APO-1/FAS ELISA. Dosaggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa di sapo-1/fas umano nei supernatanti di colture cellulari e nel siero.

Istruzioni per l Uso APO-1/FAS ELISA Dosaggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa di sapo-1/fas umano nei supernatanti di colture cellulari e nel siero. BE51901 96 2-8 C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0)40-53 28 91-0 IBL@IBL-International.com D-22335 Hamburg, Germany Fax: +49 (0)40-53 28 91-11 www.ibl-international.com

INFORMAZIONI SUL PRODOTTO E MANUALE 1. USO PREVISTO 2 2. SOMMARIO 2 3. PRINCIPIO DEL TEST 3 4. REAGENTI FORNITI 4 5. ISTRUZIONI DI CONSERVAZIONE 5 6. PRELIEVO E CONSERVAZIONE DEI CAMPIONI 5 7. MATERIALI NECESSARI MA NO FORNITI 5 8. PRECAUZIONI PER L USO 6 9. PREPARAZIONE DEI REAGENTI 7 10. PROCEDURA DEL TEST 10 11. CALCOLO DEI RISULTATI 13 12. LIMITI DELLA PROCEDURA 14 13. CARATTERISTICHE DI PRESTAZIONE 15 14. INFORMAZIONI PER GLI ORDINI 17 15. SOMMARIO DI PREPARAZIONE DEI REAGENTI 18 16. SOMMARIO DI PROCEDURA DEL TEST 19 17. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI SUL PRODOTTO 20 V1 06.10.09 (21) 1/20

1. Uso Previsto IL sapo-1/fas umano ELISA è un dosaggio immunoassorbente legato agli enzimi per il rilevamento quantitativo del sapo-1/fas umano. IL sapo-1/fas umano ELISA è per uso diagnostico in vitro. Non si usa per procedure terapeutiche. 2. Sommario La morte cellulare programmata o apoptosi è la forma più comune di morte delle cellule eucariote e si riscontra durante la regressione tumorale e lo sviluppo embrionale. Nel processo di selezione ed eliminazione dei linfociti B e T autoreattivi, l apoptosi è un processo importante e quindi rappresenta un prerequisito per l omeostasi del sistema immunitario. L apoptosi è caratterizzata da modificazioni della morfologia cellulare (ad es. condensazione nucleare, vescicolazione della membrana) e, dal punto di vista biochimico, da una rapida induzione della frammentazione del DNA. APO-1/Fas (CD95), un membro della superfamiglia dei recettori TNF/NGF, è una proteina di superficie glicosilata da 48 kda contenente una singola regione transmembrana. APO-1 è espressa in svariate linee di linfociti B e T umani, in molte diverse cellule tumorali e in vari tessuti umani normali. La stimolazione di APO-1 da parte del suo ligando o di alcuni anticorpi monoclonali anti-apo-1 determina una rapida induzione della morte cellulare programmata, o apoptosi, nelle cellule suscettibili. La distribuzione tissutale di APO-1 e del ligando di APO-1 suggerisce che il sistema recettore/ligando di APO-1 svolga un ruolo importante in vari aspetti dello sviluppo dei mammiferi e specialmente nell omeostasi del sistema immunitario. L espressione della proteina di superficie APO-1 è aumentata da IFN-γ e TNF e dall attivazione nei linfociti. APO-1 è presente anche in una forma solubile (sapo-1) priva di regione transmembrana. Livelli elevati di sapo-1 sono stati riscontrati nei sieri di pazienti affetti da leucemie maligne a cellule B e T di grado elevato e basso e da lupus eritematoso sistemico. sapo-1 può impedire alle cellule di subire l apoptosi indotta dal ligando di APO-1. La secrezione di sapo-1 può quindi fornire un meccanismo che permette alle cellule tumorali di sfuggire all immunosorveglianza e potrebbe essere coinvolta nella leucemogenesi. V1 06.10.09 (21) 2/20

3. Principio del Test I micropozzetti vengono rivestiti con un anticorpo di rivestimento anti-sapo-1/fas umano. Figura 1 Micropozzetto Rivestito Il sapo-1/fas umano presente nel campione o nello standard si lega agli anticorpi assorbiti dai micropozzetti. Vi si aggiunge un anticorpo anti-sapo-1/fas umano coniugato di biotina, che si lega con il sapo-1/fas umano catturata dal primo anticorpo. Figura 2 Anticorpo di Rivestimento Prima Incubazione Standard o Campione Coniugato di Biotina Dopo l incubazione degli anticorpi di anti-sapo-1/fas umano coniugati alla biotina non legati vengono rimossi durante una fase di lavaggio. Si aggiunge la streptavidina-hrp che si lega all anticorpo anti-sapo-1/fas umano coniugato alla biotina. Figura 3 Seconda Incubazione Streptavidina-HRP - Dopo l incubazione la Streptavidina-HRP non legata viene rimossa con una fase di lavaggio e ai pozzetti viene aggiunta una soluzione di substrato reattiva all HRP. Figura 4 Terza Incubazione Substrato In proporzione alla quantità di sapo-1/fas umano presente nel campione o nello standard si forma un prodotto colorato. La reazione viene terminata aggiungendo l acido e l assorbanza si misura a 450 nm. Si prepara una curva standard sulla base di 7 diluizioni standard di sapo-1/fas umano e si determina la concentrazione del campione di sapo-1/fas umano. Figura 5 Substrato post-reazione V1 06.10.09 (21) 3/20

4. Reagenti Forniti 1 busta d alluminio con Piastra Micropozzetti rivestita con anticorpi monoclonali anti-sapo-1/fas umano 1 flaconcino (100 µl) con Coniugato di Biotina (anticorpi monoclonali anti-sapo-1/fas umano) 1 flaconcino (150 µl) con Streptavidina-HRP 2 flaconcini con Standard sapo-1/fas umano liofilizzato, 2 ng/ml dopo ricostituzione 1 flaconcino (12 ml) Diluente dei Campioni 1 flaconcino (5 ml) di Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrata 20x (PBS con 1 % Tween 20 e 10 % BSA) 1 flaconcino (50 ml) di Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata 20x (PBS con 1 %Tween 20) 1 flaconcino (15 ml) di Soluzione di Substrato (tetrametil-benzidina) 1 flaconcino (15 ml) di Soluzione Bloccante (Acido fosforico 1 M) 1 flaconcino (0.4 ml) Colorante Verde 1 flaconcino (0.4 ml) Colorante Rosso 4 Copripiastra adesivi V1 06.10.09 (21) 4/20

5. Istruzioni di Conservazione Conservare i reagenti del kit a 2-8 C. Subito dopo l'uso riporre i reagenti nel luogo di conservazione a 2-8 C. La scadenza del kit e dei reagenti è indicata sulle etichette. La data di scadenza dei componenti del kit può essere garantita solo se questi sono conservati correttamente e, in caso di uso ripetuto di un componente, il reagente non è stato contaminato durante la prima manipolazione. 6. Prelievo e conservazione dei Campioni Con questo dosaggio sono stati testati i supernatanti delle colture cellulari ed il siero. Altri campioni biologici potrebbero essere idonei all uso per questo dosaggio. Dopo la coagulazione e la separazione, rimuovere il siero o plasma dal coagulo o gli cellulas il più presto possibile. Fare attenzione ad un possibile Effetto Gancio dovuto ad alte concentrazioni nei campioni (vedi capitolo 11). I campioni contenenti un precipitato visibile devono essere chiarificati prima di essere usati nel dosaggio. Non usare campioni emolizzati in maniera grossolana, o lipemici. I campioni devono essere aliquotati e conservati sotto zero a -20 C, per evitare la perdita di sapo-1/fas umano bioattivo. Se i campioni devono essere usati entro 24 ore, possono essere conservati a una temperatura tra 2 C ed 8 C (per la stabilità del campione fare riferimento al punto 13.5). Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento. Prima del dosaggio, il campione congelato dev essere portato a temperatura ambiente in modo graduale e mescolato con cautela. 7. Materiali necessari ma no forniti Pipette graduate da 5 ml e 10 ml Micropipette adattabili da 5 µl a 1000 µl a canale singolo, con punte usa e getta Micropipette adattabili da 50 µl to 300 µl multicanale con punte usa e getta Micropipetta 8-Canali con contenitori per reagenti Becher, beute, cilindri necessari alla preparazione dei reagenti Spruzzetta per lavaggi, lavatore per micropiastre automatico o semi automatico. Lettore per micropiastre in grado di leggere ad assorbanza di 450 nm (lunghezza d onda di riferimento 620 nm) Acqua bidistillata o deionizzata Calcolatore statistico con programma che esegua l analisi di regressione V1 06.10.09 (21) 5/20

8. Precauzioni per l Uso - Tutti i prodotti chimici vanno considerati come potenzialmente pericolosi. Raccomandiamo, perciò, l'utilizzo di questo prodotto solo da personale addestrato alle tecniche di laboratorio e che siano avvezze alle comuni pratiche di laboratorio. Indossare abbigliamento idoneo come camici, guanti ed occhiali. Attenzione ad evitare contatto con la pelle e gli occhi. Nel caso di contatto con pelle o occhi, immediatamente lavare con acqua. Consultare la scheda di sicurezza del prodotto per specifici consigli. - I reagenti sono per uso in vitro diagnostico e non sono per uso terapeutico. - Non mischiare tra loro reagenti di diversi lotti o provenienza. - Non usare i kit dopo la data di scadenza. - Non esporre i reagenti del kit, durante la conservazione e incubazione a forti fonti di luce. - Non pipettare utilizzando la bocca. - Non mangiare o fumare nell'area dove sono utilizzati i reagenti dei kit o i campioni. - Evitare il contatto dei reagenti o campioni con la pelle o le mucose. - Guanti di gomma o lattice dovrebbero essere sempre indossati quando si usano reagenti e campioni. - Evitare il contatto tra il substrato del kit e agenti ossidanti e metallo. - Evitare schizzi o produzione di aereosol. - Per evitare contaminazione microbica o cross-contaminazione dei reagenti o dei campioni che invaliderebbero il test, usare sempre pipette e puntali mono-uso. - Usare vaschette pulite e dedicate per la dispensare il reagente substrato. - L'esposizione agli acidi inattiva il coniugato. - Acqua distillata o de-ionizzata deve essere utilizzata per la preparazione dei reagenti. - La soluzione di substrato deve essere portata a temperatura ambiente prima dell'utilizzo. - Decontaminare ed eliminare i campioni e tutto il materiale potenzialmente contaminante perchè potrebbero contenere agenti infettanti. Il metodo preferito per la decontaminazione è l'autoclavaggio per minimo 1 ora a 121.5 C. - Gli scarti liquidi, non contenenti acido e gli scarti neutralizzati possono essere mischiati con sodio ipoclorido in un volume finale di 1.0 %. Lasciare minimo 30 minuti per l'effettiva decontaminazione. Scarti liquidi contenenti acido devono essere neutralizzati prima dell'aggiunta di sodio ipoclorido. V1 06.10.09 (21) 6/20

9. Preparazione dei Reagenti Prima di cominciare con le procedure del test i Concentrati dei Tamponi devono essere portati a temperatura ambientale e diluiti alle concentrazioni adeguate. Se i Concentrati dei Tamponi presenta cristalli in sospensione, riscaldare lievemente i tamponi fino a ottenere la completa dissoluzione dei cristalli. 9.1. Soluzione Tampone di Lavaggio (1x) Versare l'intero contenuto (50 ml) del Tampone di Lavaggio concentrato (20x) in un cilindro graduato pulito da 1000 ml. Portare il volume finale a 1000 ml utilizzando acqua distillata o acqua deionizzata. Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma. Trasferire il prodotto in una bottiglia pulita e conservare a temperature comprese fra 2 C e 25 C. Il Tampone di Lavaggio (1x) è stabile per 30 giorni. Se necessario, è possibile preparare il Tampone di Lavaggio (1x) secondo la tabella seguente: Numero di Strisce Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrato (20x) (ml) Acqua Distillata (ml) 1-6 25 475 1-12 50 950 9.2. Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) Versare l'intero contenuto (5 ml) del Tampone di Dosaggio Concentrato (20x) in un cilindro graduato pulito da 100 ml. Portare il volume finale a 100 ml utilizzando acqua distillata o acqua deionizzata. Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma. Conservare a temperature comprese fra 2 C e 8 C. Il Tampone di Dosaggio (1x) è stabile per 30 giorni. Se necessario, è possibile preparare il Tampone di Dosaggio (1x) secondo la tabella seguente: Numero di Strisce Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrato (20x) (ml) Acqua Distillata (ml) 1-6 2.5 47.5 1-12 5.0 95.0 9.3. Preparazione di Coniugato di Biotina Il Coniugato di Biotina deve essere utilizzato entro 30 minuti dalla diluizione. La Soluzione Coniugato di Biotina concentrata deve essere diluito 1:100 con Tampone di Dosaggio (1x) in una provetta di plastica pulita secondo la tabella seguente: Numero di Strisce Coniugato di Biotina (ml) Tampone di Dosaggio (1x) (ml) 1-6 0.03 2.97 1-12 0.06 5.94 V1 06.10.09 (21) 7/20

9.4. Streptavidina-HRP La Streptavidina-HRP deve essere utilizzato entro 30 minuti dalla diluizione. La Streptavidina-HRP concentrata deve essere diluita 1:240 con Tampone di Dosaggio (1x) in una provetta di plastica pulita secondo la tabella seguente: Numero di Strisce Streptavidina-HRP (ml) Tampone di Dosaggio (1x) (ml) 1-6 0.025 5.975 1-12 0.050 11.950 9.5. Standard sapo-1/fas umano Ricostituire lo standard sapo-1/fas umano aggiunendo acqua distillata. Il volume di ricostituzione è indicato sull'etichetta della flaconcino dello standard. Girare o mescolare gentilmente per garantire la completa ed omogenea solubilizzazione (concentrazione dello standard ricostituito = 2 ng/ml). Lasciare lo standard a ricostituire per 10-30 minuti. Prima di fare le diluizione mescolare bene. Dopo l uso, lo standard rimanente non può essere conservato e deve essere scartato. La diluizione dello standard può essere fatto direttamente nella piastra (vedi 10.c.) oppure nei tubi (vedi 9.5.1). 9.5.1. Diluizione Standard Esterna Etichettare 7 tubi, uno per ogni punto dello standard. S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7. Preparare diluizioni seriali 1:2 per lo standard nel seguente modo: Pipettare 225 ul di Diluente dei Campioni a tutti tubi. Pipettare 225 µl di standard ricostituito (concentrazione dello standard = 2 ng/ml) nel primo tubo, etichettato S1, e mescolare (concentrazione dello standard 1 = 1 ng/ml). Pipettare 225 µl di questa diluizione nel secondo tubo, etichettato S2 e mischiare accuratamente prima del successivo transferimento. Ripetere le 5 diluizioni seriali in modo da creare i punti della curva di calibrazione (vedere figura 6). Il Diluente dei Campioni serve come bianco. Figura 6 Transferire 225 µl S2 S3 S4 S5 - S7 Standard Ricostituito sapo-1/fas Umano Diluente dei Campioni 225 µl Buttare 225 µl V1 06.10.09 (21) 8/20

9.6. Agguinta di Reagenti Colorantes: Colorante Verde, Colorante Rosso Per aiutare i clienti ad evitare errori di pipettamento con i kit ELISA, IBL International offre ora una nuovo strumento che aiuta a controllare, mediante l aggiunta di soluzione colorata, ciascuna fase della procedura ELISA. Questa procedura è facoltativa, non interferisce in alcun modo con i risultati del test ed ha l'obiettivo di facilitare l'esecuzione del test da parte del cliente, ma può anche essere tralasciata seguendo semplicemente il libretto d istruzioni. In alternativa, è possibile aggiungere ai reagenti le soluzioni coloranti incluse nel kit (Colorante Verde, Colorante Rosso) attenendosi alle linee guida seguenti: 1. Coniugato di Biotina Prima di diluire il standard e il campione aggiungere il Colorante Verde diluito in concentrazione di 1:100 (vedere la tabella seguente) al Tampone di Dosaggio (1x) utilizzato per la diluizione finale del coniugato. secondo il protocollo del test. Procedere dopo l'aggiunta del Colorante Verde secondo il libretto d istruzioni e la preparazione del Coniugato di Biotina. 3 ml Tampone di Dosaggio (1x) 30 µl Colorante Verde 6 ml Tampone di Dosaggio (1x) 60 µl Colorant Verde 12 ml Tampone di Dosaggio (1x) 120 µl Colorant Verde 2. Streptavidina-HRP Prima di diluire la Streptavidina-HRP concentrato, aggiungere il Colorante Rosso alla concentrazione di 1:250 (vedere la tabella seguente) alla soluzione tampone utilizzata per la diluizione finale della Streptavidina-HRP. Procedere dopo l'aggiunta del Colorante Rosso secondo il libretto d istruzioni e la preparazione della Streptavidina- HRP. 6 ml Tampone di Dosaggio (1x) 24 µl Colorante Rosso 12 ml Tampone di Dosaggio (1x) 48 µl Colorante Rosso V1 06.10.09 (21) 9/20

10. Procedura del Test a. Stabilire il numero di strip dei micropozzetti necessarie per analizzare la quantità desiderata di campioni più le strip per i bianchi e gli standard. Tutti i campioni, gli standardi, il bianco e il devono essere processati in duplicato. Rimuovere dal supporto le strip micropozzetti non utilizzate e conservarle nella bustina metallica contenente la polvere essiccante, mantenendole a 2-8 C e perfettamente sigillate. b. Lavare due volte le strip micropozzetti utilizzando circa 400 µl di Tampone di Lavaggio per pozzetto, aspirando accuratamente il contenuto dei micropozzetti tra un lavaggio e l'altro. Permettere al tampone di lavaggio di rimanere, nei pozzetti, circa 10-15 secondi prima dell'aspirazione. Evitare di scalfire la superficie dei micropozzetti. Dopo l'ultimo lavaggio, asciugare le strip micropozzetti con un tampone o carta assorbente per rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso. Utilizzare le strip subito dopo il lavaggio o sistemarle capovolte su carta assorbente umida per non più di 15 min. Non lasciar asciugare i pozzetti. c. Diluizione dello standard in micropozetti (alternativamente la diluizione dello standard può avvenire in tubi vedi 9.5.1) Aggiungere 100 µl di Diluente dei Campioni in duplicato a tutti i pozzetti dello standard. Pipettare 100 µl di standard preparato (vedi 9.5 Preparazione dello Standard, concentrazione = 2000 pg/ml) in duplicato nei pozzetti A1 e A2 (vedi Tavola 1). Transferire 100 µl ai pozzetti B1 e B2. Mescolare il contenuto dei pozzetti A1 e A2 attraverso ripetute aspirazione ed iniezioni (concentrazione dello standard 1, S1 = 1000.0 pg/ml) e trasferire 100 µl, rispettivamente, ai pozzetti B1 e B2 (vedere Figura 7). Fare attenzione a non graffiare la parte interna dei pozzetti. Continuare questa procedura per 5 volte, creando due colonne di standard in diluizione con concentrazione da 1000.0 a 15.6 pg/ml. Buttare 100 µl del contenuto degli ultimi pozzetti (G1 e G2). V1 06.10.09 (21) 10/20

Figura 7 Transferire 100 µl S1 S2 S3 S4 - S7 Standard Ricostituito sapo-1/fas Umana Diluente dei Campioni 100 µl Buttare 100 µl In caso di diluizione esterna dello standard (vedi 9.5.1) pipettare 100 µl di queste diluizioni standard (S1 S7) nei pozzetti degli standard come da Tavola 1. Tavola 1 Tavola rappresenta un esempio dell'organizzazione dei bianchi, standardi e campioni nei pozzetti: A B C D E F G 1 2 3 4 Standard 1 (1000.0 pg/ml) Standard 2 (500.0 pg/ml) Standard 3 (250.0 pg/ml) Standard 4 (125.0 pg/ml) Standard 5 (62.5 pg/ml) Standard 6 (31.3 pg/ml) Standard 7 (15.6 pg/ml) Standard 1 (1000.0 pg/ml) Standard 2 (500.0 pg/ml) Standard 3 (250.0 pg/ml) Standard 4 (125.0 pg/ml) Standard 5 (62.5 pg/ml) Standard 6 (31.3 pg/ml) Standard 7 (15.6 pg/ml) Campione 1 Campione 1 Campione 2 Campione 2 Campione 3 Campione 3 Campione 4 Campione 4 Campione 5 Campione 5 Campione 6 Campione 6 Campione 7 Campione 7 H Bianco Bianco Campione 8 Campione 8 V1 06.10.09 (21) 11/20

d. Dispensare 100 µl di Diluente dei Campioni in duplicato ai pozzetti de bianco. e. Dispensare 90 µl di Diluente dei Campioni in duplicato ai pozzetti dei campioni. f. Dispensare 10 µl di ogni campione in duplicato ai pozzetti dei campioni. g. Preparare il Coniugato di Biotina (vedere la preparazione del Coniugato di Biotina 9.3). h. Dispensare 50 µl di Coniugato di Biotina a ciascun pozzetto. i. Coprire la piastra con un copripiastra e incubare a 37 C utilizzando per 1 ora. j. Rimuovere il copripiastra e svuotare i pozzetti. Lavare le strisce della pozzeti 3 volte come descritto in punto b. del protocollo. Procedere immediatamente al punto successivo. j. Preparare la Streptavidina-HRP (vedere la Preparazione di Streptavidina-HRP 9.4). k. Rimuovere il copripiastra e svuotare i pozzetti. Lavare le strisce della pozzeti 3 volte come descritto in punto b. del protocollo. Procedere immediatamente al punto successivo. l. Dispensare 100 µl di Streptavidina-HRP diluita a tutti i pozzetti, inclusi quelli di bianco. m. Coprire la piastra con un copripiastra e incubare a 37 C per 1 ora. n Rimuovere il copripiastra e svuotare i pozzetti. Lavare le strisce della pozzeti 3 volte come descritto in punto b. del protocollo. Procedere immediatamente al punto successivo. o. Pipettare 100 µl di Soluzione di Substrato TMB in tutti i pozzetti. p. Incubare le strisce a temperatura ambiente (18-25 C) per circa 10 minuti. Evitare l'esposizione diretta a luci intense. È necessario monitorare i valori D.O. a livello della piastra e interrompere la reazione del substrato (vedi il punto prossimo del protocollo) prima che i pozzetti positivi cessino di essere appropriatamente registrabili. La determinazione del tempo necessario per lo sviluppo del colore dev'essere fatto per ogni singolo parametro. Si raccomanda di aggiungere la soluzione di stop quando lo standard più elevato ha sviluppato un colore blu scuro. Alternativamente lo sviluppo del colore può essere monitorato con un lettore ELISA a 620 nm. La reazione del substrato deve essere bloccata non appena viene misurato un valore della DO di 0.9-0.95. q. Interrompere la reazione enzimatica pipettando rapidamente 100 µl di Soluzione Stopp in ciascun pozzetto, inclusi i pozzetti del bianco. È importante che la soluzione bloccante si diffonda rapidamente e uniformemente attraverso i micropozzetti per inattivare completamente l'enzima. I risultati devono essere letti immediatamente dopo l'aggiunta della soluzione bloccante o entro 1 ora se le strip sono conservate in un luogo buio a 2-8 C. r. Leggere l'assorbanza di ciascun micropozzetto su uno spettrofotometro che utilizza 450 nm come lunghezza d'onda primaria (620 nm come lunghezza d'onda di riferimento alternativa; valori da 610 nm a 650 nm sono accettabili). Azzerare il lettore della piastra secondo le istruzioni del produttore e utilizzando i pozzetti del bianco. Determinare l'assorbanza sia dei campioni, sia degli standard. V1 06.10.09 (21) 12/20

11. CALCOLO DEI RISULTATI - Calcolare i valori medi dell assorbanza per ogni set di standard e campioni duplicati. I duplicati devono rientrare nel 20 % del valore medio. - Creare una curva standard segnando l assorbanza media di ogni concentrazione standard sull ordinata contro la concentrazione di sapo-1/fas umano sull ascissa. Disegnare una curva di best-fit congiungendo i punti del grafico (si raccomanda una curva di best-fit basata su 5 parametri). - Per determinare la concentrazione di sapo-1/fas umano circolante per ogni campione, trovare prima il valore medio di assorbanza sull ordinata ed estendere una linea orizzontale sulla curva standard. Nel punto d intersezione estendere una linea verticale fino all ascissa e leggere il valore corrispondente della concentrazione di sapo-1/fas umano. - Se le istruzioni di questo protocollo sono state seguite, i campioni di colture celulari sono stati diluiti 1:10 (10 µl campione + 90 µl Diluente dei Campioni). La concentrazione letta dalla curva standard dev essere moltiplicata per il fattore di diluizione (10x). - Il calcolo dei campioni con una concentrazione superiore allo standard 1 può dare per risultato livelli scorretti e bassi di sapo-1/fas umano. Questi campioni richiedono un ulteriore pre-diluizione esterna secondo i valori stimati del sapo-1/fas umano, con Diluente dei Campioni in modo da quantificare con precisione i livelli reali di sapo-1/fas umano. - Si suggerisce che ogni attrezzatura per test stabilisca un campione di controllo della concentrazione di sapo-1/fas umano conosciuta e che con ogni dosaggio esegua questo controllo aggiuntivo. Se i valori ottenuti non rientrano nel range del controllo stimato, i risultati del dosaggio possono non essere validi. - La Figura 8 mostra una curva standard rappresentativa. Questa curva non può essere usata per dedurne risultati di test. Ogni laboratorio deve preparare una curva standard per ogni gruppo di strisce per micropozzetti su cui si fa il dosaggio. Figura 8 Curva standard rappresentativa per il sapo-1/fas umano ELISA. IL sapo-1/fas umano è stato diluito in 2 fasi seriali nel Diluente dei Campioni. Non usare questa curva per dedurne risultati di test. Una curva standard dev essere eseguita per ogni gruppo di strip per micropozzetti su cui si fa il dosaggio. 10.0 APO-1/FAS ELISA DO (450 nm) 1.0 0.1 0.0 10 1000 (pg/ml) V1 06.10.09 (21) 13/20

Tavola 2 Dati tipici relativi all uso del sapo-1/fas umano ELISA Lunghezza d onda: 450 nm Lunghezza d onda di riferimento: 620 nm Standard Concentrazione D.O. sapo-1/fas Umano (pg/ml) (450 nm) 1 1000.0 1.915 1.958 2 500.0 0.981 1.092 3 250.0 0.564 0.558 4 125.0 0.296 0.297 5 62.5 0.176 0.194 6 31.3 0.103 0.118 7 15.6 0.072 0.077 Bianco 0 0.028 0.027 D.O. Media (450 nm) C.V. (%) 1.937 1.6 1.037 7.6 0.562 0.8 0.297 0.2 0.186 6.9 0.111 9.6 0.075 4.7 0.028 1.8 I valori DO della curva standard possono variare seconda delle condizioni di prestazione del dosaggio (ad es.: operatore, tecnica di pipettaggio o effetti della temperatura). Inoltre, il periodo di validità del kit può influenzare l attività enzimatica e quindi l intensità del colore. I valori misurati sono ancora validi. 12. LIMITI DELLA PROCEDURA - Poichè le condizioni precise possono variare di dosaggio in dosaggio, bisogna stabilire una curva standard per ogni esecuzione del test. - La contaminazione da batteri o funghi dei campioni da testare o dei reagenti o la contaminazione crociata tra reagenti può casusare risultati erronei. - Sono preferibili punte di pipette usa e getta, beute o contenitori in vetro; i contenitori in vetro riutilizzabili devono essere lavati ed accuratamente risciacquati da tutti i detergenti prima dell uso. - Un lavaggio improprio o insufficiente in qualsiasi fase della procedura causerà risultati falsi positivi o falsi negativi. Svuotare completamente i pozzetti prima di versare la Soluzione di Lavaggio fresca, riempire con il Tampone di Lavaggio come indicato per ogni ciclo di lavaggio e non lasciare i pozzetti scoperti, o non permettere che si asciughino per periodi prolungati. - L uso della radioimmunoterapia ha aumentato significativamente il numero di pazienti con anticorpi umani IgG anti-topo (HAMA). HAMA può interferire con dosaggi che utilizzano anticorpi monoclonali murini, portando sia a risultati falsi positivi, sia falsi negativi. I campioni di siero contenenti anticorpi delle immunoglobuline murine possono essere ancora analizzati in questi dosaggi quando le immunoglobuline murine (siero, liquido ascitico o anticorpi monoclonali di specificità irrilevante) vengono aggiunti al campione. V1 06.10.09 (21) 14/20

13. Caratteristiche di Prestazione 13.1. Sensibilità Il limite di rilevamento della sapo-1/fas umano definito come la concentrazione dell analita, risultante in un assorbanza significativamente più alta rispetto a quella del mezzo di diluizione (media più 2 deviazioni standard), è stato determinato di 13.2 pg/ml (media di 6 dosaggi indipendenti). 13.2. Riproducibilità 13.2.1. Intra-Dosaggio La riproducibilità nell ambito del dosaggio è stata valutata in 3 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è stato eseguito con 6 replicati di 8 campioni di siero contenenti diverse concentrazioni di sapo-1/fas umano. Per ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. I dati qui di seguito illustrano la concentrazione media di sapo-1/fas umano ed il coefficiente di variazione per ogni campione (vedi Tavola 3). Il coefficiente complessivo di variazione intra-dosaggio calcolato è 4.5 %. Tavola 3 La concentrazione media di sapo-1/fas umano ed il coefficiente di variazione per ogni campione Campione 1 2 3 4 5 6 7 8 Esperimento 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Concentrazione media di sapo-1/fas umano (pg/ml) 2336 2210 2256 2109 2207 2135 1727 1841 1682 1703 1855 1767 3442 3653 3570 1422 1430 1357 2066 2248 2095 1366 1353 1351 Coefficiente di Variazione (%) 1.0 9.7 14.6 5.5 8.7 3.3 1.7 7.1 3.3 6.0 3.6 5.1 3.0 0.5 4.5 2.1 4.1 1.3 4.3 1.7 1.7 4.2 7.7 4.6 V1 06.10.09 (21) 15/20

13.2.2. Inter-Dosaggio La riproducibilità nell ambito del dosaggio è stata valutata in 3 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è stato eseguito con 6 replicati di 8 campioni di siero contenenti diverse concentrazioni di sapo-1/fas umano. Per ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. I dati qui di seguito illustrano la concentrazione media di sapo-1/fas umano ed il coefficiente di variazione calcolati in 18 determinazioni per ogni campione (vedi Tavola 4). Il coefficiente complessivo di variazione intra-dosaggio calcolato è 3.1 %. Tavola 4 La concentrazione media di sapo-1/fas umano ed il coefficiente di variazione per ogni campione: Campione Concentrazione media di Coefficiente di sapo-1/fas umano (ng/ml) Variazione (%) 1 2267 2.8 2 2150 2.4 3 1750 4.7 4 1775 4.3 5 3555 3.0 6 1403 2.8 7 2136 4.6 8 1357 0.6 13.3. Test di Recupero Il test di recupero è stato valutato aggiungendo 4 livelli di sapo-1/fas umano in un pool di siero umano normale e campioni di plasma citrato. I recuperi sono stati determinati nel corso di 3 esperimenti indipendenti, ognuno con 6 replicati. La quantità di sapo-1/fas endogena umana in campioni non addizionati è stata sottratta dai valori addizionati. Il recupero aveva un range dal 86 % al 118 % nei campioni di siero con un recupero medio complessivo del 100 %. 13.4. Parallelismo della Diluizione 4 campioni di siero con diversi livelli di sapo-1/fas umano sono stati analizzati in diluizioni seriali multiple di 2 e con 4 replicati l uno. Il recupero rientrava in un range dal 87 % al 115 % con un recupero medio complessivo del 102 % (vedere Tavola 5) Tavola 5 Campione Diluizione 1 2 3 4 1:10 1:20 1:40 1:80 1:10 1:20 1:40 1:80 1:10 1:20 1:40 1:80 1:10 1:20 1:40 1:80 Concentrazione Attesa di sapo-1/fas umano (pg/ml) -- 1067 533 267 -- 947 473 237 -- 826 413 207 -- 853 426 213 Concentrazione Misurata di sapo-1/fas umano (pg/ml) 2134 1158 579 306 1894 847 428 258 1653 887 441 216 1706 738 399 212 Recupero di Concentrazione Attesa di sapo-1/fas umano (%) -- 109 109 115 -- 90 90 109 -- 107 107 105 -- 87 94 100 V1 06.10.09 (21) 16/20

13.5. Stabilità dei Campioni 13.5.1. Stabilità a Congelamento - Scongelamento Aliquote di campioni di siero (non addizionati o addizionati) sono stati conservati a -20 C e scongelati 5 volte e sono stati determinati i livelli di sapo-1/fas umano. Con il congelamento e lo scongelamento non si è rilevata una perdita significativa di immunoreattività della sapo-1/fas umano. 13.5.2. Stabilità della Conservazione Aliquote di campioni di siero (addizionati o non addizionati) sono state conservate a -20 C, 2-8 C, a temperatura ambiente (TA) ed a 37 C e il livello di sapo-1/fas umano ne è stato determinato dopo 24 ore. Durante la conservazione alle condizioni sopraindicate non si è rilevata una perdita significativa di immunoreattività del sapo-1/fas umano. 13.6. Specificità L interferenza dei fattori circolanti del sistema immune è stata valutata aggiungendo queste proteine in concentrazioni fisiologicamentre rilevanti ad un siero sapo-1/fas umano positivo. Non si è constatata alcuna reattività crociata. 13.7. Valori Attesi Per il sapo-1/fas umano è stato testato un pannello di campioni di siero di donatori apparentemente sani (maschi e femmine) selezionati casualmente (random). I livelli rilevati di sapo-1/fas umana erano compresi tra 1334 e 2411 pg/ml, con un valore medio di 1609 pg/ml. 14. INFORMAZIONI PER GLI ORDINI Per gli ordini contattare: Vedi ultima pagina. Per informazioni tecniche contattare: e-mail: IBL@IBL-International.com www.ibl-international.com V1 06.10.09 (21) 17/20

15. Sommario: Preparazione dei Reagenti 15.1. Soluzione Tampone di Lavaggio (1x) Aggiungere Concentrato di Tampone di Lavaggio 20x (50 ml) a 950 ml di acqua distillata. Numero di strisce Soluzione Tampone di Lavaggio Concentrata (ml) 1-6 25 475 1-12 50 950 15.2. Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) Acqua Distillata (ml) Aggiungere Concentrato di Tampone di Dosaggio 20x (5 ml) a 95 ml di acqua distillata. Numero di strisce Soluzione Tampone di Dosaggio Concentrata (ml) 1-6 2.5 47.5 1-12 5.0 95.0 Acqua Distillata (ml) 15.3. Coniugato di Biotina Fare una prediluizione 1:100 di Coniugato di Biotina in Tampone di Dosaggio (1x): Numero di strisce Coniugato di Biotina (ml) Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) (ml) 1-6 0.03 2.97 1-12 0.06 5.94 15.4. Estreptavidina-HRP Fare una diluizione 1:240 di Streptavidina-HRP in Tampone di Dosaggio (1x): Numero di strisce Streptavidina-HRP (ml) Soluzione Tampone di Dosaggio (1x) (ml) 1-6 0.025 5.975 1-12 0.050 11.950 15.5. Standard sapo-1/fas Umano Reconstituire il standard liofilizzato di sapo-1/fas umano con acqua distillata. (Il volume di ricostituzione è dichiarato sull etichetta del flaconcino dello standard.) V1 06.10.09 (21) 18/20

16. Sommario di Procedura del Test 1. Determinare il numero di strisce di micropozzetti richiesto. 2. Lavare le strisce di micropozzetti due volte con il Tampone di Lavaggio. 3. Diluizione standard sulla piastra di micropozzetti: Aggiungere 100 µl di Diluente dei Campioni, in duplicato, a tutti i pozzetti standard. Pipettare 100 µl di standard preparato nei primi pozzetti e creare diluizioni di standard trasferendo 100 µl da pozzetto a pozzetto. Scartare 100 µl dagli ultimi pozzetti. Alternativamente diluizione esterna dello standard in tubi (vedi 9.5.1.): Pipettare 100 µl di queste diluizioni dello standard nei micropozzetti. 4. Aggiungere 100 µl di Diluente dei Campioni, in duplicati, ai pozzetti del bianco. 5. Aggiungere 90 µl di Diluente dei Campioni, ai pozzetti di campioni. 6. Aggiungere 10 µl di campione in duplicato ai pozzetti di campioni. 7. Preparare il Coniugato di Biotina. 8. Aggiungere 50 µl di Coniugato di Biotina a tutti i pozzetti. 9. Coprire le strisce e incubare 1 ora a 37 C. 10. Preparare la Streptavidina-HRP. 11. Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 3 volte con Soluzione Tampone di Lavaggio. 12. Aggiungere 100 µl di Streptavidina-HRP diluita a tutti i pozzetti. 13. Coprire le strisce e incubare 1 ore a 37 C. 14. Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 3 volte con Soluzione Tampone di Lavaggio. 15. Aggiungere 100 µl di Soluzione di Substrato TMB a tutti i pozzetti. 16. Incubare le strisce di micropozzetti per circa 10 minuti a temperatura ambiente (18-25 C). 17. Aggiungere 100 µl di Soluzione Bloccante a tutti i pozzetti. 18. Azzerare il lettore di micropozzetti e misurare l intensità del colore a 450 nm. Nota bene: Se le istruzioni di questo protocollo sono state seguite, i campioni di supernatanti di colture cellulari sono stati diluiti 1:10 (10 µl campione + 90 µl di Diluente dei Campioni). La concentrazione letta dalla curva standard dev essere moltiplicata per il fattore di diluizione (x10). V1 06.10.09 (21) 19/20

17. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI SUL PRODOTTO 1. Debatin, K. M.; Goldmann, C. K.; Bamford, R.; Waldmann, T. A.; Krammer, P. H.. Monoclonalantibodymediated apoptosis in adult T-cell leukaemia. Lancet 1990; 335:497-500. 2. Knipping, E.; Debatin, K. M.; Stricker, K.; Heilig, B.; Eder, A.; Krammer, P. H.. Identification of soluble APO-1 in supernatants of human B- and T-cell lines and increased serum levels in Band T-cell leukemias. Blood 1995; 85:1562-1569. 3. Itoh, N.; Yonehara, S.; Ishii, A.; Yonehara, M.; Mizushima, S.; Sameshima, M.; Hase, A.; Seto, Y.; Nagata, S.. The polypeptide encoded by the cdna for human cell surface antigen Fas can mediate apoptosis. Cell 1991; 66:233-243. 4. Munker, R.; Lubbert, M.; Yonehara, S.; Tuchnitz, A.; Mertelsmann, R.; Wilmanns, W.. Expression of the Fas antigen on primary human leukemia cells. Ann.Hematol. 1995; 70:15-17. 5. Suda, T.; Takahashi, T.; Golstein, P.; Nagata, S.. Molecular cloning and expression of the Fas ligand, a novel member of the tumor necrosis factor family. Cell 1993; 75:1169-1178. 6. Cheng, J.; Zhou, T.; Liu, C.; Shapiro, J. P.; Brauer, M. J.; Kiefer, M. C.; Barr, P. J.; Mountz, J. D.. Protection from Fas-mediated apoptosis by a soluble form of the Fas molecule. Science 1994; 263:1759-1762. 7. Daniel, P. T.; Krammer, P. H.. Activation induces sensitivity toward APO-1 (CD95)-mediated apoptosis in human B cells. J.Immunol. 1994; 152:5624-5632. 8. Leithauser, F.; Dhein, J.; Mechtersheimer, G.; Koretz, K.; Bruderlein, S.; Henne, C.; Schmidt, A.; Debatin, K. M.; Krammer, P. H.; Moller, P.. Constitutive and induced expression of APO-1, a new member of the nerve growth factor/tumor necrosis factor receptor superfamily, in normal and neoplastic cells. Lab Invest 1993; 69:415-429. 9. Trauth, B. C.; Klas, C.; Peters, A. M.; Matzku, S.; Moller, P.; Falk, W.; Debatin, K. M.; Krammer, P. H.. Monoclonal antibody-mediated tumor regression by induction of apoptosis. Science 1989; 245:301-305. 10. Oehm, A.; Behrmann, I.; Falk, W.; Pawlita, M.; Maier, G.; Klas, C.; Li-Weber, M.; Richards, S.; Dhein, J.; Trauth, B. C.;.. Purification and molecular cloning of the APO-1 cell surface antigen, a member of the tumor necrosis factor/nerve growth factor receptor superfamily. Sequence identity with the Fas antigen. J.Biol.Chem. 1992; 267:10709-10715. 11. Klas, C.; Debatin, K. M.; Jonker, R. R.; Krammer, P. H.. Activation interferes with the APO-1 pathway in mature human T cells. Int.Immunol. 1993; 5:625-630. 12. Yonehara, S.; Ishii, A.; Yonehara, M.. A cell-killing monoclonal antibody (anti-fas) to a cell surface antigen co-downregulated with the receptor of tumor necrosis factor. J.Exp.Med. 1989; 169:1747-1756. 13. Watanabe-Fukunaga, R.; Brannan, C. I.; Copeland, N. G.; Jenkins, N. A.; Nagata, S.. Lymphoproliferation disorder in mice explained by defects in Fas antigen that mediates apoptosis. Nature 1992; 356:314-317. 14. Moller, P.; Henne, C.; Leithauser, F.; Eichelmann, A.; Schmidt, A.; Bruderlein, S.; Dhein, J.; Krammer, P. H.. Coregulation of the APO-1 antigen with intercellular adhesion molecule-1 (CD54) in tonsillar B cells and coordinate expression in follicular center B cells and in follicle center and mediastinal B-cell lymphomas. Blood 1993; 81:2067-2075. V1 06.10.09 (21) 20/20

Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, 22335 Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) 40 532891-0 Fax: -11 E-MAIL: IBL@IBL-International.com WEB: http://www.ibl-international.com Tel.: +1 (416) 645-1703 Fax: -1704 E-MAIL: Sales@IBL-International.com WEB: http://www.ibl-international.com LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 / 2012-01-20