La demolizione delle proteine è fondamentale quanto la loro costruzione:

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2 La demolizione delle proteine è fondamentale quanto la loro costruzione: la pepsina, la tripsina, insieme ad altri enzimi proteolitici, spezzettano le proteine complesse del cibo in amminoacidi, passaggio indispensabile per l assimilazione, che avviene nello stomaco e nell intestino. L eliminazione delle proteine è essenziale anche nel ciclo riproduttivo delle cellule, nella riparazione degli errori di copiatura del DNA e nelle reazioni del sistema immunitario che ci difendono dalle infezioni e dalle aggressioni dell ambiente. Anche in malattie come il cancro e la fibrosi cistica il ruolo dell ubiquitina è determinante. Errori nella demolizione di proteine alterate sono all origine di molte malattie, ed è per questo motivo che le scoperte compiute dai tre ricercatori premiati con il Nobel possono aprire la strada a nuovi farmaci, in grado di curarle alla radice.

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8 In realtà l operazione è più complessa e richiede l intervento di tre enzimi. Il primo, chiamato E1, attiva la molecola di ubiquitina, e questa reazione richiede energia, liberata da una molecola di ATP. Il secondo enzima, E2, si lega all ubiquitina attivata e il terzo, E3, individua l oggetto da demolire. Il complesso ubiquitina-e2 aderisce strettamente alla proteina ed E3 rilascia la proteina marcata con l ubiquitina. L operazione si ripete finché si apre il proteosoma, cioè il tritatutto, che staccando l ubiquitina (che sarà di nuovo disponibile per il suo lavoro), smonterà la proteina pezzo a pezzo. Il meccanismo è stato chiarito da Rose, Ciechanover ed Hershko nel 1983 con esperimenti su topi transgenici.

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10 Per alcune proteine gli chaperoni molecolari partecipano al processo di avvolgimento, questa classe di molecole : contribuiscono al corretto avvolgimento di una proteina nascente consentono alle proteine ripiegate in modo non corretto di raggiungere la conformazione nativa

11 Esistono due classi di chaperoni molecolari : la famiglia Hsp70 e le chaperonine (Hps60 o GroEL ed o Hsp10 GroES )

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13 Le chaperonine sono costituite da due tipi di proteine HP60 (GroEL) e HP10 (GroES) GroEL 14 subunità identiche (549 aa) disposte in due anelli sovrapposti (7+7) GroES 7 subunità identiche (97aa) formano un anello eptamerico

14 L informazione per il folding della proteina è contenuta nella sequenza

15 Proteine denaturare al calore, con acidi, o chimici perdono la struttura terziaria e secondaria e la funzione biologica. Il processo è reversibile

16 Le chaperonine assistono le proteine nella fase di folding, prevenendo il legame con ligandi inappropriati.

17 Molte malattie sono dovute al difettoso ripiegamento di una proteina Alcune patologie derivano da proteine che non sono in grado di raggiungere la loro struttura funzionale e che tendono a formare grossi aggregati (fibrille o forme amiloidi): Alzheimer, Parkinson, encefalopatia spongiforme, diabete di tipo II. In altri casi mutazioni puntiformi generano proteine che non raggiungono la loro locazione finale o che non sono più in grado di svolgere la loro funzione perché incapaci di legare i loro substrati. La fibrosi cistica è un difetto nella proteina transmembrana che agisce come un canale degli ioni cloro nelle cellule epiteliali (CFTR: 1480 amminoacidi). La mutazione più comune è la delezione di un amminoacido (Phe 508) e la proteina mutata non si avvolge correttamente.

18 Proteine conformate in modo aberrante sono implicate nello sviluppo di patologie Una placca amiloide nella malattia di Alzheimer è un agglomerato di filamenti proteici

19 L omologia delle sequenze suggerisce relazioni funzionali ed evolutive tra le proteine

20 Comparazione sequenze Hum aglobina: Bovis: Pig: mvlspadktn vkaawgkvga hageygaeal mvlsaadkgn vkaawgkvgg haaeygaeal vlsaadkan vkaawgkvgg qagahgaeal ermflsfptt ktyfphfdls hgsaqvkghg kkvadaltna vahvddmpna ermflsfptt ktyfphfdls hgsaqvkghg akvaaaltka vehlddlpga ermflgfptt ktyfphfnls hgsdqvkahg kvadaltka vghlddlpga lsalsdlhah klrvdpvnfk llshcllvtl aahlpaeftp avhasldkfl lselsdlhah klrvdpvnfk llshsllvtl ashlpsdftp avhasldkfl lsalsdlhah klrvdpvnfk llshcllvtl aahhpddfnp svhasldkfl asvstvltsk yr anvstvltsk yr anvstvltsk yr

21 Degradazione Proteica Regolata Sistema autofagico lisosomiale Sistema Calpaina-Calpastatina Sistema Ubiquitina-Proteasoma

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23 Il sistema proteolitico calpaina/calpastatina è espresso nel citosol di tutte le cellule di mammifero ed è costituito da uno o più membri della famiglia delle calpaine e da una o più forme dell'inibitore calpastatina. La famiglia della calpaine è costituita da circa 15 membri che hanno in comune una serie di proprietà catalitiche e regolatrici. Una delle caratteristiche comune a tutte le forme di calpaina è la suddivisione del dominio catalitico in due sottodomini.

24 Modificato da: La Stampa, 7 ottobre 2004 Il premio Nobel per la Chimica 2004 è stato attribuito ai tre ricercatori che più hanno contribuito alla scoperta della«catena di smontaggio» delle proteine: sono l americano Irwin Rose, Università della California, e gli israeliani Aaron Ciechanover e Avram Hershko, entrambi dell Institute of Technology di Haifa.

25 Il collagene (o collageno) è la principale proteina del tessuto connettivo negli animali. È la proteina più abbondante nei mammiferi (circa il 25% della massa proteica totale), rappresentando nell'uomo circa il 6% del peso corporeo. L'unità strutturale del collagene è rappresentata dal tropocollagene, proteina con una massa molecolare di circa 285 KD formata da tre catene polipeptidiche con andamento sinistrorso che si associano a formare una tripla elica destrorsa (trans di tipo - 2). Solitamente, per il collagene di tipo I, sono presenti due catene alfa 1 e una catena alfa 2. Tutte le unità di tropocollagene hanno la stessa lunghezza e la stessa ripetitività di amminoacidi, che si caratterizzano per una tripletta gly-pro-x, molto rappresentata nella sequenza delle singole catene alfa 1 e alfa2

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52 Il collagene ha una conformazione a tripla elica dx, la presenza della prolina è un fattore determinante per questa conformazione, le singole eliche sono stabilizzate da legami idrogeno. Resi possibili dalle glicine e dalle modifiche post-traduzionali di lisina e prolina. Entrambi questi amminoacidi subiscono un'idrossilazione (OH). La pro è modificata a HO-pro dall'enzima Prolil Idrossilasi; mentre la lisina è modificata a idrossilisina dall'enzima Lisil Idrossilasi, che inserisce il gruppo OH nella catena laterale della lisina. Entrambi gli enzimi agiscono in presenza del cofattore acido ascorbico e del co-substrato alfa-chetoglutarato. Queste modifiche sono necessarie per aumentare la possibilità di formazione dei legami H e per diminuire l'ingombro sterico. Le tre unità strutturali assumono una forma simile a una treccia. Le varie fibre sono legate da legami crociati tra due allisine o tra una lisina e un'allisina. La lisina è convertita in allisina dall'enzima Lisina Ossidasi, che inserisce al posto del gruppo amminico della catena laterale della lisina in corrispondenza dell'ultimo carbonio (carbonio epsilon) un gruppo aldeidico. Quando avviene il legame crociato si verifica una condensazione tra il gruppo amminico e il gruppo aldeidico che unisce le due catene con un legame imminico P. Champe, R. Harvey, D. R. Ferrier, LE BASI DELLA BIOCHIMICA, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006

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59 Idrossilazione della lisina

60 La biosintesi del collagene avviene ad opera di diversi tipi cellulari (ad esempio fibroblasti nel tessuto connettivo, osteoblasti nell osso). I inizia con la trascrizione del gene o dei geni e la maturazione dell mrna. Sono presenti sequenze che codificano per lunghi peptidi in eccesso rispetto alle molecole di collagene mature, quindi il collagene nasce come procollagene, prodotto che possiede rispetto al collagene due telomeri, uno N-Terminale e uno C-Terminale, che hanno struttura globulare. La traduzione avviene a livello dei ribosomi a ridosso della parete del RER (reticolo endoplasmatico rugoso) e la catena nascente di procollagene subisce rimozione del peptide segnale e idrossilazione di specifici residui di prolina e lisina ad idrossiprolina e idrossilisina (ad opera di idrossilasi, con cofattore essenziale la vitamina C), con la produzione di catene alfa di procollagene. Tre di queste catene si avvolgono a formare una tripla elica, stabilizzata da legame a idrogeno tra amminoacidi idrossilati (legami crociati). Questa elica passa nell apparato del Golgi dove viene completata la glicosilazione e da qui, attraverso vescicole di secrezione la molecola viene secreta all esterno. All esterno della cellula la molecola subisce l azione di alcune procollageno peptidasi, che rimuovono i residui N-terminali e C-terminali trasformando il procollagene in tropocollageno 2 telomeri, uno N-terminale e uno C-terminale P. Champe, R. Harvey, D. R. Ferrier, LE BASI DELLA BIOCHIMICA, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006

61 Le molecole di tropocollagene si dispongono in file parallele a formare fibrille. Le fibrille infine possono disporsi in fasci ondulati o paralleli per formare fibre e le fibre possono formare fasci di fibre. P. Champe, R. Harvey, D. R. Ferrier, LE BASI DELLA BIOCHIMICA, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006

65 Più di 1000 mutazioni nei 22 geni che cod. per il collageno e la sua sintesi, sono causa di molte patologie. La sindrome di Ehlers-Danlos (EDS) si origina da: Carenza di lisil/prolil idrossilasi o carenza di procoll. peptidasi, o da mutazioni puntiformi della sequenza aminoacidica. Mutazioni del collageno di tipo III, importante componente delle arterie, è causa di disturbi vascolari potenzialmente letali. Si associa anche a lassità della cute, oltre che articolare. P. Champe, R. Harvey, D. R. Ferrier, LE BASI DELLA BIOCHIMICA, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006

67 Osteogenesi imperfetta (OI) o sindrome delle ossa di vetro, comprende un gruppo eterogeneo di patologie ereditarie. Tipo I, OI tardiva, si manifesta nella prima infanzia con fratture secondarie a traumi di minore entità, si può ipotizzare se l ecografia prenatale mostra incurvature o fratture nelle ossa lunghe. OI di tipo II o congenita, I pazienti muoiono prima della nascita o subito dopo il parto per insufficienza respiratoria P. Champe, R. Harvey, D. R. Ferrier, LE BASI DELLA BIOCHIMICA, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006

69 ELASTINA L'elastina è una proteina costituente il tessuto connettivo che è elastica e permette a molti tessuti dell'organismo di tornare alla loro forma originaria dopo essere stati sottoposti a forze di stiramento o di contrazione. L'elastina è un costituente fondamentale della pelle, conferendole la caratteristica risposta elastica quando il tessuto è sottoposto a tensioni meccaniche. Il locus è Chr. 7 q , P. Champe, R. Harvey, D. R. Ferrier, LE BASI DELLA BIOCHIMICA, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006

70 Composizione L'elastina è principalmente composta dagli amminoacidi glicina, valina, alanina e prolina. Strutturalmente è formata da molte molecole di tropoelastina (ad alfa-elica), idrosolubile e con massa molecolare di circa dalton, legate da legame covalente formatosi in seguito a reazione catalizzata da lisil ossidasi. Il prodotto finale consiste in un voluminoso composto insolubile con resistenti legami crociati di lisina. Desmosina e isodesmosina sono proteine entrambe riscontrate nell'elastina. P. Champe, R. Harvey, D. R. Ferrier, LE BASI DELLA BIOCHIMICA, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006

71 Localizzazione L'elastina svolge un ruolo importante nelle arterie ed è particolarmente abbondante nei grandi vasi sanguigni come l aorta. È anche un costituente strutturale molto importante dei polmoni, dei legamenti, della pelle, della vescica e della cartilagine. P. Champe, R. Harvey, D. R. Ferrier, LE BASI DELLA BIOCHIMICA, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006

72 L Elastina è un polimero insolubile formato da tropoelastina, una proteina lineare di 700aa., prevalentemente piccoli e apolari (gly, ala, val). Inoltre presenta pro, e lys, ma solo tracce di HyPro e manca di HYLYs. La tropoelastina viene secreta dalle cellule nello spazio extracellulare dove interagisce con una glicoproteina, la fibrillina, che ha funzione di impalcatura. Le lys di tre catene di tropoelastina vengono deaminate (D. Ossidativa) e le allisine di 3 catene di tropoelastina contigue con una lys, non modificata formano un legame crociato di desmosina P. Champe, R. Harvey, D. R. Ferrier, LE BASI DELLA BIOCHIMICA, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006

74 Sindrome di Marfan dovuta ad una elastina sbagliata: Le cause: La MFS è una malattia genetica, dovuta all alterazione di un gene. All inizio degli anni 90, è stato identificato sul cromosoma 15 il difetto genetico che causa la MFS. Si tratta di alterazioni (mutazioni) del gene della fibrillina-1 (FBN1). La fibrillina-1 è una grossa glicoproteina, che costituisce una componente importante delle fibre elastiche presenti nel tessuto connettivo. Le mutazioni che causano la MFS, e quindi una fibrillina-1 difettosa, sono numerose: a tutt oggi sono note circa 500 diverse mutazioni del gene FBN1 e questo rende particolarmente difficile effettuare una diagnosi genetica per identificare la presenza di una mutazione. Mutazioni nel gene della fibrillina-1 sono responsabili anche di altre malattie come la lussazione isolata familiare del cristallino e, in parte, dell aneurisma aortico-toracico familiare, mentre un altro gene della fibrillina, localizzato sul cromosoma 5, è associato alla Sindrome di Beals. Disturbi cardiovascolari. I disturbi più severi riguardano il sistema cardiovascolare. Il problema maggiore è costituito dalla dilatazione dell aorta Disturbi dell apparato scheletrico. Le persone affette da MFS hanno un aspetto dinoccolato e longilineo, con arti e mani lunghe e sottili. Le articolazioni sono lasse, con lussazioni spesso ricorrenti. Spesso è presente piede piatto. Si possono avere anche deformità della gabbia toracica come il petto carenato (sterno all infuori) e il petto escavato (sterno verso l interno), e problemi alla spina dorsale come scoliosi e lordosi di gravità variabile. Un altro difetto frequente è la miopia. P. Champe, R. Harvey, D. R. Ferrier, LE BASI DELLA BIOCHIMICA, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006

76 L antitripsina a (a1-at), prodotta da fegato, ma anche monociti e macrofagi alveolari impedisce la degradazione dell elastina nelle pareti alveolari. Una a 1-AT difettosa può causare enfisema. Dal 2 al 5% dei pazienti affetti da enfisema negli USA, c è una predisposizione genetica per difetto del gene per a1- antitripsina. P. Champe, R. Harvey, D. R. Ferrier, LE BASI DELLA BIOCHIMICA, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006