L Anemia falciforme A cura di Dott.ssa Marianna Raimo Dipartimento di Biochimica e Biofisica F. Cedrangolo

Transcript

1 L Anemia falciforme A cura di Dott.ssa Marianna Raimo Dipartimento di Biochimica e Biofisica F. Cedrangolo

2 Le varianti mutanti dell emoglobina Mutazioni che interessano la superficie della molecola di Hb (es: HbS) Mutazioni che interessano il sito attivo (es: sostituzione dell Hys prossimle o distale con una Tyr) Mutazioni che interessano la struttura terziaria (folding) Mutazioni che interessano la struttura quaternaria (modificazioni allosteriche)

3 Qualche caso in particolare Hb Hammersmith: (mutazioni puntiformi: UUC in UCC o UUU in CUU). Sostituzione di una Phe adiacente all eme con una Ser. Destabilizzazione del legame con l eme e produzione di Hb instabili (Hb Ginevra; Hb Colonia) Rivelazione: elettroforesi dell Hb e test di stabilità all isopropanolo

4 Qualche caso in particolare Sindrome da Hb iperinstabile: stato simil talassemico ereditato come carattere dominante. L Hb instabile danneggia gravemente gli eritrociti in modo da provocare grave anemia!! Rivelazione: analisi del DNA!!

5 Qualche caso in particolare Hb Zurigo ed Hb Yakima: Hb ad alta affinità per l ossigeno Massiva liberazione di Epo Periodici salassi Aumentata massa di RBC (policitemia) Hb Kansas: Hb a ridotta affinità per l ossigeno Lieve anemia asintomatica

6 Anemia Falciforme - Cenni storici: Le popolazioni del Ghana conoscono la malattia da molti secoli e già nel 1600, riferendosi alle crisi dolorose caratteristiche della patologia, le avevano dato nomi che ne sintetizzano magistralmente le caratteristiche: corpo tormentato, battuto, morsicato. Ma ovviamente nulla sapevano della falcizzazione degli eritrociti!!

7 Anemia Falciforme - Cenni storici: Nel 1904 James Herrick esaminò uno studente negro di 20 anni, che presentava debolezza, vertigini, mal di testa, febbre,tosse, palpitazioni e difficoltà respiratorie. Il bianco degli occhi era giallo, le mucose pallide ed il cuore ingrossato. Era presente una severa anemia. La forma dei globuli rossi era molto irregolare, ma ciò che attirava l attenzione erano cellule sottili, allungate a forma di falce o di mezza luna ( Peculiari corpuscoli rossi del sangue a forma allungata e di falce in un caso di anemia grave. James Herrick 1904)

8 Anemia Falciforme - Cenni storici: La prima osservazione italiana è stata fatta nel 1936 da Maggiore. Nel 1944 Silvestroni e Bianco descrissero il primo caso al mondo di associazione con la talassemia che chiamarono "microdrepanocitosi" in una ragazza del Lazio, la quale presentava febbre, dolori ed un aumento di volume del fegato e della milza. La diagnosi fu fatta con il semplice test di falcizzazione, poiché in quegli anni non si conosceva ancora la tecnica elettroforetica. In questa forma uno dei genitori è portatore sano di talassemia e l'altro di drepanocitosi. Nel figlio le due anomalie si sommano e danno malattia.

9 Anemia Falciforme - Cenni storici: Negli anni successivi furono definite le basi genetiche dell'anemia drepanocitica: Silvestroni e Gatto in Italia e Neel negli Stati Uniti evidenziarono le modalità di trasmissione ereditaria, dimostrando così che la malattia non è contagiosa, né secondaria a malattie infettive o a carenze alimentari ma solo ereditaria. Nel 1949 Pauling dimostrò che l'hb S sotto l'azione di un campo elettrico (elettroforesi) si sposta più lentamente dell'hb A, dalla quale quindi si può facilmente distinguere. I soggetti ammalati hanno quasi esclusivamente Hb S, mentre i loro genitori, chiamati portatori, hanno per metà Hb A e per metà Hb S. Questa scoperta gli valse il premio Nobel, che fu assegnato anche a Vernon Ingram dell Università di Cambridge, che nel 1959 dimostrò che dei 534 amminoacidi che costituiscono l Hb A uno solo è diverso nelle catene ß dell Hb S.

10 Anemia Falciforme o Drepanocitosi - Non è una malattia rara: l incidenza è molto alta soprattutto tra i negri dove è circa 4 per Le cellule a forma di falce contengono un emoglobina anomala, l HbS, responsabile della falcizzazione. - E trasmessa geneticamente

11 I globuli rossi tendono ad assumere la forma a falce in vitro quando viene ridotta la concentrazione di ossigeno. Quando ciò accade l HbS è prevalentemente deossigenata, la sua solubilità è enormemente ridotta e viene prodotto un precipitato fibroso che induce la falcizzazione.

12 L HbS è generata da una mutazione puntiforme del gene β globinico in cui una A è sostituita con una T (GTG/GAG) e quindi è codificata una Val al posto di un Glu, in posizione 6 della catena globinica. I legami patologici avvengono tra il residuo di Val anomalo ed una tasca idrofobica tra i residui di Ala70, Phe85, Leu88 della catena β globinica adiacente. Questo accade quando l Hb è in forma deossigenata.

13 I pazienti con anemia falciforme sono omozigoti per la mutazione. La prole che riceve un gene selvatico da un genitore ed il suo allele mutato dall altro genitore è un eterozigote che avrà il tratto a cellule falciformi e sarà di norma asintomatico (se non è esposto ad ipossia di grado elevato non presenta né emolisi né anemia). Solo l 1% degli RBC degli eterozigoti è a forma di falce, mentre negli omozigoti si hanno valori di circa il 50%

14 Individuo normale Individuo con tratto falciforme Individuo falciforme

15 La formazione di HbS ha 2 principali conseguenze: 1) Anemia emolitica cronica 2) Occlusione dei piccoli vasi che determina un danno tissutale ischemico

16 Le fibre che precipitano all interno dei globuli rossi prendono il nome di TACTOIDI ed hanno un diametro di 21.5nm. La sezione trasversale della fibra contiene 14 molecole di HbS La cinetica della polimerizzazione prevede una fase lenta e reversibile ed una fase di reazione rapida ed irreversibile.

17 Il ripetersi di episodi di falcizzazione e di ritorno allo stato normale induce un danno di membrana a livello degli RBC e la lroo falcizzazione irreversibile (CIF), anche se esposti a forti concentrazioni di ossigeno e nonostante la depolimerizzazione dell HbS Le CIF presentano membrane cellulari molto rigide ed indeformabili e per tanto incontrano difficoltà nell attraversamento dei sinusoidi splenici.

18 Le CIF sono sequestrate dalla milza, dove vengono eliminate dal sistema fagocitico mononucleato. Si può anche verificare emolisi intravascolare, dovuta all aumentata fragilità meccanica delle CIF. La vita media degli RBC è correlata al numero delle CIF in circolo ed è ridotta di circa 20 giorni rispetto agli RBC normali.

19 Il decorso clinico della patologia è cronico ma intervallato da crisi di dolore acuto. L emolisi cronica conduce ad anemie gravi con Ht=18-30%. Le crisi vaso-occlusive, dette anche crisi dolorose, rappresentano episodi di danno ipossico ed infarto. Il dolore è intenso ed interessa l addome, il torace o le articolazioni, a seconda del territorio in cui si verifica l insufficienza vascolare. Criteri diagnostici: osservazione degli strisci di sangue periferico (comparsa dei corpi di Howell- Jolly); mescolamento del sangue con reagenti che consumano ossigeno (metabisolfito); elettroforesi dell Hb.

20 Alterazioni anatomiche!! Aumentata distruzione degli RBC a falce con sviluppo di anemia: - pallore della cute - sovraccarico sistemico di ferro - midollo iperplastico per espansione dei normoblasti - all esame radiologico si osserva la formazione del cranio a spazzola - AUTOSPLENECTOMIA Liberazione di Hb e formazione di bilirubina: - calcoli biliari di pigmento - marcata iperbilirubinemia, soprattutto durante i periodi di emolisi attiva Stasi capillare e trombosi: - infarti secondari all occlusione vascolare e all anossia a carico di ossa, encefalo, rene, fegato, retina

21 -Consulenza genetica - Campioni di liquido amniotico. E LA DIAGNOSI PRENATALE??? - Prelievi bioptici di villi corionici, dopo circa 8 settimane di gestazione. Digestione con l enzima di restrizione MstII che taglia nella palindrome CCTNAGG presente nel gene della β-globina dell HbA ma non in quello dell HbS.

22 Correlazione fra la frequenza di HbS e la presenza di malaria endemica Polimorfismo bilanciato: un allele altamente deleterio in un omozigote persiste perché lo stato eterozigote è vantaggioso. La malaria, in questo caso, rappresenta un fattore di pressione selettivo positivo. La frequenza del gene per l HbS è circa dal 40% in alcune parti dell Africa!!

23 La condizione di eterozigosi rende i soggetti infettati dal Plasmodim falciparum meno sensibili all azione patogena del parassita malarico, in quanto gli RBC infetti tendono a falcizzare maggiormente e questo interferisce negativamente con il ciclo di replicazione del protozoo. Gli RBC deformati vengono rapidamente eliminati.

24 Tra gli americani di origine africana, circa uno su dieci portatore dell allele per l anemia falciforme. La probabilità di un matrimonio (tra afro-americani) tra due portatori è quindi di 1 su 100 1/10 x 1/10 = 1/100

25 Gli individui eterozigoti non mostrano sintomi in condizioni normali. Tuttavia essi possono rivelare la loro condizione se sottoposti ad una sensibile riduzione nella concentrazione dell ossigeno (ad esempio in alta montagna). Questo avviene perché negli eterozigoti c è codominanza a livello molecolare. Se due eterozigoti hanno figli Aa x Aa -> ¼ aa ½ Aa ¼ AA un quarto dei loro figli sarà affetto!!

26 INTERVENTI TERAPEUTICI Non esistono farmaci antifalcizzanti. Le emotrasfusioni sono utilizzate solo nelle anemie gravi (durante le crisi aplastiche). Il trattamento delle crisi dolorose, che possono durare anche 5 giorni, prevede abbondanti somministrazioni di liquidi e analgesici, compresi i narcotici. L obiettivo terapeutico è mantenere il valore di HbA > 50% CELLULE STAMINALI E TERAPIA GENICA!!!!!!!!!!!!!

27 22/03/2005 RIUSCITO IL TRAPIANTO DI STAMINALI PER SCONFIGGERE L'ANEMIA FALCIFORME

28 29/04/2005 Trapianto guarisce bimba con anemia falciforme IL TRAPIANTO DI CELLULE STAMINALI PRELEVATE DAL CORDONE OMBELICALE DELLA SORELLINA, L'HA GUARITA!!

29 Speranze di Guarigione - Terapia Genica dell'anemia Falciforme (Aprile 2006) La collaborazione tra il gruppo di lavoro Unità di ricerca Piera Cutino e quello diretto dal Prof. Michel Sadelain del Memorial Sloan-Kettering Cancer Center di New York ha prodotto un risultato importante per la Terapia Genica della anemia falciforme. I risultati di questo studio sono stati pubblicati a Gennaio dalla prestigiosa rivista internazionale Nature Biotechnology in un articolo dal titolo Una strategia genetica per trattare l anemia falciforme regolando in maniera sinergica l espressione del transgene e quella di un RNA interferente.

30 ELETTROFORESI L'elettroforesi è un metodo di separazione basato sulla diversa velocità di migrazione di particelle elettricamente cariche attraverso una soluzione, sotto l'influenza di un campo elettrico L'elettroforesi è un metodo di separazione eccellente per macromolecole ed in particolare per proteine e frammenti di DNA; per questo è molto utliizzato in biochimica e in biologia molecolare

31 MOBILITÀ ELETTROFORETICA DELLE MACROMOLECOLE Forza elettrica : F el = q E Forza frizionale : F fr = f v (f = 6π r η) Quando le forze si bilanciano: v = velocità della molecola E = voltaggio applicato q = carica netta della molecola f = coefficente frizionale q E = f v v = Eq/f v q mobilita elettroforetica : µ = = E f

32 APPLICAZIONI ANALITICHE Proteine 1. Determinazione del peso molecolare 2. Criteri di purezza 3. Quantizzazione Acidi nucleici 1. Determinazione del peso molecolare 2. Analisi di sequenza 3. Quantizzazione

33 APPARECCHIATURA PER L'ELETTROFORESI un alimentatore elettrico in CC 2 elettrodi 2 vaschette contenenti un elettrolita (tampone) un supporto

34 ALIMENTATORE

35 CELLA ELETTROFORETICA

36 SUPPORTI Supporti comunemente usati per l'elettroforesi: Cellulosa (carta) Acetato di cellulosa Silice (gel) Amido (gel) Agarosio (gel) Poliacrilamide (gel) Sephadex (gel) Le proteine e gli acidi nucleici, vengono separati su supporti di gel di agarosio o poliacrilamide I gel si preparano subito prima dell'uso partendo da solidi in polvere quali amido, agar, acrilamide

37 Elettroforesi su gel di Poliacrilamide Utilizzato prevalentemente per la separazione di proteine. I gel sono preparati facendo polimerizzare monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantità di N,N metilenbisacrilammide. La polimerizzazione inizia con l aggiunta di ammonio persolfato (APS) e N,N,N,N -tetrametiletilenediamine (TEMED).

38 ELETTROFORESI SU GEL

39 Il TEMED catalizza la decomposizione dello ione persolfato: si producono radicali liberi che attaccano i monomeri di acrilammide e ne avviano la polimerizzazione.

40 Elettroforesi delle proteine in gel di poliacrilammide in SDS (SDS-PAGE) I gel denaturanti contengono SDS, un detergente anionico che denatura le proteine e determina la formazione di un peptide lineare con una netta carica negativa

41 La velocità di migrazione diminuisce all aumentare della massa v = Eq/f

42

43

44 Rilevamento delle Proteine dopo Elettroforesi Coomassie blue stain Coomassie brilliant blue R- 250: metanolo: acqua Rivela 0,1 mg di proteina

45 Rilevamento delle Proteine dopo Elettroforesi Silver stain: Riduzione sulla proteina degli ioni Ag+ ad argento metallico. Colorazione più sensibile del CB, rivela 0.3 ng di proteina.

46 Vantaggi dei gel di poliacrilamide Buona risoluzione di proteine di piccola e media grandezza (30,000 a 300,000 Da) Scarsa interazione delle proteine con la matrice Buona stabiltà della matrice La dimensione dei pori dipende dalla percentuale di bis crilamide presente

47 PROSSIMA LEZIONE???