+pr+ Occhio porpora pr pr Ali normali vg+ vg+ Ali vestigiali vg vg F1 Occhio rosso Ali normali pr+ pr / vg+ vg

21 Testcross F1 x Occhio rosso Ali normali pr+pr/ vg+vg Occhio porpora Ali vestigiali pr pr / vg vg Ci concentriamo solo sulla meiosi del doppio eterozigote

22 F2 osservati attesi (Mendel) Rosso Normale pr+ pr/ vg+vg Rosso vestigiale pr+ pr/ vg vg Porpora Normale pr pr/ vg+vg Porpora vestigiale pr pr/ vg vg (1) 710 (1) 710 (1) 710 (1)

23 Osservazioni I. Coupling tra pr+ e vg+ e tra pr vg

24 Esperimento di Morgan. II P x pr+ pr+ vg vg occhio rosso ala vestigiale pr pr vg+ vg+ occhio porpora ala normale F1 occhio rosso ala normale pr+ pr vg+ vg

25 Testcross F1 x pr+ pr vg+ vg pr pr vg vg

26 F2 osservati attesi (Mendel) Rosso Normale pr+ pr/ vg+vg Rosso vestigiale pr+ pr/ vg vg Porpora Normale pr pr/ vg+vg Porpora vestigiale pr pr/ vg vg (1) 558 (1) 558 (1) 558 (1)

27 Osservazioni II. Repulsion tra pr+ vg+ e tra pr vg

28 Spiegazione I geni pr e vg sono fisicamente uniti sullo stesso cromosoma, viaggiano insieme nella formazione dei gameti I 2 caratteri vengono ereditati insieme nei gameti per questo motivo e maggiore la frequenza dei fenotipi uguali ai parentali 1 2

29 Come si spiega la comparsa dei non parentali? Morgan sapeva che durante la meiosi i 2 cromatidi non fratelli ma omologhi duplicati si appaiano a formare un chiasma

30 Ricombinanti da assortimento indipendente 50% Fenotipi Perentali 50% Fenotipi Ricombinanti

31 Ricombinanti da crossing-over Fenotipi Perentali >50% Fenotipi Ricombinanti <50%

32 Il crossing over non avviene sempre in tutte le meiosi Il crossing over è un evento raro, solo una parte degli omologhi ricombina; questo spiega perché prevalgono i cromosomi parentali.

33 Ricombinanti nei cicli vitali aploidi semplice da determinare Non c e eterozigosi che puo mascherare il carattere recessivo

34 Ricombinanti nei cicli vitali diploidi testcross Linee pure omozigoti

35 Importanza del testcross

36 Osservazioni III. La proporzione di progenie ricombinante varia a seconda di quali geni sono presi in esame La frequenza di crossing over e quindi di ricombinanti ottenuti puo essere indicativa della distanza tra 2 geni

37 Il numero di crossing over che si puo verificare tra 2 geni e funzione della loro distanza

38 coppie di geni. Maggiore è la distanza tra i geni associati, maggiore è la probabilità che si verifichi uno scambio nella regione compresa tra le due coppie e quindi maggiore è la percentuale di meiosi nelle qualisiverificaunoscambioin questa zona. Quindi, misurando la frequenza di ricombinazione si può ottenere una misura della distanza di mappa tra

39 Mappa di associazione Sturtevant uso la percentuale di ricombinanti come indice quantitativo della distanza lineare di 2 geni locus pr 21+23/400= % 11.0 locus vg u.m. unita di mappa o cm Rosso Normale pr+ pr/ vg+vg Rosso vestigiale pr+ pr/ vg vg Porpora Normale pr pr/ vg+vg Porpora vestigiale pr pr/ vg vg F2 osservati

40 La Mappatura genetica serve per 1.conoscere il genoma di una specie e confrontarlo con quello di specie vicine 2. Diagnosticare malattie genetiche associate a determinati geni (marcatori) 3. Migliorare varietà di interesse zootecnico o agrario mediante costruzione di ceppi particolari

41 Frequenza di ricombinazione (FR) di 0.01 (1%) corrisponde per definizione a 1 u.m. o 1 centimorgan (cm)

42 Incrocio a tre punti P F1 F2

43 Distanza ed ordine dei loci sc/ec/cv 295/3248=0.09 x 100= 9% sc-ec locus sc locus ec 342/3248=0.105 x 100= 10.5% ec-cv 9.0 locus ec locus cv /3248=0.195 x 100=19.5% sc-cv locus sc locus ec locus cv locus sc locus cv

44 P sc/sc ec/ec vg/vg Altro caso X sc+/sc+ ec+/ec+ vg+/vg+ F1 sc/sc+ ec/ec+ vg/vg+ Triplo eterozigote X sc/sc ec/ec vg/vg Triplo recessivo F2 Parentali che assortiscono in modo indipendente con vg sc ec vg sc+ ec+ vg+ sc ec vg+ sc+ ec+ vg sc ec+ vg Non c e rapporto 1:1:1:1:1:1:1:1 Geni associati sc+ ec vg+ 14 sc ec+ vg+ 14 sc+ ec vg

45 Distanza ed ordine dei loci sc/ec/vg /1008=0.055 x 100= 5.5% sc-ec locus sc locus ec /1008=0.498 x 100~ 50% ec-vg locus ec locus vg /1008=0.50 x 100=50% sc-vg 50 locus sc locus vg 50

46 Se la frequenza di ricombinazione e pari al 50% ci dobbiamo chiedere se i geni sono associati o no-> situazione limite In ogni caso, poiche la frequenza dei ricombinanti e 50%, anche se sono sullo stesso cromosoma, li consideriamo NON ASSOCIATI, poiche la loro distanza e talmente grande che la probabilita che intervenga un crossing over a disgiungerli e appunto pari al 100%. Allora il 50% dei gameti sara di tipo parentale (non avra subito il crossing over) e il 50% di tipo ricombinante (avra subito il crossing over) A B a b A b

47 P Altro caso II v+/v+ cv/cv ct/ct X v/v cv+/cv+ ct+/ct+ F1 v/v+ cv/cv+ ct/ct+ Triplo eterozigote X v/v cv/cv ct/ct Triplo recessivo V=vermillion F2 cv= crossveinless ct= cute (ali con bordi sfrangiati) v cv+ ct+ v+ cv ct v cv ct+ v+ cv+ ct v cv ct v+ cv+ ct Non c e rapporto 1:1:1:1:1:1:1:1 Geni associati v cv+ ct 3 v+ cv ct

48 Distanza ed ordine dei loci v/cv/ct /1448=0.185 x 100= 18.5% v-cv locus v locus cv /1448=0.132 x 100~ 13.2% v-ct locus v locus ct /1448=0.064 x 100=6.4% cv-ct 13.2 locus cv locus ct 6.4

49 locus cv locus ct locus v v ct cv+ v+ ct+ cv v ct+ cv+ v+ ct cv classi rare parentali Ricombinanti che derivano da 2 eventi di crossing-over Doppio crossing-over P P

50 Poiche si assume che la distanza di mappa e funzione lineare del numero di crossing-over, ovvero dei ricombinanti, nel calcolare la distanza v-cv dobbiamo considerare i ricombinanti rari 2 volte, perche prodotti da 2 processi di crossingover da cui: /1448=0.196 x 100= 19.6% v-cv E stato possibile individuare il doppio crossing-over poiche il gene intermedio ct e in eterozigosi

51 interferenza Nella maggior parte degli organismi superiori la formazione di un chiasma riduce la probabilità che un altro chiasma si formi in una regione adiacente. Il risultato netto di questa interferenza consiste nella formazione di un minor numero di doppi crossing over di quelli che si attendono rispetto alla distanza di mappa

52 dimostrazione Secondo la regola del prodotto, il prodotto delle frequenze dei ricombinanti nelle regioni adiacenti dovrebbe essere uguale alla frequenza dei doppi ricombinanti Prodotto dei singoli crossing over x 0.064= x 1448= ricombinanti Ma in realta se ne formano solo 8! Stima dell interferenza I = 1 c.o.c =1 c.o.c.= coefficiente di coincidenza Frequenza doppi ricombinanti osservata Frequenza doppi ricombinanti attesa

53 interferenza singolo doppio singolo AB AC BC

54 esempio Il cromosoma 3 del mais contiene 3 loci che possono portare gli alleli b e b+, v e v+, Ig e Ig+. Un incrocio di tripli recessivi con triplo eterozigote F1 per i 3 geni dà origine alla progenie F2 indicata in tabella. Dite qual e la sequenza dei geni sul cromosoma, calcolate la distanza di mappa tra i geni ed il coefficiente di coincidenza. + v Ig 305 Parentali + v Ig triplo b + + b + + b + Ig + v Ig b v b v Ig F2 eterozigote Si calcola la distanza b-v in base al numero dei ricombinanti: /1000=0.18 x 100= 18 u.m. Si calcola la distanza b-ig in base al numero dei ricombinanti: /1000=0.28= 28 u.m.

55 Si calcola la distanza v-ig in base ai ricombinanti: /1000=0.38= 38 u.m. + b + Da cui si ricava che: v b Ig v + Ig 18 u.m u.m.= 46 u.m. 18 u.m 28 u.m 38 u.m. Nel calcolo v-ig abbiamo omesso i doppi ricombianti. Sapendo ora che la sequenza dei geni e v-b-ig possiamo individuare i doppi ricombinanti, ovvero le classi piu rare: v-ig= /1000= 0.46= 46 u.m. I parentali diventano: v + Ig + b +

56 Calcolo del coefficiente di coincidenza c.o.c.= Frequenza doppi ricombinanti osservata Frequenza doppi ricombinanti attesa = FDR(O) FDR(A) c.o.c.= = 40 = 0.79 (0.18 x 0.28) x Interferenza = I = =0.21= 21%

57 Natura del crossing over Nel crossing over avviene uno scambio fisico di pezzi di cromosomi omologhi (Creighton, McClintock) Studio di 2 loci sul cromosoma 9 del mais nodo Colore del seme Composizione dell endosperma Cromosoma 9 del mais Due forme: una aberrante e una normale

58 CC /wx wx x cc /Wx Wx Ricombinanti o Evidenza di scambi cromosomali nei ricombinanti Cc /Wx wx

59 Mappa del cromosoma X di Drosophila

60 Linearita tra frequenza di ricombinazione e distanza di mappa

61 Linearita tra frequenza di ricombinazione e distanza di mappa Quando 2 geni sono molto distanti tra loro si perde la linarita tra frequenza di crossing over e distanza di mappa. Si stima che fino a 20 cm c e linearita. Quando le distanze tra geni sono molto grandi si tende a sottostimarle se ci si basa sulla frequenza di ricombinazione

62 Il crossing-over è molto meno frequente nella regione cromosomica intorno al centromero e nelle altre regioni eterocromatiche ( = povere di geni ), rispetto alle regioni eucromatiche

63 Crossing over mitotico Scoperto in Drosophila (Stern) y colore giallo del corpo sn setole corte e ricurve incrocio y+ sn/y+ sn x y sn+/y y+ sn/y sn+ selvatiche

64 Troppo frequenti per essere un evento mutazionale Macchie gemelle in Drosophila (Stern) In femmine y+ sn / y sn+

65 Crossing over mitotico Separazione dei cromatidi fratelli Macchia gialla Macchia singed

66 Mappe di linkage dei cromosomi umani Problematiche: - Impossibile eseguire incroci controllati con individui testcross (piu facile per l X) - Numero limitato di figli, insufficiente per eseguire un calcolo affidabile delle distanze di mappa - I geni umani posso essere separati da distanze molto grandi (necessita di individuare dei marcatori)

67 Mappe di associazione tramite analisi di alberi genealogici Gli individui che manifestano la sindrome nail-patella (dominante) NPS1 presentano il gruppo B 4/13=0.30=30 %=30 u.m. In realta la distanza NSP1-locus dei gruppi sanguigni e 10 u.m.

68 MAPPAGGIO FISICO localizza i geni sui cromosomi dando una posizione espressa con misure fisiche reali, cioè il numero di paia di basi (bp). 1) a bassa risoluzione: permette di posizionare un gene su un cromosoma o in una regione del cromosoma; 2) ad alta risoluzione: localizza i geni con una precisione fino al singolo nucleotide

69 Mappaggio mediante ibridazione in situ con fluorescenza (FISH) Metodo diretto di visualizzazione della posizione di un gene. Impiega sonde a DNA o RNA marcate con fluorocromi che ibridano su DNA denaturato di cromosomi metafasici. I cromosomi marcati vengono osservati al microscopio a fluorescenza.

70 Un gene clonato puo essere usato per trovarne la posizione sui cromosomi mediante FISH Tre diverse specie di conifere Sonde: 5, 8S, 26S, 18S rosa; SGR-31 DNA satellite (verde)

71 Mappatura dei geni umani mediante ibridi somatici uomo-topo I cromosomi umani vengono persi

72 Per eliminare gli ibridi topo/topo o uomo/uomo e per evitare la perdita dei cromosomi umani si usa un terreno selettivo Terreno HAT H hypoxantina A aminopterina blocca la sintesi de novo degli acidi nucleici T timidina Le cellule murine mancano dell enzima TK fornito dalle cellule umane mentre le cellule umane mancano dell hgprt fornito dalle murine

73 Selezione degli ibridi somatici col sistema HAT Mediante selezione in terreno HAT si possono ottenere ibridi somatici contenenti il gene umano che conferisce resistenza Vie di sintesi dei nucleotidi normale Via di salvataggio delle pirimidine Via di salvataggio delle purine Si ottiene da precursori semplici Timidina chinasi (TK) Timidina->acido timidilico HGPRT ipoxantina ->guanina bloccata da aminopterina Mutante TK- Mutante HGPRT-

74 Mappatura dei geni umani mediante ibridi somatici uomo-topo Sendai virus o PEG Estrazione dei cromosomi e loro analisi per l individuazione

75 Una volta selezionate le cellule ibride vengono organizzate in una banca di linee che contengono ciascun differente cromosoma umano La presenza di uno specifico prodotto genico e correlata con la presenza di uno specifico cromosoma umano

76 Gli ibridi uomo/topo sono utili per determinare marcatori biochimici di cui può essere fatto uno screening a livello cellulare con approccio biochimico, come pure per proteine di superficie (FACS) Ibrido con antigene umano di superficie