SCIENZE La Vita Lab16 Estraiamo il DNA Il DNA è, come hai studiato, una lunghissima molecola filamentosa. Quante volte hai sentito, al cinema o in televisione, di casi polizieschi brillantemente risolti grazie alle tracce di DNA ritrovate sul luogo del delitto? Nei film sembra tutto facile, ma l esistenza della molecola del DNA è rimasta nel mistero fino al 1951, quando la scienziata inglese Rosalind Franklin riuscì a fotografarla ai raggi X e ne comprese la struttura a doppia elica. Riesci a immaginare di poter maneggiare il DNA, isolandone le molecole sul tavolo della tua cucina? Come è possibile estrarre il DNA dal nucleo delle cellule? Se ti affascinano le nuove tecnologie che attraverso l analisi e la manipolazione del DNA risolvono i casi polizieschi, promettono di guarire malattie genetiche o di produrre grandi quantità di cibo, con questo laboratorio imparerai le tecniche fondamentali per estrarre il DNA dalle cellule. Potrà magari sembrarti strano, ma anche gli scienziati che lavorano in laboratori molto sofisticati ricorrono a tecniche del tutto simili a queste! Prima di iniziare Prima di tutto, però, pensa a che cosa sai già a proposito del DNA: che cos è? Qual è la sua funzione? Raccogli le idee e completa. Il DNA è una molecola lunghissima che si trova nel... di ciascuna..., animale o vegetale. Ciascuna molecola di DNA è costituita da un filamento avvolto a.... Il DNA è come una grande biblioteca in cui sono depositate tutte le........ necessarie per il funzionamento delle cellule. Durante la fase della riproduzione cellulare il DNA, associato a proteine costituisce la... Questa si addensa poi nei..., ciascuno composto da due cromatidi, che vengono distribuiti alle due cellule figlie originate dalla divisione cellulare. Il numero di cromosomi è caratteristico di ogni specie, ma, in seguito alla riproduzione sessuale, all interno di una specie ogni individuo ha combinazioni di DNA diverse. Il DNA non esce mai dal... della cellula: le informazioni che contiene hanno bisogno di un messaggero che è l... : esso permette che le informazioni contenute nel DNA vengano rese concrete nella cellula attraverso la costruzione delle... Per svolgere gli esperimenti che ti proponiamo, basta procurarsi una banana, un pomodoro e un po di fegato di pollo da cui estrarre il DNA. Poi occorrono un ananas, dell alcool per la preparazione dei liquori cioè dell etanolo al 95%, sale da cucina, detersivo per i piatti e poche altre attrezzature normalmente utilizzate in cucina. Attenzione: a questa concentrazione l etanolo è molto pericoloso. Lavora con estrema cautela, lontano da fiamme e scintille: bada a non inalarlo e tanto meno ingerirlo! 1
Lab16 Estraiamo il DNA Fare esperimenti LINK diagrammi di flusso 1 Estrazione del DNA da una banana L esperimento è suddiviso in tre fasi: 1) preparazione della soluzione per estrarre il DNA; 2) preparazione del campione da cui estrarre il DNA; 3) estrazione del DNA dal campione mediante la soluzione preparata. La prima operazione è quella di porre l etanolo nel freezer, dove deve rimanere almeno un ora; dunque, considerati i tempi dell esperimento, ti conviene metterlo al freddo circa mezz ora prima di cominciare l attività. Nel frattempo prepara l occorrente in modo da averlo sottomano quando servirà: sale da cucina; una bilancia digitale e un dosatore da cucina; qualche cucchiaino e una forchetta puliti e asciutti; un piattino o un tagliere; due bicchieri normali e uno lungo e stretto, da spumante, oppure una provetta; un insalatiera; un vasetto di vetro vuoto e pulito (va benissimo uno di quelli della marmellata); un colino a maglie molto sottili, oppure un imbuto che coprirai con della carta da filtro o con un filtro da caffettiera; detersivo per piatti; una banana e un ananas; un termostato oppure un pentolino per la cottura a bagnomaria; ghiaccio in cubetti; un pezzettino di filo di ferro piegato a uncino. Fase 1 Fase 2 Fase 3 Con la bilancia pesa 3 g di sale da cucina (cloruro di sodio, NaCl) che, come vedrai, equivalgono a un cucchiaino da tè. Versa il sale in un bicchiere poi, con un dosatore da cucina, aggiungi 10 ml di detersivo per i piatti e, successivamente, 90 ml di acqua. Mescola molto bene il tutto per sciogliere il sale: la soluzione di estrazione è pronta. Prendi circa 100 g di polpa di banana, schiacciala con una forchetta in un piattino (1) e trasferisci il tutto nel vasetto vuoto. Aggiungi la soluzione di estrazione alla poltiglia di banana (2) e metti il vasetto in un termostato a 60 C per 15 minuti. Se non hai a disposizione un termostato, puoi lavorare a bagnomaria (3) disponendo il vasetto nel pentolino che riempirai d acqua e riscaldando il tutto su un fornello elettrico o a gas: tieni sotto controllo la temperatura dell acqua riscaldata e fai il possibile per mantenerla costante a 60 C. 1 2 3 1 La banana ridotta in poltiglia: più la pappetta è omogenea, più accurata è stata la separazione delle cellule. 2 La soluzione di estrazione versata sulla poltiglia di banana schiacciata. 3 In mancanza di un termostato, la poltiglia con la soluzione estraente si può mantenere a circa 60 C con un procedimento a bagnomaria. 2
Scienze La Vita 5 4 6 4 Il raffreddamento della poltiglia con la soluzione estraente. 5 L operazione di filtrazione con un colino e della carta da filtro. 6 La progressiva concentrazione del DNA. In questa fase possono svilupparsi delle bollicine perché i gas disciolti nell etanolo molto freddo tendono a liberarsi a contatto con un ambiente a temperatura maggiore. Passati i 15 minuti, togli il vasetto dall acqua calda (attenzione a non scottarti) e immergilo subito nel ghiaccio in cubetti che avrai collocato nell insalatiera (4). Lascia il vasetto nel ghiaccio per 5 minuti e intanto prepara l occorrente per la filtrazione. Per filtrare puoi usare tanto un colino a maglie sottili nel quale avrai disposto della carta da filtro (5) o il filtro di una caffettiera. Intanto prepara del succo di ananas spremendo il frutto fresco. Basta raccoglierne 1 ml, quindi è sufficiente tagliuzzarne una o due fette su un piattino o in un bicchiere. Ora raccogli il filtrato in un bicchiere e versane 5 ml nella provetta oppure nel bicchiere da spumante lungo e stretto. Aggiungi il succo d ananas al filtrato e lascialo agire per cinque minuti. Poi fai colare lentamente lungo il bordo della provetta 6 ml di etanolo freddo; cerca di evitare che le due soluzioni si mescolino velocemente. Dopo un attimo dovrebbe comparire una massa gelatinosa (6) che, grazie alla sua struttura filamentosa, potrai facilmente avvolgere attorno al filo di ferro piegato a uncino. A che cosa servono, secondo te, tutte queste operazioni? Raccogli le idee e annota le tue ipotesi. 3
Lab16 Estraiamo il DNA 2 Estrazione del DNA da un pomodoro Dopo aver operato con la banana, vediamo che cosa accade adoperando un altro vegetale. Questo stesso procedimento infatti resta valido anche con pomodori, mele, bulbi di cipolla... Dalla mela e dalla cipolla è però più difficile ottenere una polpa omogenea e, nel caso della cipolla, c è poi l inconveniente della lacrimazione. È consigliabile quindi provare con un pomodoro, perché è facile disgregarne la polpa e separarne le cellule. Ripeti esattamente tutte le operazioni dell esperimento 1, sostituendo il pomodoro alla banana. Confronta i risultati degli esperimenti 1 e 2 e rifletti. Poi rispondi. Quali differenze hai riscontrato nei due casi? esperimento 1 esperimento 2.................. Che cosa puoi concludere? 3 Estrazione del DNA dal fegato di pollo Nei precedenti esperimenti hai lavorato con materiale vegetale, ma è possibile estrarre il DNA anche da cellule animali. Ora infatti proverai a estrarre il DNA dalle cellule del fegato di pollo, che puoi procurarti in macelleria o al supermercato. Anche in questo caso, l attività si può suddividere nelle tre fasi già sperimentate in precedenza. Le operazioni da compiere sono identiche a quelle dell esperimento 1, a eccezione della fase 2: preparazione del campione da cui estrarre il DNA. Ritaglia dal fegato che ti sei procurato un blocchetto di circa 2 cm di lato, riducilo in pezzetti più piccoli e, infine, sminuzzalo sul tagliere fino a ottenere una poltiglia (l ideale sarebbe utilizzare un mortaio e un pestello). Dopo aver trasferito la poltiglia nel vasetto di vetro, procedi come nella fase 3 dell esperimento 1. Confronta i risultati dei tre esperimenti. Rifletti e rispondi. Quali differenze hai riscontrato nei tre casi? esperimento 1 esperimento 2 esperimento 3............................................. 4
Le mie conclusioni Scrivi le tue conclusioni e poi confrontale con La spiegazione che ti proponiamo. 1. Per quale motivo, secondo te, è necessario svolgere azioni apparentemente incoerenti fra loro come frantumare per poi schiacciare, scaldare e subito dopo raffreddare il campione da cui intendiamo estrarre il DNA? 2. Che cosa hanno in comune, secondo te, le banane, le cipolle, i pomodori e il fegato di pollo? 3. A che cosa può servire, secondo te, sciogliere nell acqua il detersivo per piatti e il sale da cucina? 4. Perché occorre mantenere per qualche tempo la miscela di estrazione a 60 C? 5. Che cosa accade, secondo te, quando metti il campione a contatto con la soluzione estraente? 6. Perché, dopo il riscaldamento, occorre trasferire rapidamente l estratto dall acqua calda in cui si trova a un ambiente raffreddato addirittura col ghiaccio? 7. Perché poi filtrare l estratto? 8. Quale ruolo pensi svolgano, rispettivamente, il succo di ananas e l etanolo freddo? 9. Dove si è accumulato il DNA precipitato? Prova a ipotizzare il perché. 10. Pensi davvero di aver estratto dal nucleo solo la molecola del DNA? SÌ NO Quale altra sostanza potrebbe essere presente in ciò che hai separato?(pensa a quale sostanza ha alcune caratteristiche analoghe al DNA e serve a trasferire l informazione genetica dal nucleo al citoplasma della cellula). Scienze La Vita 5
Lab16 Estraiamo il DNA La spiegazione 1 Tutte le operazioni che hai svolto (schiaccia, scalda, raffredda ) servono a isolare il DNA dalle proteine alle quali è legato e a renderne evidente l ammasso molecolare, dato che una molecola di DNA, per quanto lunga, non può essere vista a occhio nudo. 2 Il DNA è contenuto nel nucleo delle cellule, quindi, per estrarlo, bisogna rompere le membrane cellulari e quelle nucleari. Le cellule vegetali, inoltre, sono rivestite da una rigida parete di cellulosa. Per rompere pareti e membrane occorre dapprima separare le cellule meccanicamente (ecco perché per prima cosa si schiaccia la banana o qualsiasi altro campione) e poi attaccare chimicamente le membrane attraverso la soluzione di estrazione. 3 Le membrane cellulari e nucleari e quelle degli altri organuli cellulari sono costituite principalmente da fosfolipidi, molecole grasse che possono essere attaccate dai normali detergenti usati in cucina. Il sale da cucina (NaCl), che si dissocia in particelle cariche positivamente (Na + ) e negativamente (Cl ), altera invece la struttura delle proteine presenti. 4 Mantenere per un certo tempo il materiale da cui si vuole estrarre il DNA ad alta temperatura (15 minuti a 60 C) serve a facilitare ulteriormente la rottura delle membrane. 5 Ora che hai rotto le cellule e i loro contenitori interni, gli organuli cellulari e tutte le molecole, comprese quelle degli enzimi, sono fuoruscite mescolandosi tra loro. Ma ciò comporta il rischio di provocare la rottura proprio di quelle molecole di DNA che vogliamo isolare: l alta temperatura serve anche a denaturare gli enzimi che all interno della cellula non sono normalmente a contatto con il DNA e che ora potrebbero spezzarne le molecole. 6 Risolto questo problema, se ne presenta subito un altro: in generale tutte le molecole delle cellule, comprese quelle di DNA, si degradano in presenza di elevate temperature. Ecco perché bisogna procedere subito al raffreddamento con il ghiaccio. 7AquestopuntoilDNAèpassato sì in soluzione, ma assieme a tante altre molecole: ricorda che abbiamo rotto le cellule. La successiva filtrazione serve proprio a separare i residui grossolani dal liquido che contiene anche, ma non solo, il DNA. 8 All interno del nucleo il DNA è associato a particolari proteine: dunque, se vogliamo ottenere solo il DNA, dobbiamo distruggerle e a questo scopo utilizziamo un altra proteina, la bromelina, estratta dall ananas fresco. Dopo pochi minuti essa libera il DNA dalle proteine indesiderate facendole letteralmente a pezzi (Lab 17). 9 A questo punto possiamo evidenziare il DNA, ormai libero in soluzione, sfruttando il fatto che è solubile in acqua (che non a caso costituisce la base fondamentale della soluzione di estrazione), ma insolubile in etanolo. L aggiunta di quest ultimo, infatti, fa sì che il DNA precipiti, cioè si addensi in una massa gelatinosa che può essere avvolta intorno al sottile filo di ferro. Comehaipotutonotare,ilDNAsiaccumulanelpuntodicontatto tra l estratto cellulare e l etanolo, la cui elevata densità, dovuta alla bassa temperatura, permette al DNA di galleggiare. 6
Scienze La Vita 10 In realtà non è possibile ottenere singole molecole di DNA. La massa gelatinosa che si è prodotta alla fine dell esperimento contiene decine di milioni di doppi filamenti di DNA, ma in essa sono presenti anche grandi quantità di RNA, l altro acido nucleico fondamentale affinché l informazione contenuta nel DNA si concretizzi nella costruzione delle proteine che fanno funzionare l organismo. Ora so che... Ora puoi non solo rispondere alle domande iniziali, dato che hai effettivamente maneggiato il DNA nella tua cucina, ma puoi anche darne una spiegazione. Completa. Gli esperimenti hanno dimostrato che vi è presenza del DNA sia nelle..., sia nelle.... Il DNA è effettivamente presente in tutti i tipi di cellule dei viventi, anche se in diversa quantità. La diversa consistenza dei materiali, a volte letteralmente rigonfi d acqua, può far sì che il numero di cellule effettivamente separate e rotte sia molto..., anche partendo da una stessa massa del campione. Le diverse colorazioni degli estratti ottenuti nei vari casi sono dovute al fatto che dalle cellule si estrae un po di tutto, comprese le molecole che... i tessuti, com è il caso del pomodoro. In effetti i biochimici, ossia gli scienziati che studiano la chimica delle cellule, hanno come primo grandeproblemaquellodi...accuratamentelediversemolecoleperimpedirechereagiscano fra loro in modo indesiderato. Negli esperimenti effettuati le operazioni di:...,...,... e... servono proprio a questo scopo. LINK bussola ompetenze Verifica delle competenze Verifica delle competenz 1 La competenza ricombinata Riordina numerando le istruzioni riferite alle operazioni necessarie per estrarre e isolare il DNA. aggiungere etanolo freddo raccogliere il filtrato in provetta raffreddare con il ghiaccio aggiungere il succo di ananas filtrare l estratto scaldare la miscela di estrazione a 60 C per 15 minuti aggiungere la soluzione estraente al campione da cui si vuole estrarre il DNA aggiungere il detersivo e il sale frantumare il campione fino a ottenere una poltiglia 7
Lab16 Estraiamo il DNA ompetenze Verifica delle competenze Verifica delle competen 2 Ora che hai ricombinato la successione delle istruzioni, disponile in ordine nella tabella e motiva, caso per caso, le ragioni della tua scelta. sequenza operazioni sperimentali ragioni della tua scelta 1......... 2......... 3......... 4......... 5......... 6......... 7......... 8......... 9...... 8... LINK Per saperne di più...