12 Meeting responsabili e tecnici laboratorio settore lattiero caseario Determinazione dei batteri lattici nei prodotti lattiero caseari: metodi, terreni, tecniche Angiolella Lombardi Veneto Agricoltura Istituto per la Qualità e le Tecnologie Agroalimentari MontegrottoTerme, 6-7 dicembre 2012 Il ruolo positivo dei batteri lattici nella produzione di latti fermentati Acidificazione (fermentazione lattica) Produzione di acetaldeide Produzione di polisaccaridi - Batteri lattici con caratteristiche probiotiche A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari 2 1
Il ruolo positivo dei batteri lattici nella produzione di formaggi Acidificazione (fermentazione lattica) Produzione di enzimi che agiscono su: Proteine-peptidi-aminoacidi (lipidi) Altre componenti (es. citrato) Maturazione prodotto, caratteristiche organolettiche - nutrizionali Batteri lattici starter Batteri lattici non starter A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari 3 Aspetti negativi legati allo sviluppo di batteri lattici nei formaggi Produzione di gas (batteri lattici eterofermentanti, occhiatura eccessiva, gonfiori) Produzione di amine biogene (tiramina, istamina) Produzione di sapori anomali (peptidi amari) Acidificazione eccessiva-gessatura A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari 4 2
BATTERI LATTICI Caratteristiche generali Batteri Gram positivi Ubiquitari Morfologia differente: bacilli/cocchi Non sporigeni Acido tolleranti e talvolta acidofili Temperatura ottimale di crescita: ampio range (termofili/ mesofili) Catalasi negativi (eccetto alcune specie genere Pediococcus ) Molto esigenti nutrizionalmente Non patogeni (gruppo 1, tranne L. rhamnosus ed enterococchi che rientrano in gruppo 2) Anaerobi (aerotolleranti) Metabolismo fermentativo (omofermentanti, eterofermentanti) A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari 5 Principali generi/specie di batteri lattici settore lattiero-caseario Microrganismo Morfologia Fermentazione Temperatura Applicazioni Streptococcus thermophilus Lactococcus lactis Cocchi Omolattica Termofili Formaggi, latti fermentati Cocchi Omolattica Mesofili Formaggi, burro Enterococchi Cocchi Omolattica Mesofili, termodurici Formaggi* (no QPS) Pediococchi Cocchi a tetradi Omolattica Termofili Vegetali fermentati, insaccati, maturazione formaggi Leuconostoc Cocchi Eterolattica Mesofili Burro, vegetali fermentati, paste acide Lactobacilli Bastoncini Omolattica Eterolattica Mesofili. termofili Formaggi, latti ferm., insaccati, paste acide, vegetali A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari 6 3
Perchè cercare i batteri lattici nei prodotti lattiero caseari? Requisiti di prodotto (es S. thermophilus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus yogurt) Requisiti certificazioni ( es. Mozzarella STG) Controllo qualità colture starter (inclusi sieroinnesti/lattoinnesti) Monitoraggio probiotici (L. acidophilus, L. rhamnosus, L casei/paracasei, Bifidobacterium*) Conteggio LAB responsabili difetti (es eterofermentanti obbligati, enterococchi) A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari 7 Conteggio batteri lattici Metodi normati Microrganismo Metodo Campo applicazione S. thermophilus ISO 7889-IDF117: 2003 Yogurt Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Lactobacillus acidophilus Batteri lattici mesofili e termofili (diverse specie e generi) ISO 7889-IDF117: 2003 ISO 20128-IDF292: 2006 ISO 27205-IDF149: 2010 Yogurt Latti fermentati e non fermentati, latte in polvere Colture starter per prodotti fermentati a base di latte (no probiotici) A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari 8 4
Conteggio batteri lattici Metodi normati Microrganismo Metodo Campo applicazione Enterococchi Bifidobatteri (NB non LAB) CCFRA Met. 2.2.1:2007 ISO 29981- IDF220: 2010 Alimenti, inclusi prodotti lattiero caseari, mangimi Latti fermentati e non fermentati, latte in polvere, formulazioni per l infanzia,colture starter Leuconostoc (FIL149A:1997) Colture starter Batteri lattici citrato fermentanti (Leuconostoc, Lc.lactis cit+) ISO17792-IDF 180 : 2006 Colture starter e prodotti lattiero caseari in cui sono presenti lattici citrato ferm. A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari 9 Streptococcus thermophilus Norma cod. ISO 7889 - IDF 117:2003 Norma titolo Conteggio di Mezzo di coltura Inoculo Atmosfera incubazione Incubazione Lettura colonie Conferma Yogurt - Enumeration of characteristic microorganisms Colony count technique at 37 C Streptococcus thermophilus M 17, ph 6.8 dopo sterilizzazione (consigliabile aggiungere il lattosio dopo sterilizzazione) inclusione aerobiosi 37+/-1 C x 48 h colonie lenticolari del diametro di 1-2 mm. colorazione gram (+, forma coccica del diametro di 0.7-0.9 micron in coppia o a catena) e catalasi (neg.) (vedi FIL 146/ISO 9232) A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari 10 5
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Norma cod. ISO 7889 - IDF 117:2003 Norma titolo Conteggio di Mezzo di coltura Inoculo Atmosfera incubazione Incubazione Lettura colonie Conferma Yogurt- Enumeration of characteristic microorganisms Colony count technique at 37 C Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus MRS acid. ph 5.4 con acido acetico inclusione anaerobiosi 37+/-1 C x 72 h colonie lenticolari, spesso a forma laminare del diametro di 1-3 mm colorazione gram (+, bastoncini, generalmente corti) e catalasi (neg.) (vedi FIL 146/ISO 9232) A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari 11 ISO 20128-IDF192:2006 Milk Products Enumeration of presumptive Lactobacillus acidophilus on a selective medium-colony count technique at 37 C Conteggio di Mezzo di coltura Lactobacillus acidophilus MRS + Clindamycin + Ciprofloxacin Inoculo Atmosfera incubazione Incubazione Lettura colonie spatolamento anaerobiosi 37 C x 72 +/-3 h colonie piatte opache grigio biancastre bordi irregolari A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari 12 6
ISO 27205-IDF149:2010-Fermented milk Products Bacterial starter cultures standard of identity Specifica caratteristiche delle colture starter del settore lattiero caseario (batteri lattici, ma anche bifidobatteri e propionibatteri) Microrganismo L.delbrueckii subsp. bulgaricus Metodo MRS acidificato come ISO 7889-IDF117:2003 L. acidophilus MRS+ Cli e Cipro come ISO 20128-IDF 292: 2006 S. thermophilus M17 ph6,8 come ISO 7889-IDF117: 2003 Lattococchi Colture miste S. thermophilus - lattococchi M17 ph7,2, come da ISO 7889 incubato in aerobiosi a 30 C per 72 ore S.thermophilus : M17 ph6,8 45 C aerobiosi 48 h Lattococchi M17 ph7,2 20 C aerobiosi 5 g A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari 13 CCFRA Method 2.7.1:2007 Enumeration of presumptive Enterococcus species:colony count technique Il metodo propone diversi mezzi per il conteggio degli enterococchi negli alimenti e nei mangimi: KF streptococcus agar, Kanamicina,- esculina-azide agar (KAA), Slanetz e Bartley agar (SB) KAA inoculo per spreading, 37 C per 24 h ± 4 h Necessaria conferma Sodio azide e kanamicina agenti selettivi Esculina agente differenziale Colonie bianche o grigie circondate da un alone nero da confermare A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari 14 7
ISO 29981-IDF220:2010 Milk Products-Enumeration of presumptive bifidobacteria-colony count technique at 37 C TOS-MUP propionato agar + agenti selettivi (litio-mupirocina) e galatto-oligosaccaridi (TOS) Inoculo per inclusione, incubazione 37 C per 72 h in anerobiosi Litio e mupirocina inibiscono crescita S. thermophilus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. acidophilus, L. casei, L. rhamnosus, Lactococcus lactis, Galatto-oligosaccaridi (TOS) favoriscono sviluppo dei bifidobatteri Colonie bianche piccole da confermare A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari 15 FIL-IDF 149A. 1997. Levains lactiques de cultures de bactéries lactiques. Norme de composition Leuconostoc MSE Agar (Mayeux, Sandine, Elliker), Inoculo per spreading, incubazione a 22 C per 4-5 g in aerobiosi. Sodio azide del terreno inibisce batteri Gram - e lattococchi Saccarosio favorisce formazione destrani. L. mesenteroides dextranicum forma colonie mucose, gelatinose, altri Leuconostoc formano colonie piccole incolori A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari 16 8
ISO17792-IDF180:2006 Milk, milk products and mesophilic starter cultures Enumeration of citrate fermenting bacteria.colony count technique at 25 C Microrganismi interessati: Lactococcus lactis subsp. lactis cit + Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides, cremoris, dextranicum Leuconostoc lactis Terreno di Nickels e Leesment, contenente citrato e calcio lattato, incubato a 25 C in aerobiosi per 72 h. Dopo incubazione viene aggiunto X- gal, ulteriore incubazione per 24 ore Citrato fermentanti presentano alone attorno alla colonia Lactococcus colonie bianche Leuconostoc colonie blu A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari 17 Altri batteri lattici L. casei/paracasei, L. rhamnosus, L.plantarum NSLAB formaggi Latti fermentati, probiotici MRS agar + vancomicina ( 10 µg/ml) Incubazione 30 C, anaerobiosi, 72 h. In questo terreno possono sviluppare anche pediococchi e Leuconostoc A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari 18 9
Batteri lattici eterofermentanti Terreno HHD consente differenziare batteri lattici omo ed eterofermentanti in base alla differente acidificazione del fruttosio presente in bassa concentrazione in questo mezzo. Dopo incubazione 30 C per 72 h i batteri omofermentanti crescono con colonie blu-verdi, mentre quelli eterofermentanti con colonie incolori (non acidificano e quindi non determinano il viraggio del verde bromocresolo) In alternativa per il conteggio degli eterofermentanti: MRS; verifica produzione gas in un numero rappresentativo di colonie Leuconostoc: MSE 22 C per 4-5 g A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari 19 Metodi di controllo sieroinnesti-criticità -2-8 x 10 8 ufc/ml -dominanza L. helveticus (80-85%), presenza di diversi biotipi -L. delbrueckii subsp. bulgaricus e subsp. lactis -L. fermentum (eterofermentante) -Talora presenza di S. thermophilus Caratteristiche sieroinnesti MRS acidificato? MRS + casaminoacids? Agar siero? A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari 20 10
Metodi controllo lattoinnesti naturali-criticità Microrganismo Metodo Campo applicazione S. thermophilus ISO 7889- IDF 117: 2003 Colture miste S. thermophilus - lattococchi ISO 27205 - IDF 149:2003 Terreno Yogurt M17 agar, aerobiosi a 37 C per 48 ore Colture starter termofile S.thermophilus : M17 ph6,8 45 C aerobiosi 48 h Risultati molto variabili in funzione di: Brand commerciale terreno Modalità di aggiunta del lattosio Temperatura di incubazione Aggiunta di ulteriori ingredienti (latte peptonizzato) A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari 21 E i probiotici? Es latte fermentato contenente S. thermophilus, L.bulgaricus, L. acidophilus, Bifidobacterium lactis S. thermophilus ISO 7889-IDF 117: 2003 B. lactis ISO 29981- IDF 220: 2010 L. acidophilus ISO 20128-IDF 292: 2006 L. delbrueckii subsp. bulgaricus? ISO 7889-IDF 117: 2003 non consente conta differenziale L. bulgaricus-l. acidophilus Semina per spreading e differenziazione morfologia colonie? Conferma colonie mediante ISO 9232: 2003-IDF 146? Conferma mediante PCR? A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari 22 11
Conclusioni Sono disponibili diversi metodi per il conteggio di batteri lattici. Tuttavia, data la complessità di questo gruppo microbico e la presenza in uno stesso alimento di più generi/specie permangono delle criticità Adattamento del metodo in funzione del prodotto Necessità di confronti interlaboratori su matrici reali Sviluppo di metodi che consentano di individuare gruppi di batteri lattici con attività potenzialmente negative (es. proteolitici,, eterofermentanti obbligati)? A. Lombardi - Batteri lattici nei prodotti caseari 23 12