ASSICURAZIONE QUALITÀ DEI DATI IN MICROBIOLOGIA
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- Giuliana Rizzi
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1 IX MEETING DEI RESPONSABILI E TECNICI DI LABORATORIO DEL SETTORE LATTIERO-CASEARIO MontegrottoTerme, 4-5 Dicembre 2008 ASSICURAZIONE QUALITÀ DEI DATI IN MICROBIOLOGIA Giuseppina Pedota Laboratorio APA Potenza 1
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3 METODI QUANTITATIVI 3
4 4 er i metodi quantitativi si seguono le prescrizioni della ISO 7218:2007, ssia si considera una piastra per ogni diluizione e due diluizioni uccessive. er il calcolo dello scarto tipo di riproducibilità (S R ) si è deciso di seguire la prima opzione del par. 4.2 della ISO/TS19036:2006, secondo cui è possibile calcolare lo scarto tipo intralaboratorio. i è provveduto, quindi: Ad eseguire una serie di prove su un materiale opportunamente contaminato; Ad esaminare i dati di laboratorio dell ultimo anno per le differenti matrici.
5 opo aver sottoposto i dati alla elaborazione così come descritto al par..3 della ISO/TS 19036, ovvero : s R = 1 n n i = 1 ( y ia y 2 ib ) 2 on ij = dati trasformati in log 10 (cfu/g o cfu/ml) = indice del campione, i = 1,, n per n 10 = indice della condizione di riprobucibilità, j = A o B. 5
6 6 Come esprimere, allora, i risultati d analisi? l par. 8 della ISO/TS vengono presentate diverse ossibilità di espressione dei risultati: y ±2s R (log) y log [y - 2s R, y + 2s R ] x cfu/g o x cfu/ml [10 y - 2s R, 10 y + 2s R] 10 y - 2s R 10 y + 2s R x cfu/g o x cfu/ml [10 y - %, 10 y + %] 10 y 10 y Si è deciso di esprimere il risultato secondo la terza opzione
7 METODI QUALITATIVI 7
8 8 resso il nostro laboratorio si eseguono determinazioni qualitative per a rivelazione della Presenza/Assenza di: Salmonella spp (ISO 6579) Listeria monocytogenes (ISO , Amd 1) Sostanze inibenti nel latte (M.I.)
9 n metodo per calcolare le incertezze di misura nelle prove qualitative a riferimento alla Regola (o Teorema) di Bayes, ossia si va a eterminare la probabilità a priori che si verifichi un esito positivo econdo la formula seguente: p( H D) = p( H ) p( D p( H ) p( D H ) H ) + p( nonh ) p( D nonh ) on: (H D) = valore predittivo positivo (H) = frequenza di positivi (tasso di base) (D nonh) = frequenza di falsi positivi = 1 - specificità (D H) = frequenza di veri positivi = sensibilità = diagnosticati; H = positivi 9
10 10 a formula precedente potrebbe, in linea di principio essere emplificata nel seguente modo: p( positivo esitopositivo) = n a na + n b Con: n a = positivi n b = negativi
11 aturalmente, tutto questo potrebbe risultare ostico quando a leggere n rapporto di prova non è un tecnico ma un utente comune, non ddentro, cioè, alla delicata materia statistica. tal proposito si è ritenuto più opportuno considerare i valori di ensibilità e specificità associati, rispettivamente, ai campioni positivi ed i campioni negativi, secondo le seguenti formule: sensibilità on: = a a + b = veri positivi; b = falsi negativi; = falsi positivi; d = veri negativi. specificità = c d + d UNI EN ISO 13843:2003) 11
12 12 a sensibilità rappresenta, quindi, la percentuale di campioni, analizzati orrettamente, riscontrati come positivi. a specificità rappresenta, quindi, la percentuale di campioni, analizzati orrettamente, riscontrati come negativi. ISO :1996/ Amd. 1:2004) uesti due dati sembrano dare, in modo abbastanza immediato, idea ella validità del dato analitico. dati ottenuti in laboratorio, per citarne uno, ad esempio per la eterminazione della Presenza/Assenza della Listeria monocytogenes, ono confrontabili con quelli riportati dalla Norma; il confronto è stato ffettuato utilizzando il test F di Fisher.
13 13 ltre alla logica e sempre auspicabile partecipazione ai Circuiti nterlaboratorio per le prove microbiologiche e qualitative e uantitative, un ulteriore controllo qualità del dato analitico viene seguito effettuando prove di ripetibilità e valutando con cadenza iennale e per ciascun analista abilitato il limite di rivelabilità ed il imite di quantificazione. pesso si è trovato che il limite di rivelabilità coincide con il limite di uantificazione. noltre, ancor più spesso si trova che il limite di rivelabilità è alla stessa iluizione per i due analisti qualificati.
14 14 Per toccare tutti i punti di controllo usati dal laboratorio per l assicurazione dei dati in microbiologia, bisogna menzionare le prove di campionamento da superfici, per le quali non esistono circuiti interlaboratorio che permettano di misurare la bontà del passaggio pre-analitico effettuato da personale in forza al laboratorio stesso nell ambito dei controlli HACCP. perativamente, si è proceduto al recupero da superfici di CBT, E. coli, oliformi totali, Salmonella spp, Listeria monocytogenes.
15 rima di effettuare le prove riguardanti la CBT, gli Escherichia coli ed i oliformi totali, si è proceduto alla sanificazione della superficie su cui ffettuare il test, utilizzando composti a base di cloro (candeggina ommerciale). Il prelievo viene effettuato utilizzando delimitatori d area 0 cm x 10 cm. a CBT è stata determinata con un metodo interno; si è deciso di eminare le diluizioni 10-6, 10-7 e 10-8 della sospensione iniziale. li E. coli sono stati determinati con il metodo UNI 10980:2002; si è eciso di seminare le diluizioni 10-5, 10-6,10-7 e 10-8 della sospensione niziale. Coliformi totali sono stati determinati con un metodo interno; si è tabilito di seminare le diluizioni 10-6, 10-7 e er ciò che concerne le prove di recupero di Listeria monocytogenes e almonella typhimurium, invece, la superficie di 1 m x 1 m è stata ivestita con un film di alluminio. ono state effettuate 8 prove per ogni diluizione e per ciascun analista ualificato. e modalità operative sono riportate nei flow-chart delle slide uccessive. 15
16 16 CBT, E. coli, Coliformi totali Listeria monocytogens
17 17 Salmonella spp. Per la determinazione della Salmonella spp. il metodo utilizzato è la ISO 6579:2002 e ISO 6579:2002/Cor.1:2004. Per la determinazione della Listeria monocytogenes il metodo utilizzato è la ISO 11290:1996 e ISO 11290:1996/Amd.1:2004.
18 er la CBT e per i Coliformi totali il limite di rivelabilità è pari a ~ 10-7, er gli Escherichia coli, dai dati ottenuti, si evince che il limite di ilevabilità è pari a ~ I dati ottenuti e in questa sede omessi per vvie ragioni di tempo, sembrano trovare conforto con quanto iportato dalle norme ISO (Metodo di campionamento da arcasse) e ISO (Tecniche di campionamento da superfici) er le prove di recupero per la Salmonella spp e la Listeria onocytogenes si sono ottenuti recuperi, partendo da concentrazioni di atogeni pari a ~ ufc/ml, fino alla diluizione 10-7 che si itengono soddisfacenti. Inoltre, è possibile affermare che il nostro imite di rivelabilità per Listeria e Salmonella è pari a
19 Per il calcolo statistico basato sulla distribuzione di Poisson: Varianza = media (C m ), pertanto s = (C m ) 1/2 Scarto tipo relativo = s/c m =1/(C m ) 1/2 Per conteggi inferiori a 15 ufc/pistra si fa riferimento a ai valori tabulati nella ISO 7218:1996 circa la distribuzione di Poisson. Per conteggi superiori a 15 ufc/piastra nelle prove in doppio è possibile fare una approssimazione della distribuzione di Poisson alla distribuzione normale, pertanto, il limite di Ripetibilità è dato da: Con Kp = 1,96 per p = 95% C 1 -C 2 /(C 1 +C 2 ) 1/2 = Kp 1,96 Kp 2,576 per p compreso tra 95% e 99% Kp > 2,576 per p > 99% 19
20 Se il numero di prove replicate è maggiore di 2, ed almeno cinque, i dati devono essere sottoposti al test del χ 2 sperimentale che viene confrontato con quello tabulato; inoltre, i dati vanno sottoposti al test di Huber o della mediana per verificare la presenza tra i dati restituiti dalle prove di dati anomali. È auspicabile anche l applicazione del test di proporzionalità della risposta analitica rispetto a due o più piastre seminate in parallelo per ogni livello di diluizioni. Le formule da applicare ed esempi di applicazioni delle stesse sono facilmente rintracciabili sul sito dell ARPA Emilia Romagna: La validazione dei metodi microbiologici: aspetti applicativi, controllo del processo analitico e valutazione dell operatore Lido Ballati (Atti della Giornata di Formazione Bologna 25 novembre 2004) 20
21 21 A questo mondo non c è niente di certo, a parte la morte e le tasse (Benjamin Franklin)
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